Summary
Análise quantitativa do conteúdo da célula dentro do nervo ciático murino é difícil devido à escassez do tecido. Este protocolo descreve um método para a digestão do tecido e preparação que fornece células suficientes para análise de citometria de fluxo de populações de células imunes dos nervos de ratos individuais.
Abstract
Nervo-residente células imunes no sistema nervoso periférico (SNP) são essenciais para a manutenção da integridade neuronal em um nervo saudável. As células do sistema imunológico do PNS são afetadas pela lesão e a doença, que afeta a função nervosa e a capacidade de regeneração. Células do sistema imunológico neuronais comumente são analisadas por imunofluorescência (IF). Enquanto se é essencial para determinar a localização das células imunes no nervo, se só é semi quantitativa e o método é limitado ao número de marcadores que podem ser analisados simultaneamente e o grau de expressão de superfície. Neste estudo, citometria de fluxo foi usada para análise quantitativa de infiltração de leucócitos em nervos ciático ou gânglios da raiz dorsal (DRGs) de ratos individuais. Única célula análise foi realizada utilizando DAPI e várias proteínas foram analisadas simultaneamente para a expressão de superfície ou intracelular. Ambos os nervos ciático de um rato que foram tratados de acordo com este protocolo gerado eventos nucleada único de ≥ 30.000. A proporção de leucócitos no nervo ciático, determinado pela expressão de CD45, foi aproximadamente 5% do teor total de célula no nervo ciático e aproximadamente 5-10% em DRG. Embora este protocolo enfoca principalmente a população de células imunes dentro o PNS, a flexibilidade de citometria de fluxo para medir uma série de marcadores simultaneamente significa que as outras populações de células presentes dentro do nervo, como células de Schwann, pericitos , fibroblastos e células endoteliais, podem também ser analisadas usando esse método. Esse método, portanto, fornece um meio novo para estudar os efeitos sistêmicos sobre o PNS, tais como biblioteca e modelos genéticos de neuropatia ou doenças crônicas, como diabetes.
Introduction
Células do sistema imunológico que entra o PNS da circulação, conforme definido pela expressão de CD45 e CD11b, ajudam a manter a integridade do nervo e desempenhar um papel tanto na regeneração e degeneração1. Macrófagos (definidos pela sua expressão de CD68 no mouse) podem ser desviados para um fenótipo inflamatório, expressando mais MHC classe II e CD86 em sua superfície (M1), ou para um fenótipo de anti-inflamatórios, expressando mais CD206 intracelular (M2)2 . Inclinação do fenótipo macrófago é um processo dinâmico, regulado através de Akt sinalização3, refletindo as diferentes tarefas de macrófagos na defesa contra patógenos (M1) e o papel na regeneração de tecidos (M2). Regeneração de um nervo lesionado requer primeiro fagocitose dos restos de mielina por macrófagos no nervo4,5e anti-inflamatório (CD68+CD206+) M2 macrófagos têm sido mostrados para promover a consequência natural do axônio na PNS6. Reduzido de recrutamento ou macrófagos para o PNS, ou capacidade prejudicada para a fagocitose pode resultar em regeneração prejudicada e manutenção da integridade do nervo. Inflamatórios macrófagos M1, expressar o MHC-classe II, são menos capazes de fagocitose de macrófagos M2, e inflamação neuronal está implicada na patogênese de doenças neurodegenerativas várias7.
