Analys av immunceller i enda höftnerver och dorsalrotsganglier Ganglion från ett enda musklick med hjälp av flödescytometri

Summary

Kvantitativ analys av cellinnehållet inom murina ischiasnerven är svårt på grund av bristen på vävnaden. Det här protokollet beskriver en metod för vävnad matsmältningen och förberedelse som ger tillräckligt med celler för flödescytometri Flödesanalys av immunceller populationer från nerver av enskilda möss.

Abstract

Nerv-resident immunceller i det perifera nervsystemet (PNS) är avgörande för att bibehålla neuronala integritet i en hälsosam nerv. Immuncellerna i PNS påverkas av skador och sjukdom, som drabbar den nerv-funktionen och förmåga till förnyelse. Neuronala immunceller analyseras vanligen genom immunofluorescens (om). Medan om är avgörande för fastställandet av lokalisering av immuncellerna i nerven, om är bara semikvantitativt och metoden är begränsad till antalet markörer som kan analyseras samtidigt och graden av ytan uttryck. I denna studie användes flödescytometri för kvantitativ analys av leukocytinfiltration i höftnerver eller dorsalrotsganglier ganglier (DRGs) av enskilda möss. Enstaka cell analys utfördes med hjälp av DAPI och flera proteiner analyserades samtidigt för antingen yta eller intracellulära uttryck. Båda höftnerver från en mus som behandlades enligt detta protokoll genereras ≥ 30 000 enstaka kärnförsedda händelser. Andelen av leukocyter i höftnerver, bestäms av uttryck för CD45, var cirka 5% av totala cellinnehållet i ischiasnerven och ca 5-10% i DRG. Även om detta protokoll fokuserar primärt på immunceller befolkningen inom PNS, innebär flexibiliteten i flödescytometri att mäta ett antal markörer samtidigt att de andra celler populationerna inom nerven, såsom Schwann celler, pericyter , fibroblaster och endotelceller, kan även analyseras med hjälp av denna metod. Denna metod ger därför ett nytt medel för att studera systemiska effekter på PNS, såsom neurotoxicology och genetiska modeller av neuropati eller kroniska sjukdomar, som diabetes.

Introduction

Immunceller som anger PNS från cirkulationen, bidra som definieras av uttrycket av CD45 och CD11b, till att upprätthålla integriteten av nerv och spelar en roll både i regeneration och degeneration¹. Makrofager (definieras av deras uttryck för CD68 i mus) kan vara sned mot en inflammatorisk fenotyp, uttrycker mer MHC klass II och CD86 på deras yta (M1), eller mot en antiinflammatorisk fenotyp, uttrycker mer intracellulära CD206 (M2)² . Skevning av makrofag fenotypen är en dynamisk process som regleras genom Akt signalering³, vilket återspeglar de olika uppgifterna av makrofager i försvaret mot patogener (M1) och roll i vävnadsregenerering (M2). Förnyelse av en skadad nerv först kräver fagocytos av myelin skräp av makrofager i nerv^4,5, och anti-inflammatorisk (CD68⁺CD206⁺) M2 makrofager har visat sig främja axon utväxt i den PNS⁶. Minskad rekrytering eller makrofager till PNS, eller försämrad kapacitet för fagocytos kan resultera i försämrad förnyelse och underhåll av nerv integritet. Inflammatoriska M1 makrofager, uttrycker MHC klass II, är mindre kapabla av fagocytos än M2 makrofager och neuronala inflammation är inblandade i patogenesen av flera neurodegenerativa sjukdomar⁷.

De förändringar som sker på nerv bosatt immunsystemet till följd av skada kan vara kvantitativa, manifesterar sig i förlusten av CD45⁺ leukocyter (eller ökad infiltration av CD45⁺ leukocyter i fall inflammation), eller kvalitativa, såsom ändra av makrofag fenotyp från M2 till M1 fenotyp. Immuncellerna i PNS har traditionellt analyserats med hjälp av IF, använder frysta sektioner eller paraffin-inbäddat material⁸. OM krävs för att bestämma localizationen av cellerna i intresse. Dock bygger kvantifiering med om ofta på räknar ett relativt litet antal celler i ett smalt avsnitt av vävnad, vilket gör kvantifiering opålitliga och sårbara för urval bias. För identifiering av enskilda undergrupper av immunceller krävs samtidiga detektion av extracellulära och intracellulära markörer, medan fastställande av makrofag fenotypen kräver minst minst två markörer, särskilt CD206 och MHC klass II. Som oftast tillgängliga Mikroskopen är begränsad till minst två-färg kanaler, såsom fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) och fykoerytrin (PE), kan karakterisering av specifika delmängder av immunceller med om restriktiva och ofullständig, som kräver behovet av att ha flera bilder, som härrör från samma område av intresse, som är målat och analyseras parallellt. Denna tidskrävande aspekt därför inte nödvändigt lämpar sig för analysen av stora provningssatser. Vidare, eftersom de flesta av markörerna av intresse är extracellulära, upptäckt i vävnad, som antingen har bäddats in i paraffin eller cryoconserved, kan vara problematiskt på grund av störningar av membran integritet och maskering av epitoper, samt förlust av antigenerna intresse från användningen av lösningsmedel, till exempel aceton och metanol⁹.

