Summary
Analisi quantitativa del contenuto della cella all'interno del nervo sciatico murino è difficile a causa della scarsità del tessuto. Questo protocollo descrive un metodo per la digestione del tessuto e preparazione che fornisce cellule sufficienti per analisi di citometria a flusso delle popolazioni delle cellule immuni dai nervi dei topi individuali.
Abstract
Nervo-residente cellule immuni nel sistema nervoso periferico (PNS) sono essenziali per mantenere l'integrità di un neurone in un nervo sano. Le cellule immunitarie del PNS sono colpite da infortunio e malattia, che colpisce la funzione del nervo e la capacità di rigenerazione. Un neurone cellule immuni sono comunemente analizzate mediante immunofluorescenza (IF). Mentre se è essenziale per determinare la posizione delle cellule immunitarie nel nervo, se è solo semi-quantitativa e il metodo è limitato al numero di marcatori che possono essere analizzati contemporaneamente e il grado di espressione di superficie. In questo studio, citometria a flusso è stato utilizzato per l'analisi quantitativa di infiltrazione leucocitaria nei nervi sciatici o gangli di radice dorsale (DRG) di topi individuali. Singola cella analisi è stata eseguita utilizzando DAPI e diverse proteine sono stati analizzati simultaneamente per espressione intracellulare o superficie. Entrambi i nervi sciatico da un mouse che sono stati trattati secondo questo protocollo generato ≥ 30.000 singoli nucleate eventi. La proporzione dei leucociti nei nervi sciatico, determinati dall'espressione di CD45, era circa 5% del contenuto totale delle cellule del nervo sciatico e circa 5-10% in DRG. Questo protocollo si concentra principalmente sulla popolazione delle cellule immuni all'interno il PNS, la flessibilità della citometria a flusso per misurare simultaneamente un numero di marcatori significa che le altre popolazioni di cellule presenti all'interno del nervo, quali le cellule di Schwann, periciti , fibroblasti e cellule endoteliali, possono anche essere analizzate usando questo metodo. Questo metodo fornisce pertanto un nuovo mezzo per studiare gli effetti sistemici su PNS, quali neurotoxicology e modelli genetici di neuropatia o nelle malattie croniche, come il diabete.
Introduction
Le cellule immuni che immettere il PNS dalla circolazione, come definito dall'espressione di CD45 e CD11b, aiutano a mantenere l'integrità del nervo e gioca un ruolo sia nella degenerazione e rigenerazione1. I macrofagi (definiti dalla loro espressione di CD68 nel topo) possono essere sbilanciati verso un fenotipo infiammatorio, esprimendo più MHC classe II e CD86 sulla loro superficie (M1), o verso un fenotipo anti-infiammatorio, esprimendo più CD206 intracellulare (M2)2 . Inclinazione del fenotipo del macrofago è un processo dinamico regolato attraverso Akt segnalazione3, che riflette i diversi compiti di macrofagi nella difesa contro gli agenti patogeni (M1) e il ruolo nella rigenerazione tissutale (M2). Rigenerazione di un nervo danneggiato richiede innanzitutto la fagocitosi di residui del myelin dai macrofagi nel nervo4,5e anti-infiammatori (CD68+CD206+) M2 macrofagi sono stati indicati per promuovere la crescita assonale nella PNS6. Ridotto reclutamento o macrofagi a PNS, o alterata capacità di fagocitosi può provocare alterata rigenerazione e mantenimento dell'integrità del nervo. Macrofagi infiammatori di M1, che esprimono MHC di classe II, sono meno capaci di fagocitosi di macrofagi M2, e l'infiammazione di un neurone è implicata nella patogenesi di diverse malattie di neurodegenerative7.
I cambiamenti che si verificano per il sistema immunitario residente del nervo come conseguenza di danni possono essere quantitativi, che si manifesta nella perdita di CD45+ leucociti (o infiltrazione di CD45 è aumentato+ leucociti in causa infiammazione), o qualitativa, come cambiamento del fenotipo del macrofago da M2 a fenotipo M1. Le cellule immunitarie del PNS tradizionalmente sono state analizzate per mezzo di se, utilizzando le sezioni congelate o paraffina materiale8. Se è necessaria per determinare la localizzazione delle cellule di interesse. Tuttavia, quantificazione utilizzando se spesso si basa sul conteggio un relativamente piccolo numero di cellule in una sezione stretta del tessuto, rendendo la quantificazione inaffidabile e vulnerabile a bias di selezione. Per l'identificazione di specifici sottoinsiemi di cellule del sistema immunitario, la rilevazione simultanea di marcatori extracellulare o intracellulare è necessaria, mentre la determinazione del fenotipo del macrofago richiede almeno almeno due indicatori, in particolare CD206 e MHC Classe II. Come più comunemente microscopi disponibili sono limitati a canali almeno due colori, ad esempio isotiocianato di fluorescina (FITC) e ficoeritrina (PE), la caratterizzazione dei sottoinsiemi specifici di cellule immuni da IF può essere restrittiva e incompleti, che richiedono la necessità di avere più diapositive, derivato dalla stessa zona di interesse, che sono macchiati e analizzati in parallelo. Questo aspetto richiede molto tempo, pertanto non necessario si presta all'analisi di insiemi di grandi campioni. Inoltre, come la maggior parte degli indicatori di interesse sono extracellulare, la rilevazione nel tessuto, che è stato incorporato sia in paraffina o crioconservati, può essere problematica dovuto la rottura della integrità della membrana e il mascheramento degli epitopi, così come la perdita di gli antigeni di interesse dall'uso di solventi quali acetone e metanolo9.