As mudanças que ocorrem para o sistema imunológico residente de nervo em consequência de danos podem ser quantitativas, manifestando-se na perda de CD45+ leucócitos (ou aumento da infiltração de CD45+ leucócitos no caso inflamação), ou qualitativa, tais como mudança do fenótipo de macrófagos de M2 para M1 fenótipo. As células do sistema imunológico do PNS tradicionalmente foram analisadas por meio da se, usando seções congeladas ou parafina material8. Se é necessário para determinar a localização das células de interesse. No entanto, quantificação usando se muitas vezes baseia-se em contagem de um número relativamente pequeno de células em uma seção estreita do tecido, tornando a quantificação confiável e vulnerável a viés de seleção. Para identificação dos subconjuntos específicos de células do sistema imunológico, a detecção simultânea de marcadores extracelulares ou intracelulares é necessária, enquanto a determinação do fenótipo macrófago requer pelo menos pelo menos dois marcadores, especificamente CD206 e MHC classe II. Como mais comumente microscópios disponíveis limitam-se a canais de pelo menos duas cores, tais como o isotiocianato de fluoresceína (FITC) e ficoeritrina (PE), a caracterização dos subconjuntos específicos de células do sistema imunológico por IF pode ser restritiva e incompleta, exigindo a necessidade de ter vários slides, derivado da mesma área de interesse, que são coradas e analisadas em paralelo. Este aspecto demorado, portanto, não é necessário se presta à análise de amostra grande moda. Além disso, como a maioria dos marcadores de interesse são extracelulares, a deteção em tecido, que também tem sido incorporado em parafina ou cryoconserved, pode ser problemática devido o rompimento da integridade da membrana e o mascaramento de resumos, bem como a perda de os antígenos do interesse da utilização de solventes, tais como acetona e metanol9.
Em contraste, fluxo cytometry, que mede óptico e características de fluorescência das células únicas em suspensão como passam através de um feixe de luz, fornece um meio mais prático e abrangente para a análise das populações de células. Citometria de fluxo, ao invés de produzir uma imagem digital do tecido, fornece uma quantificação automatizada de parâmetros definidos, que incluem de uma célula tamanho relativo e índice reflexivo, referido como o scatter para frente (FSC), complexidade granularidade/interna ou lado-scatter (SSC) e a intensidade de fluorescência relativo, proporcionando que a célula tem sido rotulada com um fluoróforo adequado, tais como um anticorpo conjugado. Um citômetro de fluxo típico consiste de dois, lasers refrigerado a ar; um laser de argônio produz luz azul em 488 nm e um laser de hélio-neon produz luz em 633 nm. Esta combinação permite a detecção e medição, simultaneamente, pelo menos cinco alvos na superfície ou no interior do compartimento intracelular. Citômetros mais avançados podem consistir de vários lasers, que permitem a detecção de até oito diferentes fluorochromes ao mesmo tempo, proporcionando que o pico de emissão comprimentos de onda de fluorochromes os selecionado não se sobrepõem significativamente.
Para a análise por citometria de fluxo, o tecido de interesse deve primeiro ser enzimaticamente digerido, geralmente com colagenase, para gerar uma suspensão de célula única. Anteriormente, a análise de murino nervos ciático tem sido difícil devido à pequena quantidade de tecido obtido de cada rato. Além disso, o alto teor de gordura da mielina em torno dos axônios dificulta a recuperação da célula e produz grandes quantidades de detritos. O método aqui descrito para a preparação de nervo ciático e digestão foi adaptado a partir do protocolo de isolamento de célula de Schwann de Barrette et al 7e tem como objetivo isolar células suficientes de nervos de ratos individuais para análise de citometria de fluxo, a fim de reduzir a variação entre ratos. Usar o DAPI para a identificação de células únicas na digest cru tecido contorna a necessidade de remover os resíduos do axônio, que geralmente leva a perda de células. Lavar várias vezes com um aids reserva rica em detergente na liberação de células preso dentro os detritos gordurosos, aumentando assim o rendimento. Digestão de ambos os nervos ciático completos de um único rato de acordo com este protocolo gera ≥ 30, 000 eventos nucleados único e pelo menos 3 vezes esse número foi obtido o DRG. A proporção de CD45+ leucócitos foi de aproximadamente 5% do conteúdo da célula total em digerir o nervo ciático e aproximadamente 5-10% na digest DRG. A maioria da CD45+ células no nervo ciático expressaram os marcadores do macrófago, CD68 e CD206.