Däremot flödescytometri, som mäter optiska och fluorescens kännetecken för enstaka celler i suspension när de passerar genom en stråle av ljus, ger en mer praktisk och heltäckande sätt för analys av cellpopulationer. Flödescytometri, i stället för att producera en digital bild av vävnad, ger en automatiserad kvantifiering av parametrar, som inkluderar en cell relativa storlek och reflekterande index, kallad framåt scatter (FSC), granularitet/intern komplexitet eller sida-scatter (SSC) och relativa fluorescensintensiteten, som tillhandahåller att cellen har märkts med en lämplig fluorophore, såsom en konjugerad antikropp. En typisk flödescytometer består av två, luftkylda lasrar; en argon laser producerar blått ljus på 488 nm och en helium-neon laser producerar ljus på 633 nm. Denna kombination tillåter för detektering och mätning, samtidigt, med minst fem mål antingen på ytan eller inom intracellulära utrymmet. Mer avancerade flöde cytometers kan bestå av flera lasrar, som möjliggör upptäckt av upp till åtta olika fluorokromer samtidigt, ger att det peak utsläpp våglängder av de valda fluorokromer inte överlappar avsevärt.

För analys av flödescytometri, måste vävnaden av intresse först enzymatiskt smältas, allmänt med kollagenas, att generera en encellig suspension. Analysen av murina höftnerver har tidigare varit svårt på grund av den lilla mängden vävnad som erhålls från varje mus. Dessutom den höga fetthalten i myelin runt axoner hämmar cellen återhämtning och producerar stora mängder skräp. Den metod som beskrivs häri för ischiasnerven förberedelser och matsmältningen anpassades från protokollet Schwann cell isolering av hårspänne o.a. ⁷, och syftar till att isolera tillräckligt med celler från nerver av enskilda möss för flödescytometri Flödesanalys, för att minska variationen mellan möss. Med hjälp av DAPI för identifiering av enskilda celler i raw vävnad digest kringgår behovet av att undanröja axon skräp, vilket vanligen leder till cellförlust. Tvätta flera gånger med en tvättmedel-rika buffert aids i lanseringen av celler instängd i feta skräp, därmed öka avkastningen. Rötning av både fullängds höftnerver från en enda mus enligt detta protokoll genererar ≥30, 000 enstaka kärnförsedda händelser och minst 3 gånger numret var Hämtad från DRG. Andelen CD45⁺ leukocyter var cirka 5% av totala cellinnehållet i ischiasnerven digest och cirka 5-10% i DRG digest. Majoriteten av CD45⁺ celler i ischiasnerven uttryckt makrofag markörer, CD68 och CD206.

Protocol

Vildtyp C57BL/6 möss (hanar; 10-12 veckor) hölls i standard 12 h ljus/mörk cykel och lämnades fri tillgång till standard chow kost och vatten. Alla djurförsök utfördes i enlighet med tillämpliga riktlinjer av lokala djur vård och användning kommittén och godkänts av den lokala djur vård och användning kommittén vid den regionala myndigheten i Karlsruhe, Tyskland (G216/10).