Al contrario, il flusso cytometry, che misura ottica e caratteristiche di fluorescenza di singole cellule in sospensione che passano attraverso un fascio di luce, fornisce un mezzo più pratico e completo per l'analisi delle popolazioni cellulari. Citometria a flusso, piuttosto che produrre un'immagine digitale del tessuto, fornisce una quantificazione automatizzata dei parametri impostati, che includono la dimensione relativa e indice riflettente, indicato come il forward scatter (FSC), complessità granularità/interna di una cella o lato-scatter (SSC) e l'intensità di fluorescenza relativa, fornendo che la cella è stata etichettata con un fluoroforo appropriato, ad esempio un anticorpo coniugato. Un citometro a flusso tipico è costituito da due, Laser raffreddato ad aria; un laser ad argon produce luce blu a 488 nm e un laser elio-neon produce luce a 633 nm. Questa combinazione consente la rilevazione e misura, contemporaneamente, di almeno cinque obiettivi o sulla superficie o all'interno del compartimento intracellulare. Citometri a flusso più avanzate possono essere costituito da più laser, che consentono la rilevazione di fino a otto differenti fluorocromi contemporaneamente, fornendo che le lunghezze d'onda di picco delle emissioni dei fluorocromi selezionati non si sovrappongono in modo significativo.
Per l'analisi di citometria a flusso, il tessuto di interesse deve prima essere enzimaticamente digerito, generalmente con collagenasi, per generare una sospensione unicellulare. L'analisi dei nervi sciatico murini precedentemente è stata difficile a causa della piccola quantità di tessuto ottenuto da ogni mouse. Inoltre, l'alto contenuto di grassi del myelin intorno gli assoni ostacola il recupero delle cellule e produce grandi quantità di detriti. Il metodo descritto nel presente documento per la digestione e preparazione del nervo sciatico è stato adattato dal protocollo di isolamento delle cellule di Schwann di Barrette et al. 7e mira a isolare cellule abbastanza dai nervi dei topi individuali per l'analisi di citometria a flusso, al fine di ridurre le variazioni fra i topi. Utilizzando DAPI per l'identificazione delle singole cellule nel digest di tessuto grezzo elude la necessità di rimuovere i detriti dell'assone, che comunemente conduce a perdita delle cellule. Lavaggio più volte con un aids detergente ricco buffer nel rilascio di cellule intrappolate all'interno i residui grassi, aumentando così il rendimento. Digestione di entrambi i nervi sciatici full-length da un singolo mouse secondo questo protocollo genera ≥ 30, 000 singoli eventi nucleati e almeno 3 volte quel numero è stato Estratto da DRG. La proporzione di CD45+ leucociti era circa il 5% del contenuto totale di cellule nel nervo sciatico digest e circa 5-10% nel digest DRG. La maggior parte del CD45+ cellule nel nervo sciatico hanno espresso i marcatori del macrofago, CD68 e CD206.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Topi C57BL/6 wild-type (maschi; 10-12 settimane) erano tenuti in ciclo luce/buio h 12 standard e sono stati forniti accesso gratuito alla dieta normale e acqua. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità alle linee guida pertinenti del locale comitato di uso e cura degli animali e approvati dal comitato di uso e cura degli animali locali presso l'autorità regionale a Karlsruhe, in Germania (G216/10).
1. aspersione del Mouse
- Sacrificare il mouse (C57BL/6; Maschi; 10-12settimane) usando CO2 o conformemente alla legislazione vigente.