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Protocol
Camundongos C57BL/6 de tipo selvagem (machos; 10-12 semanas) foram mantidos em ciclo claro/escuro de 12h padrão e foram fornecidos livre acesso à dieta padrão de comida e água. Todas as experiências com animais foram conduzidas de acordo com as orientações pertinentes pelo local Cuidado Animal e uso de Comissão e aprovadas pelo Comitê de uso e cuidado de Animal local na autoridade regional em Karlsruhe, Alemanha (G216/10).
1. perfusão do Mouse
- Sacrificar o mouse (C57BL/6; Machos; 10-12weeks) usando o CO2 ou de acordo com os regulamentos locais.
Nota: Retro-orbital de sangramento pode ser realizada para obter controle de leucócitos, usando tubos EDTA-revestido 1,5 mL. Este método de sangramento é apenas eficiente imediatamente após o sacrifício. Lavagem da cavidade peritoneal, mais (PCL) pode ser realizada para obter controle de macrófagos, com PBS pré-aquecido a 37 ° C para evitar o fria aglutinação do sangue, que pode dificultar a perfusão. - Desinfecte o mouse pulverizando a pele sobre o abdômen liberalmente com etanol a 70% v/v e limpando várias vezes com um tecido com gaze de algodão. Com uma tesoura sem corte, cortada a pele abdominal por uma incisão longitudinal.
- Expor a cavidade pleural, primeiro fazer uma incisão no diafragma com uma tesoura curva, contundente e estendendo-se então a incisão ao longo de todo o comprimento da caixa torácica. Fazer um corte semelhante no lado contralateral até o esterno pode ser levantado com cuidado fora.
- Com uma visão clara do coração e os vasos sanguíneos, inserir uma borboleta 23¾ medidor de agulha, conectada a uma seringa de 50 mL cheio de PBS gelado, na câmara esquerda do coração.
- Fazer uma incisão para a aurícula direita do coração com uma tesoura de íris para criar tão grande de uma saída possível sem danificar a aorta descendente e então, pressione suavemente a seringa para empurrar através de aproximadamente 30 mL de PBS. O exsudato deve ser execução claro. A limpeza do fígado e rins / pode ser usada como um indicador de uma boa perfusão.
2. dissecação do nervo ciático e DRG
Nota: Para a dissecação do nervo ciático, a pele acima do glúteo máximo é removido e o mouse é posicionado lado ventral para baixo enquanto se estenda para os membros inferiores.
- Bilateralmente dissecar os nervos ciático todo separando o tecido muscular de coxa dorsal e acompanhar o nervo ao longo da coluna vertebral. Cortou o nervo onde sai da coluna vertebral e imediatamente acima do joelho na outra extremidade.
Nota: Evite manipulação excessiva do nervo como esmagamento ou puxar com a pinça. - Usando fórceps, transferi o nerve(s) extirpado, aproximadamente 2 cm por coragem, de um tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de PBS gelado e loja no gelo.
Nota: O nervo pode ser armazenado durante a noite no gelo.
Nota: Para a dissecação de DRG, usando fórceps e um bisturi, separe a pele do tecido mole subjacente por delicadamente descascando a pele restante volta para expor as regiões da coluna vertebral cervicais, torácicas e lombares. Remova a cabeça cortando na base do crânio usando um brusco par de tesouras. - Corte as costelas paralelo com e próximo da coluna vertebral de ambos os lados, antes de retirar as vísceras conectado à parte anterior da coluna vertebral. Corte os fêmures e remover a coluna vertebral através de um corte no nível dos fêmures transverso. Usando uma tesoura de íris, cortar qualquer músculo, gordura e outros tecidos moles da coluna vertebral.
- Coloque a coluna vertebral com o lado dorsal voltada para cima e abri-lo, começando pela extremidade caudal, deslizando uma ponta da tesoura dentro do canal vertebral na posição 03:00 e o osso à tesoura. Repita o procedimento na posição de 09:00.