1. perfusion av musen

1. Offra musen (C57BL/6; Män; 10-12 veckor) med hjälp av CO₂ eller enligt lokala föreskrifter.
   Obs: Retro-orbital blödning kan utföras för att erhålla kontroll leukocyter, med EDTA-belagd 1,5 mL rör. Denna metod för blödning är endast effektiv omedelbart efter offret. Ytterligare, peritoneal hålighet lavage (PCL) kan utföras för att erhålla kontroll makrofager, med förvärmd PBS vid 37 ° C för att undvika kalla agglutination av blodet, vilket kan hindra perfusion.
2. Desinficera musen genom sprutning päls på buken frikostigt med 70% v/v etanol och torka flera gånger med en vävnad med bomull gasväv. Med trubbig sax, skar upp magen huden genom ett längsgående snitt.
3. Exponera pleural hålighet av första att göra ett snitt i mellangärdet med böjda, trubbiga sax och sedan utvidga snitt längs hela längden av bröstkorgen. Göra ett liknande snitt på den kontralaterala sidan tills bröstbenet kan lyftas noggrant bort.
4. Med en tydlig bild av hjärtat och de stora kärlen, infoga en fjäril 23¾ gauge nål, ansluten till en 50 mL spruta fylld med iskall PBS, i vänster kammare i hjärtat.
5. Gör ett snitt till höger förmak av hjärtat med iris sax för att skapa så stor av ett utlopp som möjligt utan att skada fallande aorta, och sedan försiktigt trycka ned sprutan att driva igenom cirka 30 mL PBS. Exsudat ska köras klart. Clearing av levern eller njurarna kan användas som en indikator på en bra genomblödning.

2. dissektion av ischiasnerven och DRG

Obs: För dissektion av höftnerver, huden ovan den gluteus maximus avlägsnas och musen är placerad ventrala sida ner samtidigt sträcker ut de nedre extremiteterna.

1. Bilateralt dissekera hela höftnerver genom att separera muskelvävnad från övre dorsala låret och följ nerven längs ryggraden. Skär nerven där det matas ut från ryggraden och omedelbart ovanför knät i andra änden.
   Obs: Undvik överdriven hantering av nerv såsom krossning eller dra med tång.
2. Använda pincett, överföra den exciderad nerve(s), ca 2 cm per nerv, i en 1,5 mL rör innehållande 1 mL iskallt PBS och store på is.
   Obs: Nerven kan lagras över natten på is.
   Obs: För DRG dissektion, med hjälp av tång och en skalpell, lossa huden från underliggande mjukdelar genom att försiktigt dra bort återstående tillbaka huden att exponera bröstkorg, cervikal och lumbal spinal regionerna. Ta bort huvudet genom att skära vid basen av skallen med en slö sax.
3. Skär revbenen parallellt med och nära ryggraden på båda sidor, innan du lossar inälvor ansluten till den främre sidan av ryggraden. Skär lårbenet och ta bort ryggraden med ett tvärsnitt på nivån för lårbenet. Med iris sax, klippa bort alla muskler, fett och andra mjuka vävnader från ryggraden.
4. Placera ryggrads-kolonnen med ryggsidan uppåt och öppna den, börjar i kaudala slutet, av glidande ett tips av saxen i ryggradskanalen klockan de tre position och benet klippt. Upprepa proceduren vid niotiden position.
   Obs: Det är viktigt att skära exakt i mitten för att undvika att skada DRG.
5. Upprepa skära från sida till sida tills rostralt slutet nås och ryggmärgen är helt exponerad. Med dissektion Mikroskop avlägsna ryggmärgen för att exponera spinal nerver, som kan användas för att lokalisera DRGs inom ryggraden.
6. Ta bort de lumbala DRGs genom att försiktigt rycka i dorsala roten att dra DRG i ryggraden avlägsnas kanalerna, sedan klippning nerver och bindväv med iris sax för att ta bort DRGs.
   Obs: Det är möjligt att begränsa samlingen till de L4-L6 DRG, som bidrar till ischiasnerven.
7. Med pincett, överföra DRGs till en 1,5 mL tub som innehåller cirka 1 mL iskallt PBS och lagra på is.
   Obs: Nerven kan lagras över natten på is.