Nota: Retro-orbitale sanguinamento può essere eseguita per ottenere controllo leucociti, usando provette EDTA-rivestito 1,5 mL. Questo metodo di spurgo è efficiente solo immediatamente dopo il sacrificio. Cavità peritoneale, ulteriore lavaggio (PCL) può essere realizzato per ottenere controllo macrofagi, con PBS pre-riscaldata a 37 ° C per evitare freddo agglutinazione del sangue, che può ostacolare la perfusione. - Disinfettare il mouse spruzzando la pelliccia sull'addome liberalmente con etanolo 70% v/v e ripetutamente che pulisce con un fazzoletto con garza di cotone. Utilizzando le forbici smussate, tagliare aperto la pelle dell'addome da un'incisione longitudinale.
- Esporre la cavità pleurica facendo prima un'incisione nel diaframma utilizzando forbici curve, smussate e quindi di estendere l'incisione lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica. Fino a quando lo sterno può essere sollevato con attenzione via, fare un taglio simile sul lato controlaterale.
- Con una visione chiara del cuore e i vasi principali, Inserisci una farfalla 23¾ ago, collegato ad una siringa da 50 mL del manometro riempito con PBS ghiacciata, nella camera di sinistra del cuore.
- Fare un'incisione all'atrio destro del cuore utilizzando forbici iris per creare grande di uno sbocco possibile senza danneggiare l'aorta discendente e poi prema delicatamente la siringa per far passare circa 30 mL di PBS. L'essudato deve essere in esecuzione chiaro. Lo schiarimento del fegato e/o reni può essere utilizzato come un indicatore di una buona perfusione.
2. dissezione del nervo sciatico e DRG
Nota: Per la dissezione dei nervi sciatico, la pelle sopra il gluteo maximus viene rimosso e il mouse è posizionato sul lato ventrale giù mentre si estende agli arti inferiori.
- Bilateralmente sezionare l'intero nervo sciatico separando il tessuto muscolare dalla parte superiore della coscia dorsale e seguire il nervo lungo la colonna vertebrale. Tagliare il nervo dove esce dalla colonna vertebrale e subito sopra il ginocchio a altra estremità.
Nota: Evitare movimenti eccessivi del microfono del nervo come frantumazione o tirando con il forcipe. - Usando il forcipe, trasferire la nerve(s) asportato, circa 2 cm al nervo, per una provetta da 1,5 mL contenente 1 mL di PBS ghiacciata e archivio sul ghiaccio.
Nota: Il nervo può essere immagazzinato durante la notte sul ghiaccio.
Nota: Per la dissezione di DRG, utilizzando pinze e un bisturi, staccare la pelle dal sottostante tessuto molle staccando delicatamente la pelle restante posteriore per esporre le regioni cervicale, toraciche e lombare spinale. Rimuovere la testina di taglio alla base del cranio con una forbice smussato. - Tagliare le costole parallelo e vicino alla colonna vertebrale su entrambi i lati, prima di staccare i visceri collegato al lato anteriore della colonna vertebrale. Tagliare i femori e rimuovere la colonna vertebrale tramite una trasversale a livello dei femori. Utilizzando le forbici iris, tagliare qualsiasi muscolo, grasso e altri tessuti molli dalla spina dorsale.
- Posizionare la colonna vertebrale con il dorso rivolto verso l'alto e aprirlo, partendo dall'estremità caudale, facendo scivolare una punta delle forbici del canale vertebrale nella posizione 3 e l'osso è stato tagliato. Ripetere la procedura alla posizione 9.
Nota: È importante tagliare esattamente nel centro per evitare di danneggiare il DRG. - Ripetere il taglio da lato a lato fino a quando viene raggiunta la fine rostrale e il midollo spinale è completamente esposto. Utilizzando un microscopio di dissezione, rimuovere la colonna vertebrale per esporre i nervi del midollo spinale, che può essere utilizzati per individuare il DRGs all'interno della colonna vertebrale.
- Rimuovere il DRG lombare tirando delicatamente la radice dorsale per tirare il DRG nel canale vertebrale, poi ritaglio i nervi e tessuto connettivo con forbici iris per rimuovere il DRG.
Nota: È possibile limitare la raccolta al DRG L4-L6, che stanno contribuendo al nervo sciatico. - Utilizzando forcipe, trasferire il DRGs in una provetta di 1,5 mL contenente circa 1 mL di PBS ghiacciata e sul ghiaccio.
Nota: Il nervo può essere immagazzinato durante la notte sul ghiaccio.
3. la digestione dei DRG e del nervo sciatico
- Preparare il supporto di digestione (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, collagenosi 1,6 mg/mL tipo 4) completato con 100 µ g/mL di desossiribonucleasi e archivio sul ghiaccio.