Nota: É importante cortar exatamente no centro para não danificar o DRG. - Repita o corte de lado a lado até a extremidade rostral é atingida e a medula espinhal está completamente exposta. Usando um microscópio de dissecação, remova a medula espinhal para expor os nervos espinhais, que pode ser usados para localizar os DRGs dentro da espinha.
- Remova os DRGs lombares puxando suavemente da raiz dorsal para puxar o DRG até os canais vertebral, em seguida, recorte os nervos e tecido conjuntivo com uma tesoura de íris para remover os DRGs.
Nota: É possível restringir a coleção para o DRG L4-L6, que estão contribuindo para o nervo ciático. - Usando a pinça, transfira os DRGs para um tubo de 1,5 mL contendo aproximadamente 1 mL de PBS gelado e armazenar no gelo.
Nota: O nervo pode ser armazenado durante a noite no gelo.
3. digestão de nervo ciático e DRG
- Prepare a mídia de digestão (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, colagenase 1,6 mg/mL tipo 4) suplementada com 100 µ g/mL de desoxirribonuclease e loja no gelo.
Nota: A quantidade de meio de digestão por rato (nervos ciático + DRGs) é de 1 mL. Uma vez preparados, alíquotas de mídia a digestão podem ser armazenadas a-20 ° C. - Transferi os nervos ciático e DRGs de um rato em tubos separados 1,5 mL contendo 500 µ l de mídia de digestão. Para os nervos ciático, cortar o material em pedaços de 15-20, usando uma tesoura de mola e então incubar as suspensões de tecido em uma tremendo incubadora a 37 ° C por 20 min com agitação suave (≤ 450 rpm).
- Repetidamente, Triture a suspensão de eritrócitos através da ponta da pipeta de 1.000 µ l para dissociar mecanicamente qualquer tecido incompletamente digerido.
Nota: Se a suspensão for difícil dosear, então corte a ponta da pipeta com uma tesoura para criar um fim brusco. Incube a 37 ° C por 20 min com agitação suave (≤ 450 rpm) a suspensão de tecido. - Repita a trituração através de uma ponta da pipeta 1.000 µ l e incube por um mais 10 min a 37 ° C, com agitação suave (≤ 450 rpm).
- Preparar o buffer de FACS (PBS suplementado com 10% de FCS e 1 mM EDTA) e armazenar no gelo. Lave e mergulhe uma tela de aço inoxidável com uma malhagem de 140 µm com buffer de FACS em 60 x 15 mm placa de Petri no gelo.
Nota: Filtros de tela de Nylon devem ser evitados, como leva a uma perda significativa do rendimento das células nucleadas. - Várias vezes passe as suspensões de tecido do filtro de tela 140 µm, pois é realizada sobre o prato de Petri, com pinça de brusco, no gelo. Recolher a suspensão de célula da caixa de Petri e transferi-lo para um novo tubo de 1,5 mL armazenado no gelo.
- Empurre qualquer tecido incompletamente digerido que permanece no filtro através de trituração repetida com uma ponta de pipeta de 1.000 µ l. Lave o filtro de tela duas vezes com 500 µ l de tampão de FACS e coletar a suspensão resultante de célula na caixa de Petri para combinar com a suspensão de células da etapa 3.6.
Nota: Se o citômetro de fluxo usado é sensível aos restos, a suspensão de células da etapa 3.7 pode ser passada através de um filtro de tela 70 µm; no entanto, isso pode levar a uma perda do rendimento das células nucleadas. - Centrifugar as suspensões celulares a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de tampão de FACS. Repita essa etapa de lavagem uma vez.
- Ressuspender as células em 150-350 µ l de tampão de FACS, dependendo do número de coloração que são (150 µ l FACS buffer necessário por painel de coloração).
4. coloração do nervo ciático e DRG com anticorpos fluorescente etiquetados por citometria de fluxo
- Transferi 100 µ l do nervo ciático ou suspensão de células DRG em V em forma de bem em uma placa de 96 poços no gelo.