3. nedbrytning av ischiasnerven och DRG

1. Förbered matsmältningen (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, 1,6 mg/mL kollagenas typ 4) kompletteras med 100 µg/mL deoxyribonuclease och store på is.
   Obs: Mängden matsmältningen medium krävs per mus (höftnerver + DRGs) är 1 mL. När förberett, kan alikvoter av matsmältningen media förvaras vid-20 ° C.
2. Överföra de höftnerver och DRGs från en mus i separata 1,5 mL rör som innehåller 500 µL av matsmältningen media. För höftnerver, hacka materialet i 15-20 bitar med våren sax och sedan Inkubera vävnad upphängningarna i en skakande inkubator vid 37 ° C i 20 min med mild agitation (≤ 450 rpm).
3. Upprepade gånger pulverisera cellsuspensionen genom 1000 µL pipettspetsen att mekaniskt separera någon ofullständigt smält vävnad.
   Obs: Om suspensionen är svårt att titrera, sedan skär pipettspetsen med sax för att skapa trubbiga änden. Inkubera suspensionen vävnad vid 37 ° C i 20 min med mild agitation (≤ 450 rpm).
4. Upprepa triturationen genom en 1000 µL pipettspetsen och inkubera i ytterligare 10 minuter vid 37 ° C med mild agitation (≤ 450 rpm).
5. Förbereda FACS bufferten (PBS kompletteras med 10% FCS och 1 mM EDTA) och lagra på is. Skölj och Blötlägg en rostfritt stål skärm med en maskstorlek på 140 µm med FACS buffert i 60 x 15 mm petriskål på is.
   Obs: Nylon skärm filter bör undvikas eftersom det leder till en betydande förlust i avkastningen av kärnförsedda celler.
6. Upprepade gånger passera vävnad upphängningarna genom filtret 140 µm skärmen som den hålls över petriskål, med trubbig pincett, på is. Samla cellsuspensionen från petriskål och överföra den till en ny 1,5 mL tub lagras på is.
7. Skjut alla ofullständigt smält vävnad som finns kvar på filtret genom av upprepade trituration med en 1000 µL pipettspetsen. Skölj filtret skärmen två gånger med 500 µL av FACS buffert och samla resulterande cellsuspensionen i petriskål att kombinera med cellsuspensionen från steg 3.6.
   Obs: Om den flödescytometer som används är känsliga för skräp, cellsuspensionen från steg 3,7 kan skickas genom ett 70 µm skärm filter; Detta kan dock leda till en förlust i avkastningen av kärnförsedda celler.
8. Centrifugera cellsuspensioner vid 300 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 mL FACS buffert. Upprepa detta tvätt en gång.
9. Återsuspendera cellpelleten i 150-350 µL av FACS buffert, beroende på antalet färgning som krävs (150 µL FACS buffert per färgning panel).

4. färgning av ischiasnerven och DRG med Fluorescently märkta antikroppar för flödescytometri