Nota: La quantità di mezzo di digestione richiesto per topo (nervo sciatico + DRGs) è di 1 mL. Una volta preparato, aliquote dei media digestione possono essere conservate a-20 ° C. - Trasferire i nervi sciatici e DRG da un mouse in tubi separati 1.5 mL contenente 500 µ l di media di digestione. Per il nervo sciatico, tagliare il materiale in 15-20 pezzi utilizzando forbici di primavera e poi incubare le sospensioni di tessuto in un'agitazione incubatore a 37 ° C per 20 min con movimentazione delicata (≤ 450 giri/min).
- Ripetutamente triturare la sospensione cellulare attraverso la punta della pipetta 1.000 µ l per dissociare meccanicamente qualsiasi tessuto in modo incompleto digerita.
Nota: Se la sospensione è difficile da titolare, poi tagliare la punta della pipetta con le forbici per creare una punta smussata. Incubare la sospensione di tessuto a 37 ° C per 20 min con movimentazione delicata (≤ 450 giri/min). - Ripetere la triturazione attraverso una punta di pipetta 1.000 µ l e incubare per ulteriori 10 minuti a 37 ° C con agitazione delicata (≤ 450 giri/min).
- Preparare il tampone di FACS (PBS completati con 10% FCS e 1 mM EDTA) e memorizzare sul ghiaccio. Sciacquare e immergere un schermo di acciaio inossidabile con maglie di dimensioni 140 µm con buffer di FACS in 60 x 15 mm di Petri sul ghiaccio.
Nota: Filtri a schermo Nylon dovrebbero essere evitati come esso conduce ad una perdita significativa della resa di cellule nucleate. - Passare ripetutamente le sospensioni di tessuto attraverso il filtro di garza 140 µm, come è tenuto sopra la capsula di Petri, con forcipe smussato, sul ghiaccio. Raccogliere la sospensione cellulare da di Petri e trasferirlo in una nuova provetta da 1,5 mL conservata nel ghiaccio.
- Spingere qualsiasi tessuto in modo incompleto digerito che rimane sul filtro attraverso di triturazione ripetuti con un puntale di 1.000 µ l. Sciacquare il filtro dello schermo due volte con 500 µ l di tampone di FACS e raccogliere la sospensione cellulare risultante in di Petri da combinare con la sospensione cellulare dal punto 3.6.
Nota: Se il citometro a flusso utilizzato è sensibile ai detriti, la sospensione cellulare dal passaggio 3,7 può essere passata attraverso un filtro a schermo 70 µm; Tuttavia, questo può portare ad una perdita della resa di cellule nucleate. - Centrifugare le sospensioni delle cellule a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di FACS. Ripetere questo passaggio di lavaggio una volta.
- Risospendere il pellet cellulare in 150-350 µ l di tampone di FACS, dipendendo dal numero di macchiatura che sono (150 µ l FACS buffer richieste per pannello di colorazione).
4. colorazione del nervo sciatico e DRG con anticorpi fluorescente contrassegnati per citometria a flusso
- Trasferire 100 µ l del nervo sciatico o sospensione di cellule DRG in una forma di V bene in una piastra a 96 pozzetti sul ghiaccio.
Nota: Singolo-macchiato le cellule sono necessarie per tutti gli anticorpi utilizzati come vi forniranno i controlli necessari per la configurazione della citometria a flusso rispetto al fotomoltiplicatore (PMT) tubo tensione guadagni e compensazione, anche per aiutare a distinguere specifici da legame non specifico. A causa del limitato materiale disponibile dal nervo sciatico e DRGs, sangue leucociti e macrofagi da PCL (punti 1.1-1.2) possono essere usati come i controlli di singolo-macchiato, la macchiatura per cui deve essere eseguita in parallelo con la colorazione del nervo sciatico DRGs e del nervo. - Piscina le restanti cellule sospensioni (circa 50 µ l per campione) a campioni DRG, per servire come un controllo non macchia o il nervo sciatico.
- Centrifugare la piastra a 400 x g per 5 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante invertendo la piastra sopra un bidone e l'applicazione di un forte movimento del polso e picchiettare delicatamente asciutto su carta assorbente.
- Per la colorazione superficiale, ciascuno dei pellet cellulare risospendere in 20 µ l di tampone di FACS contenente gli anticorpi di interesse (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy 5.5 e MHC classe II-biotina) e incubare, al riparo dalla luce, il ghiaccio per 30 min.
Nota: (1) la diluizione di anticorpo ottimale deve essere determinato prima di utilizzare eseguendo una serie di diluizioni in base alle informazioni di prodotto del produttore; (2) aspecifico stainings può essere ridotto tramite incubazione con Fc-blocco in questa fase, secondo le istruzioni del produttore; e (3) isotipo controllo stainings non sono generalmente necessari quando usando gli anticorpi primari coniugati direttamente con un fluoroforo e/o quando il o gli antigeni di interesse producono popolazioni distinte. - Aggiungere 130 µ l di tampone di FACS in ciascun pozzetto e centrifugare la piastra a 400 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante come descritto in precedenza (punto 4.3) e lavare il pellet cellulare due volte con 150 µ l di tampone di FACS.