Nota: Células manchadas de Single são necessárias para todos os anticorpos utilizados como eles irão fornecer os controles necessários para configurar a citometria de fluxo em relação a photomultiplier tubo (PMT) ganhos de tensão e compensação, bem como como para ajudar a distinguir específicas de ligação não-específica. Devido o limitada material disponível a partir do nervo ciático e DRGs, sangue, leucócitos e macrófagos de PCL (passos 1.1-1.2) podem ser usados como os controles de single-manchada, a coloração para que deve ser executada em paralelo com a coloração do isquiático nervo e DRGs. - Piscina as restantes células (aproximadamente 50 µ l por amostra) de suspensões de nervos ciático ou amostras DRG, para servir como um controle imaculado.
- Centrifugue a placa a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante, invertendo a placa sobre o caixote e aplicando um forte movimento do pulso e bata levemente seco sobre papel-toalha.
- Para a coloração da superfície, cada um dos rolos célula Resuspenda em 20 µ l de tampão de FACS contendo os anticorpos de interesse (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 e MHC classe II-biotina) e incubar, protegido da luz, no gelo por 30 min.
Nota: (1) a diluição de anticorpo otima deve ser determinado antes de usar, realizando uma série de diluições de acordo com informações do fabricante do produto; (2) colorações não-específicos podem ser reduzidas pela incubação com Fc-bloco a esta etapa, de acordo com as instruções do fabricante; e (3) do isotipo controle citológicas geralmente não são necessárias ao usar os anticorpos primários diretamente conjugados com um fluoróforo e/ou quando os ou os antigénios de interesse ou produzem populações distintas. - Adicione 130 µ l de tampão de FACS a cada poço e centrifugar a placa a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Como descrito anteriormente (passo 4.3) e lavar as pelotas de célula duas vezes com 150 µ l de tampão de FACS, desprezar o sobrenadante.
Nota: Se usar um anticorpo primário unconjugated ou um anticorpo primário conjugado com biotina, então um reagente secundário apropriado, conjugado com um fluoróforo, pode ser adicionado neste ponto e etapas 4.4-4.5 são repetidas. No caso do presente protocolo, streptavidin-PE/Cy7 ou Streptavidin-PerCP foi usado para detectar MHC classe II em combinação com CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5, ou em combinação com CD68-APC e F4/80-PE/Cy7, respectivamente. - Para a fixação, após a última etapa de lavagem, resuspenda as pelotas de célula em 100 µ l de paraformaldeído 4% em PBS (pH 7,4). Incubar a placa no gelo por 10 minutos e em seguida centrifugar a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante como descrito anteriormente (passo 4.3) e lavar as pelotas de célula uma vez com 150 µ l de tampão de FACS.
Cuidado: Paraformaldehyde é tóxico; Use proteção adequada como luvas e óculos, etc.
Nota: Resuspenda as pelotas de célula em 150 µ l de tampão de FACS e armazenar protegido da luz, a 4° C por até dois dias. Se nenhum coloracao intracelular é necessária, então vá para a etapa 4.11 após centrifugação a placa a 400 x g por 5 min a 4 ° C. - Para coloracao intracelular, resuspenda as pelotas de célula em 150 µ l de detergente buffer+0.5% de FACS e incubar a temperatura ambiente, protegida da luz por 15 min. centrifugar a placa a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante como descrito anteriormente (passo 4.3) e lavar o centrifugado uma vez com 150 µ l de tampão de FACS + 0,5% de detergente. Ressuspender as células em 20 µ l de detergente de FACS buffer+0.5% que contém os anticorpos de interesse (CD68-APC, CD206-PE) e incube, protegido da luz, em temperatura ambiente por 30 min.
- Adicione 130 µ l de detergente de FACS buffer+0.5% a cada poço e centrifugar a placa a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante, como descrito anteriormente (passo 4.3) e lavar as pelotas de célula duas vezes com 150 µ l de tampão de FACS + 0,5% de detergente.