1. Över 100 µL av ischiasnerven eller DRG cellsuspension till en V-formad väl i en plattan med 96 brunnar på is.
   Obs: Singel-färgade celler är nödvändiga för alla antikroppar används som de kommer att ge de nödvändiga kontrollerna för att ställa in den flödescytometri med avseende på fotomultiplikatorn röret (PMT) spänning vinster och ersättning, samt att hjälpa skilja specifika från icke-specifik bindning. På grund av den begränsa materialet tillgängligt från ischiasnerven och DRGs, blod leukocyter och makrofager från PCL (steg 1.1-1.2) kan användas som singel-färgade kontroller, färgningen för som bör utföras parallellt med färgningen av den ischiasnerven nerv- och DRGs.
2. Pool resterande celler suspensioner (ca 50 µL per prov) från höftnerver eller DRG prover, att fungera som en ofärgade kontroll.
3. Centrifugera plattan vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten genom invertering plattan över en lagerplats och tillämpa en kraftig snärt med handleden och knacka försiktigt torka på hushållspapper.
4. För surface färgning, Återsuspendera varje cell pellets i 20 µL av FACS buffert innehållande antikroppar av intresse (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 och MHC klass II-Biotin) och inkubera, skyddas från ljus, på is i 30 min.
   Obs: (1) optimal antikropp utspädning ska vara beslutsam före användning genom att utföra en utspädning serie enligt tillverkarens produktinformation; (2) icke-specifika infärgning kan minskas genom inkubation med Fc-block i detta steg, enligt tillverkarens anvisningar; och (3) isotypen kontroll infärgning är i allmänhet inte krävs när du använder primära antikroppar direkt konjugerat med en fluorophore eller när antigenfrekvensen av intresse producerar distinkta populationer.
5. Tillsätt 130 µL FACS buffert i varje brunn och centrifugera plattan vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kasta bort vätskefasen som tidigare beskrivits (steg 4.3) och tvätta cell pellets två gånger med 150 µL FACS buffert.
   Obs: Om du använder en okonjugerat primär antikropp eller en primär antikropp konjugerat med biotin, sedan ett lämpligt sekundära reagens, konjugerat till en fluorophore, kan läggas på denna punkt och steg 4.4-4.5 upprepas. När det gäller detta protokoll användes streptividin-PE/Cy7 eller streptividin-PerCP att upptäcka MHC klass II i kombination med CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5, eller i kombination med CD68-APC och F4/80-PE/Cy7, respektive.
6. För fixering, efter det sista steget-tvätt Återsuspendera cell pellets i 100 µL av 4% PARAFORMALDEHYD i PBS (pH 7,4). Inkubera plattan på is i 10 min och sedan Centrifugera 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kasta bort vätskefasen som tidigare beskrivits (steg 4.3) och tvätta cell pellets en gång med 150 µL FACS buffert.
   Varning: PARAFORMALDEHYD är giftiga; bär lämpligt skydd såsom handskar och glasögon, etc.
   Obs: Återsuspendera cell pellets i 150 µL av FACS buffert och store skyddas från ljus, vid 4° C i upp till två dagar. Krävs inga intracellulära färgning, Fortsätt sedan till steg 4.11 efter centrifugering plattan vid 400 x g i 5 minuter vid 4 ° C.
7. Intracellulära färgning, Återsuspendera cell pellets i 150 µL av FACS buffer+0.5% tvättmedel och inkubera vid rumstemperatur, skyddas från ljus för 15 min. Centrifugera plattan vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kasta bort vätskefasen som tidigare beskrivits (steg 4.3) och tvätta cellpelleten och en gång med 150 µL av FACS buffert + 0,5% tvättmedel. Återsuspendera cellpelleten i 20 µL av FACS buffer+0.5% tvättmedel innehållande antikroppar av intresse (CD68-APC, CD206-PE) och inkubera, skyddas från ljus, i rumstemperatur i 30 min.
8. Tillsätt 130 µL FACS buffer+0.5% tvättmedel i varje brunn och centrifugera plattan vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kasta bort vätskefasen som tidigare beskrivits (steg 4.3) och tvätta cell pellets två gånger med 150 µL av FACS buffert + 0,5% tvättmedel.
   Obs: Om du använder en okonjugerat primär antikropp eller en primär antikropp konjugerat med biotin, sedan ett lämpligt sekundära reagens, konjugerat till en fluorophore, kan läggas på denna punkt och steg 4,9-4.10 upprepas.
9. Återsuspendera cell pellets i 150 µL FACS buffert + 0,5% tvättmedel och store, skyddas från ljus, vid 4 ° C i upp till två dagar.
10. Omsuspendera cell pellets med 150 µL FACS buffert + 0,5% tvättmedel kompletteras med 5 µg/mL DAPI och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur, skyddas från ljus. Centrifugera plattan vid 400 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Kassera supernatanten som tidigare beskrivits (steg 4,3).
11. Återsuspendera cell pellets i 150 µL av PBS och överföring till ett lämpligt märkta FACs-röret. Förvara i rumstemperatur, skyddas från ljus, tills den för analys.
    Obs: Efter resuspension i PBS, cellerna bör analyseras inom timmar, eftersom DAPI kommer långsamt ta avstånd från DNA, vilket leder till en förlust i signalen.