Nota: Se si utilizza un anticorpo primario non coniugato o un anticorpo primario coniugato alla biotina, un reattivo secondario appropriato, coniugato con un fluoroforo, può essere aggiunto a questo punto e vengono ripetuti i passaggi 4.4-4.5. Nel caso di questo protocollo, streptavidina-PE/Cy7 o streptavidina-PerCP sia usato per rilevare MHC classe II in combinazione con CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5, o in combinazione con CD68-APC e F4/80-PE/Cy7, rispettivamente. - Per il fissaggio, dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet cellulare in 100 µ l di paraformaldeide al 4% in PBS (pH 7.4). Incubare la piastra sul ghiaccio per 10 min e poi Centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante come descritto in precedenza (punto 4.3) e lavare il pellet cellulare una volta con 150 µ l di tampone di FACS.
Attenzione: Paraformaldeide è tossico; indossare una protezione appropriata come guanti e occhiali da vista, ecc.
Nota: Risospendere il pellet cellulare in 150 µ l di tampone di FACS e archivio protetto dalla luce, a 4° C fino a due giorni. Se nessuna colorazione intracellulare è necessaria, quindi procedere al passaggio 4,11 dopo centrifugazione la piastra a 400 x g per 5 min a 4 ° C. - Per la colorazione intracellulare, risospendere il pellet cellulare in 150 µ l di detergente buffer+0.5% FACS e incubare a temperatura ambiente, protetto dalla luce per 15 min. Centrifugare la piastra a 400 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante come descritto in precedenza (punto 4.3) e lavare il pellet cellulare una volta con 150 µ l di tampone di FACS + 0,5% detergente. Risospendere il pellet cellulare in 20 µ l di detergente buffer+0.5% FACS contenenti gli anticorpi di interesse (CD68-APC, CD206-PE) e incubare, al riparo dalla luce, a temperatura ambiente per 30 min.
- Aggiungere 130 µ l di detergente buffer+0.5% FACS in ciascun pozzetto e centrifugare la piastra a 400 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante come descritto in precedenza (punto 4.3) e lavare il pellet cellulare due volte con 150 µ l di tampone di FACS + 0,5% detergente.
Nota: Se si utilizza un anticorpo primario non coniugato o un anticorpo primario coniugato alla biotina, quindi un reattivo secondario appropriato, coniugato con un fluoroforo, può essere aggiunto a questo punto e ripetere i passaggi da 4.9-4.10. - Risospendere il pellet cellulare in 150 µ l di tampone di FACS + 0,5% detergente e store, protetto dalla luce, a 4 ° C fino a due giorni.
- Risospendere il pellet di cellule con 150 µ l di tampone di FACS + 0,5% detergente completati con 5 µ g/mL DAPI e incubare per 5 min a temperatura ambiente, protetto dalla luce. Centrifugare la piastra a 400 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante come descritto in precedenza (punto 4.3).
- Risospendere il pellet cellulare in 150 µ l di PBS e trasferirlo in una provetta di FACs adeguatamente etichettata. Conservare a temperatura ambiente, protetto dalla luce, fino a che pronto per l'analisi.
Nota: Dopo la risospensione in PBS, le cellule devono essere analizzate entro ore, poiché il DAPI dissocierà lentamente dal DNA, che conduce ad una perdita di segnale.
5. installazione di citometria a flusso e l'esecuzione di campioni
- Assicurarsi che il citometro a flusso è dotato con i laser appropriati e/o filtro imposta per misurare i fluorofori utilizzati per colorare le cellule. Questo può essere determinato sotto la configurazione del citometro predefinita sul sistema. Nel caso di questo protocollo, le cellule sono state analizzate utilizzando un citometro a flusso dotato di tre laser (405 nm, 488 nm e 633 nm) che consente per la rilevazione di ≤ 5 fluorofori.
- Selezionare i canali appropriati per il rilevamento di fluorofori di interesse. Tutti i segnali fluorescenti migliori vengono rilevati con amplificazione logaritmica.
- Selezionare una portata adeguata per i campioni. Questo parametro può variare in base al sistema utilizzato e deve essere determinato empiricamente. Nel caso di questo protocollo, una portata di MED-a-HI (35-60 µ l/min) è stata utilizzata per impedire l'intasamento dell'ago.
- Selezionare il numero totale di eventi/cellule per essere raccolti per campione. Il numero minimo di eventi dovrebbe essere 1.000.000.
- Creare grafici a dispersione sotto un foglio di lavoro globale della SSC-A contro FSC-A, nonché per ogni fluoroforo di interesse contro FCS-A. Creare una visualizzazione statistica che visualizzerà il numero di eventi e l'intensità di fluorescenza media (MFI) per fluorophores selezionato.
- Impostare la tensione dei canali FSC-A e SSC-A, tale che le cellule più piccole adattano il sinistro inferiore 10% della dispersione. Determinare la fluorescenza di fondo e fluorescenza campione minimo dai controlli non macchiati dal nervo sciatico o DRGs. determinare il cancello principale (P1) basa lo scatter plot della sola DAPI macchiatura controlli.
Nota: Questo non è un cancello di collezione, dovuto in parte, per la natura eterogenea della popolazione DAPI + nel PNS. - Utilizzando la dispersione FSC trame per ciascuno dei fluorophores di interesse, regolare le tensioni in modo che le celle del controllo non macchia rientrano nel quarto inferiore della loro grafici a dispersione rispettivi. Cancelli vengono quindi create sopra questa regione per definire quelle cellule che sono positivi per ciascuno dei rispettivi indicatori/fluorophores. Il posizionamento di un cancello è confermato mediante l'esecuzione del controllo single-macchiato (punto 4.1).
Nota: Compensazione per sovrapposizione di spettri di emissione può essere eseguita a questo punto o applicato retroattivamente con il software di analisi appropriato. - Una volta che il citometro a flusso è stato impostato, come descritto, gli esempi possono essere eseguiti.
- Dopo l'esecuzione, il materiale campione residuo può essere eliminato e i file FCS possono essere esportati per ulteriori analisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sospensioni di cellule dal full-length dei nervi sciatico e tutte le principali DRG sono state preparate, secondo il protocollo, da sei topi C57BL/6 sani e suddivisi in tre aliquote uguali per la colorazione. Contatore di colorazione con DAPI, che le macchie del DNA, consente il rilevamento di una popolazione di singola cellula (Figura 1A–B, pannello superiore). Lavando il DAPI, prima dell'analisi di citometria a flusso, è diminuito in misura l'intensità di fluorescenza dei detriti non nucleate, che consente la selezione di una popolazione discreta su FSC-asse di eventi single-nucleated o canottiere. Nessun gate di raccolta viene applicato come i Canottiere da PNS sono distribuite su una grande gamma di FSC e SSC (Figura 1). Il materiale sull'estremità alta dell'asse FSC, che contiene in modo incompleto digeriti del tessuto, deve essere esclusa nella selezione della popolazione singoletto (Figura 1A–B). Utilizzando una trama di densità (pannello inferiore) per visualizzare i risultati può facilitare l'esclusione dei grandi detriti (pannello inferiore). Un totale di 30.000 camiciole ≥ possa essere regolarmente ottenuto da due completo dei nervi sciatico e ≥ 200, 000 Canottiere possono essere ottenuti da DRGs (Figura 1). Dal nervo sciatico, circa il 5% di camiciole espresso CD45 sulla loro superficie, considerando che circa il 5-10% sono stati trovati in DRGs, quindi la definizione di queste cellule come leucociti di origine ematopoietica (Figura 2A).
Una maggioranza del CD45+ Canottiere anche espresso MHC di classe II, in maniera graduale (Figura 2B). In DRGs, CD11b può essere utilizzato per rilevare le cellule microgliali-come (CD45dim, MHCII+ e CD11b+) (Figura 2B, pannello superiore). Tuttavia, questa popolazione di microglia è assente dai nervi sciatico (Figura 2B, pannello inferiore). Una maggioranza di camiciole che esprimono CD45 nel PNS sono CD68+ macrofagi. Nel nervo sciatico e DRG, 2-5% dei Canottiere espresso CD68 (Figura 3A). Tutte le cellule che esprimono CD68 anche espresso CD45 (dati non mostrati). In DRGs, il CD68+ macrofagi erano più eterogenei nella loro espressione di entrambi MHC classe II e CD206, un indicatore per i macrofagi M2, rispetto al nervo sciatico (Figura 3B–D). Nel nervo sciatico, la maggior parte dei macrofagi co-espressi MHC classe II e CD206 (Figura 3B–D, pannelli inferiori); in genere, circa il 60-80% del CD68+ macrofagi espresso CD206, mentre una più piccola proporzione del CD68+ co-espressi CD206 in DRGs (Figura 3B). È interessante notare che, l'indicatore del macrofago M1 CD86 non ha generato alcun macchiatura positiva né sui macrofagi dal nervo né da PCL (dati non mostrati). L'indicatore del macrofago, F4/80, ha mostrato un'espressione eterogenea sia DRG e nel nervo sciatico (Figura 3B–C), colorazione una proporzione del CD68– e cellule MHCII– . Inoltre, espressione di F4/80 non completamente si sovrapponevano con l'espressione di CD68.