5. inställning av flödescytometri och driften av prover

1. Se till att flödescytometer är utrustad med lämpliga lasrar och/eller filtret anger för att mäta den fluorophores som används för att färga cellerna. Detta kan bestämmas enligt cytometer standardkonfigurationen på systemet. När det gäller detta protokoll, celler analyserades med hjälp av en flödescytometer utrustad med tre lasrar (405 nm, 488 nm och 633 nm) möjliggör upptäckt av ≤ 5 fluorophores.
2. Välj lämpliga kanaler för detektion av fluorophores av intresse. Alla fluorescerande signaler upptäcks bäst med logaritmisk förstärkning.
3. Välj en lämplig flöde för prover. Denna parameter kan variera beroende på det system som används och bör bestämmas empiriskt. När det gäller detta protokoll användes en flödeshastighet av MED-till-HI (35-60 µL/min) för att förhindra igensättning av nålen.
4. Välj det totala antalet händelser och celler som skall samlas in per prov. Det minsta antalet händelser bör 1.000.000.
5. Skapa spridningsdiagram under en global kalkylblad av SSC-A kontra FSC-A, samt för varje fluorophore sevärdheter kontra FCS-A. Skapa en statistisk vy som visar antalet händelser och genomsnittlig fluorescerande intensiteten (MFI) för den valda fluorophores.
6. Ställ in spänningen av FSC-A och SSC-kanalerna, så att minsta cellerna passar in i de nedersta vänstra 10% av spridningsdiagrammet. Bestäm den bakgrunden fluorescens och provets minimiantal fluorescens från ofärgade kontrollerna från höftnerver eller DRGs. Bestäm förälder (P1) porten utifrån scatter plot från endast DAPI färgning kontroller.
   Obs: Detta är inte en samling grind, vederbörlig delvis till heterogena beskaffenhet DAPI + befolkningen i PNS.
7. Använda FSC scatter tomter för var och en av fluorophores av intresse, justera spänningar så att cellerna i ofärgade kontroll omfattas av det lägre kvartalet av deras respektive spridningsdiagram. Gates skapas sedan ovanför denna region att definiera de celler som är positiva för var och en av de respektive markörer/fluorophores. Placeringen av en grind bekräftas av driften av kontrollen singel-färgade (steg 4.1).
   Obs: Ersättning för överlappande utsläpp spectra kan utföras vid denna punkt eller tillämpas retroaktivt med lämplig analys programvara.
8. När flödescytometer har satts upp, enligt beskrivningen, kan proverna köras.
9. Efter körningen, det återstående provmaterialet kan kasseras och FCS filer kan exporteras för vidare analys.

Representative Results

Cellsuspensioner från både fullängds höftnerver och alla större DRG var beredd, enligt protokollet, från sex friska C57BL/6 möss och uppdelad i tre lika alikvoter för färgning. Counter färgning med DAPI, som fläckar DNA, möjliggör upptäckt av en enda cell befolkningen (figur 1A–B, övre panelen). Skölja DAPI, före analys av flödescytometri, minskade till en utsträckning fluorescerande intensiteten av icke-nucleated skräp, som möjliggör val av en diskret befolkning över FSC-axel singel-nucleated händelser eller undertröjor. Ingen samling gate tillämpas som linnen från PNS är fördelade på ett stort utbud av FSC och SSC (figur 1 c). Materialet på hög slutet av FSC axeln, som innehåller ofullständigt smält vävnad, måste uteslutas i valet av singlet befolkningen (figur 1A–B). Med en densitet tomt (nedre panelen) för att visa resultaten kan underlätta i uteslutandet av stora skräp (nedre panelen). Totalt ≥ 30 000 undertröjor regelbundet kan erhållas från två full höftnerver och ≥200, 000 undertröjor kan erhållas från DRGs (figur 1 d). Från höftnerver uttryckte cirka 5% av undertröjor CD45 på deras yta, medan ca 5-10% hittades i DRGs, därmed definiera dessa celler som leukocyter av hematopoetiska ursprung (figur 2A).

En majoritet av CD45⁺ undertröjor uttryckte också MHC klass II, i en stegvis sätt (figur 2B). I DRGs, CD11b kan användas för att upptäcka försök-liknande celler (CD45^dim, MHCII⁺ och CD11b⁺) (figur 2B, övre panelen). Men denna mikroglia population är frånvarande från höftnerver (figur 2B, nedre panelen). En majoritet av de undertröjor uttrycker CD45 i PNS är CD68⁺ makrofager. I ischiasnerven och DRG, 2-5% av undertröjor uttryckt CD68 (figur 3A). Alla celler som uttrycker CD68 också uttryckt CD45 (inga data anges). I DRGs, CD68⁺ makrofager var mer heterogena i deras uttryck för både MHC klass II och CD206, en markör för M2 makrofager, än i höftnerver (figur 3B–D). I höftnerver, de flesta makrofager tillsammans uttryckt MHC klass II och CD206 (figur 3B–D, lägre paneler); normalt ca 60-80% av CD68⁺ makrofager uttryckte CD206, medan en mindre andel av CD68⁺ Co uttryckt CD206 i DRGs (figur 3B). Intressant, genererat M1 makrofag markören CD86 inte någon positiv färgning varken på makrofager från nerv nor från PCL (inga data anges). Makrofag markören, F4/80, som visade en heterogen uttryck såväl i DRG höftnerver (figur 3B–C), färgning en andel av CD68^– och MHCII^– celler. Dessutom F4/80 uttryck inte fullt överlappar med uttrycket CD68.