Figura 1: dati rappresentativi da analisi di citometria a flusso di DAPI-macchiato cellule da DRG e nervo sciatico nucleate. Tutti gli eventi raccolti, mostrato come scatterplot (pannello superiore) o densità di trame (pannello inferiore), nervo sciatico DRG (A) o (B) (SN) di un rappresentante del mouse. Frecce in pannelli inferiori indicano i cancelli, escluso il materiale nella parte superiore dell'asse di FCS. (C) retro-gating delle cellule raccolte nel DAPI-cancello (canottiere), mostrato nel pannello (A) il grafico a dispersione SSC vs FSC. (D) numero di Canottiere da SN e tutte le principali DRG da sei topi C57BL/6 sani. I dati rappresentano la media ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: flusso cytometry analisi di espressione di superficie di CD45, MHC di classe II e CD11b su Canottiere da DRG e del nervo sciatico. Eventi selezionati nel DAPI-cancello (canottiere) illustrato nella Figura 1 sono stati analizzati. (A) percentuale di camiciole che esprimono CD45 nel nervo sciatico (SN) e DRG da sei topi di controllo. (B) dispersione rappresentativa di Canottiere da DRG (pannello superiore) e SN (pannello inferiore). Le cellule che esprimono CD11b sono indicate con il colore blu. I dati rappresentano la media ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: flusso cytometry analisi di espressione di superficie di CD68, MHC di classe II e CD206 il Canottiere da DRG e del nervo sciatico. Eventi selezionati nel DAPI-cancello (canottiere) illustrato nella Figura 1 sono stati analizzati. (A) percentuale di camiciole che esprimono CD68 in nervo sciatico (SN) e DRG da sei topi C57BL/6 sani. (B) percentuale di CD68+ macrofagi cheesprimono CD206 SN e DRG da sei topi C57BL/6 sani. (C) tracciati a dispersione rappresentativa di Canottiere da DRG (pannello superiore) e SN (pannello inferiore) mostrano CD68 e MHC classe II espressione. (D) tracciati a dispersione rappresentativa di Canottiere da DRG (pannello superiore) e SN (pannello inferiore) mostrano espressione CD68 e CD206. Le cellule che esprimono F4/80 sono indicate con colore magenta. I dati rappresentano la media ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nervo sciatico contengono una grande percentuale di lipidi, come il colesterolo, a causa del contenuto di myelin intorno gli assoni. Poiché la proprietà dei lipidi cambia con la temperatura, è possibile ottenere risultati diversi a temperature diverse. Per garantire la conservazione delle cellule, tutti i punti in questo protocollo dopo la digestione sono stati effettuati su ghiaccio. Mentre la consistenza è consigliato per motivi di riproducibilità dei risultati, è possibile aumentare la resa attenendosi alla procedura 3.6 e 3.7 a temperatura ambiente. Se i nervi al punto 3.8 sufficientemente non sono stati digeriti, piccoli pezzi di nervo sarà visibile sulla mesh. In caso di digestione insufficiente, il materiale conservato sulla mesh può essere ri-digerito trasferendo ad una nuova provetta da 1,5 mL contenente 250 µ l di digestione media e ripetuti passaggi 3.2-3.6. Se il rendimento è poveri, quindi un campione della sospensione delle cellule, dopo passando attraverso il setaccio a maglie (punto 3.6) dovrebbe essere osservato sotto un microscopio chiaro con blu di trypan. Cellule vitali, non-blu, dovrebbero essere visibile insieme con strutture rod-like, che sono frammenti di assoni. Se nessun cellule vitali sono presenti, le condizioni di digestione e/o errata consegna del materiale ha causato la necrosi. Se solo grandi aggregati sono visibili, quindi si consiglia di raccogliere il materiale mediante centrifugazione e ripetere la digestione (passaggi 3.2-3.6).