Figur 1: representativa uppgifter från flödescytometri Flödesanalys av DAPI-färgade nucleated celler från DRG och ischiasnerven. Alla händelser samlas in, visas som scatterplots (övre panelen) eller densitet tomter (nedre panel), från (A) DRG eller (B) ischiasnerven (SN) av en representativ mus. Pilarna i nedre panelerna visar grindarna, exklusive materialet längst FCS axeln. (C) Back-gating celler samlas i DAPI-porten (undertröjor), visas i panelen (A) på SSC vs. FSC spridningsdiagram. (D) antalet undertröjor från både SN och alla större DRG från sex friska C57BL/6 möss. Uppgifterna representerar medelvärde ± SD. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 2: Flow flödescytometri analys av ytan uttryck för CD45, MHC klass II, och CD11b på Linnen från DRG och ischiasnerven. Händelser som markerats i DAPI-porten (undertröjor) visas i figur 1 var analyserade. (A) andel av de undertröjor uttrycka CD45 i ischiasnerven (SN) och DRG från sex kontroll möss. (B) representativa scatter tomter av undertröjor från DRG (övre panelen) och SN (nedre panelen). Celler som uttrycker CD11b indikeras med blå färg. Uppgifterna representerar medelvärde ± SD. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figur 3: Flow flödescytometri analys av ytan uttryck för CD68, MHC klass II, och CD206 på Linnen från DRG och ischiasnerven. Händelser som markerats i DAPI-porten (undertröjor) visas i figur 1 var analyserade. (A) andelen de undertröjor uttrycker CD68 i ischiasnerven (SN) och DRGs från sex friska C57BL/6 möss. (B) andel av CD68⁺ makrofager tillsammans uttrycker CD206 i SN och DRG från sex friska C57BL/6 möss. (C) representativa spridningsdiagram av undertröjor från DRG (övre panelen) och SN (nedre panelen) visar CD68 och MHC klass II uttryck. (D) representativa spridningsdiagram av undertröjor från DRG (övre panelen) och SN (nedre panelen) visar CD68 och CD206 uttryck. Celler som uttrycker F4/80 indikeras med magenta färg. Uppgifterna representerar medelvärde ± SD. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

Höftnerver innehåller en stor andel av lipider, såsom kolesterol, p.g.a. innehållet av myelin runt axoner. Eftersom egenskaperna för lipider ändras med temperatur, kan olika resultat erhållas vid olika temperaturer. För att säkerställa cell bevarande, utfördes alla steg i detta protokoll efter matsmältningen på is. Samtidigt konsistens rekommenderas för skull reproducerbarheten för resultaten, kan det vara möjligt att öka avkastningen genom att utföra steg 3.6 och 3.7 i rumstemperatur. Om nerverna vid steg 3.8 inte har varit tillräckligt smält, blir små bitar av nerv synligt på mesh. Vid otillräcklig matsmältningen, kan det material som samlats på mesh smältas åter genom att överföra till en ny 1,5 mL tub som innehåller 250 µL av matsmältningen media och upprepande steg 3,2-3,6. Om avkastningen är fattiga, då ett prov av cellsuspensionen, efter passerar genom mesh skärmen (steg 3.6) bör ses i ett ljusmikroskop med trypan blå. Livskraftig, icke-blå, celler ska synas tillsammans med rod-liknande strukturer som är fragment av axoner. Om ingen viabla celler är närvarande, har då den matsmältningen villkor och/eller felaktiga inlämning av materialet orsakat nekros. Om bara stora aggregat är synliga, är det rekommenderat att samla materialet genom centrifugering och upprepa matsmältningen (steg 3,2-3,6).