Il metodo di analisi citometro a flusso di murini nervi sciatici e DRG è utile per le domande che coinvolgono tutto nervi e diversi DRGs. recentemente c'è stato un crescente interesse nell'analisi del PNS tramite flusso cytometry11,12 . Liu et al hanno sviluppato un metodo che utilizza la papaina e la dissociazione meccanica del nervo sciatico e DRGs utilizzando G 21 e 23 G in particolare analizzare appena 1 cm sezione del nervo, consentendo così l'analisi del materiale del nervo da siti specifici di lesioni11. Il metodo presentato qui è raccomandato per l'uso quando l'effetto sul PNS dovrebbe essere sistematica, come in neurotoxicology e modelli genetici di neuropatia o nelle malattie croniche, come il diabete. A causa del basso rendimento di cellule nucleate ottenuti dal nervo sciatico, non è consigliabile tentare di studiare eventi di piccole popolazioni con ≤ 100 recintate da un mouse individuo. Tuttavia, la messa in comune di materiale da molti topi faciliterebbe lo studio di tali piccole popolazioni all'interno del nervo. Tuttavia, sarebbe di interesse studiare se la dissociazione enzimatica del tessuto usando gli aghi di papaina e 21G/23G descritta da Liu et al. 11 potrebbe combinarsi con la citometria a flusso la macchiatura dei nuclei, come descritto in questo studio, per migliorare il rendimento delle singole cellule. La capacità di analizzare quantità molto piccole di tessuto è fondamentale per l'esecuzione di confronto tra ipsi - e controlaterale DRGs seguendo assotomia unilaterale del nervo sciatico. Tuttavia, questo è oltre lo scopo di questo studio. È interessante notare che, marcatori comunemente utilizzati per l'identificazione dei macrofagi sono stati trovati per avere un'espressione in modo imprevisto eterogenea nel PNS di topi. Per esempio, CD11b e F4/80 entrambe sono stati trovati per essere espresso su una grande percentuale di non-emopoietici, non-cellule del nervo sciatico sia DRGs presentanti l'antigene. Inoltre, nei nervi sciatico, CD68 non tutti i+ macrofagi espresso CD11b e F4/80, come sarebbe stato previsto dallo studio di altri organi. Si raccomanda pertanto che l'attenzione è presa quando usando questi indicatori per lo studio dei macrofagi nel PNS e che altri indicatori, quali CD163, dovrebbero essere studiati. Inoltre, la sensibilità dei diversi marcatori la dissociazione enzimatica anche dovrebbe essere stabilita come questo forse una spiegazione per le differenze osservata nell'espressione, come ad esempio con CD11b o F4/80.
Questo protocollo è stato utilizzato in precedenza per analizzare le cellule immunitarie nel PNS dopo tossico sfida con lo streptozotocin (STZ)13, una sostanza chimica comunemente usata per l'induzione del diabete in roditore organismi modello. È stato dimostrato che STZ, che attiva sia TRPV1 e TRPA1, inizialmente provoca una deplezione delle cellule immuni in nervo sciatico sia DRGs, pur non causando qualsiasi infiammazione nel nervo. Anche se i numeri di cellule immunitarie in DRGs recuperato, cellule del sistema immunitario e in particolare i macrofagi sono stati vuotati ancora significativamente tre settimane dopo sfida tossico. Successivamente è stato supposto che fagocitosi del macrofago di detriti del nervo, derivando dalla ferita di ipereccitabilità canale ionico possono condurre ad apoptosi dei macrofagi, con conseguente loro svuotamento dalla popolazione generale delle cellule. Non è noto come altre tossine del nervo periferico influenzano macrofagi residenti del nervo. Se lo svuotamento dei macrofagi è un risultato comune di tali agenti, ciò può avere implicazioni per il trattamento.
È stato trovato che soltanto 5-10% delle cellule nucleate dal nervo erano leucociti di origine ematopoietica. Le cellule rimanenti sono presumibilmente una miscela degli altri tipi di cellule nervose, vale a dire cellule di Schwann, cellule endoteliali, fibroblasti e periciti. Grazie alla capacità dei sistemi di citometria a flusso per misurare più parametri e fornendo che non ci sono marcatori specifici e/o anticorpi disponibili, è concepibile che questi tipi di cellule potrebbero anche essere analizzati usando questo metodo. Questo metodo è stato descritto per materiale murino. Tuttavia, con alcune modifiche, è stato utilizzato anche per l'analisi del materiale PNS da maiale e da umana. Si prevede che questo metodo sarà più utile per l'analisi del materiale da specie più grandi rispetto ai topi, in futuro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi per quanto riguarda questo studio.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SFB1118). Gli autori vorrei ringraziare Axel Erhardt per eseguire la maggior parte della dissezione e utilmente trasmettere questa conoscenza e Dr. Volker Eckstein per assistere sotto l'aspetto tecnico del citofluorimetro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve - tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
- DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neuroscience. 302, 174-203 (2014).
- Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C.
- Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
- Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
- Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
- Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
- Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies? Glia. 64, 475-486 (2016).
- Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
- Leong, T. Y. -M., Leong, A. S. -Y. How does antigen retrieval work? Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
- Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
- Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).
- Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).