Analysmetoden flöde cytometer murina höftnerver och DRGs är användbar för frågor som rör hela nerver och flera DRGs. nyligen har skett ett ökat intresse för analysen av PNS använder flow flödescytometri^11,12 . LiU et al. har utvecklat en metod med papain och mekaniska dissociation av höftnerver och DRGs med 21 G och 23 G att särskilt analysera så lite som 1 cm avsnitt av nerven, vilket gör det möjligt för analys av nerv material från specifika webbplatser av skada¹¹. Metoden presenteras här rekommenderas för användning när effekten på PNS förväntas vara systemisk, som i neurotoxicology och genetiska modeller av neuropati eller kroniska sjukdomar, som diabetes. På grund av den låga avkastningen av kärnförsedda celler från ischiasnerven, är det inte rekommenderat att försöka studera små populationer med ≤ 100 gated händelser från en individuell mus. Dock skulle poolning av material från flera möss underlätta studiet av dessa små populationer inom nerven. Det skulle dock vara av intresse att undersöka huruvida enzymatisk vävnad dissociation med papain och 21G / 23G strumpst beskrivs av Liu et al. ¹¹ kunde kombineras med flöde flödescytometri färgningen av atomkärnor, som beskrivs i denna studie, att förbättra avkastningen av enstaka celler. Förmågan att analysera mycket små mängder av vävnad är avgörande för att utföra jämförelse mellan ipsi- och kontralaterala DRGs efter ensidiga ischiasnerven axotomy. Detta är dock utanför ramen för denna studie. Intressant, befanns vanligen använda markörer för identifiering av makrofager ha ett oväntat heterogena uttryck i PNS av möss. Till exempel befanns CD11b och F4/80 båda uttryckas på en stor andel av icke-hematopoetiska, icke-antigen presenterande celler i både ischiasnerven och DRGs. Dessutom i höftnerver, inte alla CD68⁺ makrofager uttryckt CD11b och F4/80, som skulle ha kunnat förväntas från studier av andra organ. Det rekommenderas därför att försiktighet vidtas när du använder dessa markörer för studiet av makrofager i PNS och att andra markörer, såsom CD163, bör utredas. Känsligheten hos de olika markörerna att enzymatisk dissociation bör dessutom även fastställas i detta kanske en förklaring till skillnaderna som observerats i uttryck, såsom med CD11b eller F4/80.

Detta protokoll har tidigare använts för att analysera immuncellerna i PNS efter giftiga utmaning med streptozotocin (STZ)¹³, en kemikalie som vanligen används för induktion av diabetes hos gnagare modellorganismer. Det visades att STZ, som aktiverar både TRPV1 och TRPA1, initialt orsakar en utarmning av immunceller i både ischiasnerven och DRGs, samtidigt som de inte orsakar någon inflammation i nerven. Även om antalet immunceller i de DRGs som återvinns, immunceller och särskilt makrofager tömdes fortfarande betydligt efter tre veckor giftiga utmaning. Det antogs därefter att makrofag fagocytos av nerv skräp, följd av skada av ion kanal hyperexcitabilitet kan ha lett till apoptos av makrofager, vilket resulterar i deras utarmning från befolkningens allmänna cell. Det är inte känt hur andra perifera nerver gifter påverkar nerv bosatta makrofager. Om utarmning av makrofager är en vanlig följd av sådana agenser kan detta få konsekvenser för behandling.

Det konstaterades att endast 5-10% av kärnförsedda celler från nerven var leukocyter av hematopoetiska ursprung. Återstående cellerna är förmodligen en blandning av andra nervcell typer, nämligen Schwann celler, pericyter, fibroblaster och endotelceller. På grund av kapaciteten för flödescytometri är system att mäta flera parametrar och förutsatt att det specifika markörer eller antikroppar tillgängliga, det tänkbart att dessa celltyper också kunde analyseras med denna metod. Denna metod har beskrivits för murina material. Dock med vissa modifieringar, har det också använts för analys av PNS material från gris och människa. Det förväntas att denna metod kommer att vara mer användbar för analys av material från arter som är större än möss, i framtiden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 Mouse	Charles River	C57BL/6NCrl
DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate)	Thermo	31885023	The source of this material is not important
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Collagenase Type 4	Worthington Biochemical Corp., US	LS004188
Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I	Sigma-Aldrich	DN25-1g
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated	Sigma-Aldrich	F4135
Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5	Biolegend	101228	Clone M1/70
Antibody against MHC class II, biotinylated	Biolegend	107603	Clone M5/114.15.2
Antibody against CD45-A647	Biolegend	107603	Clone 30-F11
Antibody against CD68-APC	Biolegend	137007	Clone FA/11
Antibody against CD206-PE	Biolegend	141706	Clone C068C2
Antibody against F4/80-PE/Cy7	Biolegend	123113	Clone BM8
Streptavidin-PE/Cy7	Biolegend	405206	Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5
Streptavidin-PerCP	Biolegend	405213	Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark
Cell dissociation sieve - tissue grinder kit	Sigma-Aldrich	CD1
V-Shaped, 96-well plates	Greiner/Sigma	M8185
5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm	BD Biosciences	352008
60x15mm petri dish	Greiner/Sigma	Z643084
BD LSR II Flow Cytometer	BD Biosciences