Nota: Se usar um anticorpo primário unconjugated ou um anticorpo primário conjugado com biotina, então um reagente secundário apropriado, conjugado com um fluoróforo, pode ser adicionado neste ponto e medidas 4.9-4.10 repetido. - Resuspenda as pelotas de célula em 150 µ l de tampão de FACS + 0,5% de detergente e loja, protegido da luz, a 4 ° C por até dois dias.
- Resuspenda as pelotas de célula com 150 buffer de FACS µ l + 0,5% de detergente suplementado com 5 µ g/mL DAPI e incubar durante 5 min à temperatura ambiente, protegida da luz. Centrifugue a placa a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante conforme descrito anteriormente (passo 4.3).
- Resuspenda as pelotas de célula em 150 µ l de PBS e transferir para um tubo de FACs devidamente rotulado. Armazenar em temperatura ambiente, protegida da luz, até que esteja pronto para análise.
Nota: Após ressuspensão em PBS, as células devem ser analisadas dentro de horas, desde que a DAPI lentamente irá dissociar-se do DNA, levando a uma perda de sinal.
5. instalação de citometria de fluxo e execução de amostras
- Certifique-se que o citômetro de fluxo é equipado com os apropriado lasers e/ou filtro define para medir o fluorophores usado para manchar as células. Isso pode ser determinado sob a configuração de citômetro de padrão no sistema. No caso do presente protocolo, as células foram analisadas usando um citômetro de fluxo, equipado com três lasers (405 nm, 488 nm e 633 nm) permitindo a detecção de ≤ 5 fluorophores.
- Selecione os canais apropriados para a deteção do fluorophores de interesse. Todos os sinais fluorescentes são melhor detectados com amplificação logarítmica.
- Selecione uma taxa de fluxo adequado para as amostras. Este parâmetro pode variar dependendo do sistema utilizado e deve ser determinado empiricamente. No caso do presente protocolo, utilizou-se um caudal de MED-para-HI (35-60 µ l/min) para evitar o entupimento da agulha.
- Selecione o número total de eventos/células a serem coletados por amostra. O número mínimo de eventos deve ser 1.000.000.
- Criar gráficos de dispersão sob uma planilha global do SSC-A contra o FSC-A, bem como para cada fluoróforo de interesse versus FCS-A. Crie uma vista estatístico que exibirá o número de eventos e a média intensidade fluorescente (IFM) para o fluorophores selecionado.
- Defina a tensão dos canais FSC-A e SSC-A, tal que as células menores se encaixam o inferior esquerdo 10% do gráfico de dispersão. Determine a fluorescência de fundo e fluorescência da amostra mínima de controles imaculados de nervos ciático ou DRGs. Determine o portão do pai (P1) baseado o scatter plotagem de DAPI somente controles de coloração.
Nota: Este não é um portal de coleção, devido em parte, para a heterogeneidade da população DAPI + o PNS. - Usar o scatter FSC parcelas para cada um dos fluorophores turísticos, ajustar as tensões para que as células do controle unstained cair dentro do trimestre inferior de sua respectiva dispersão. Portões são então criados acima desta região para definir as células que são positivas para cada uma os respectivos marcadores/fluorophores. A colocação de um portão é confirmada pela execução do controle single-manchado (passo 4.1).
Nota: Compensação a sobreposição de espectros de emissão pode ser realizada neste momento ou aplicada retrospectivamente com o software de análise adequada. - Uma vez que o citômetro de fluxo tem sido configurado, conforme descrito, as amostras podem ser executadas.
- Após a execução, o material restante da amostra pode ser descartado e os arquivos de FCS podem ser exportados para uma análise mais aprofundada.
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Representative Results
Suspensões celulares de ambos completos nervos ciático e todos os principais DRG foram elaboradas, de acordo com o protocolo, de seis saudável C57BL/6 ratos e divididas em três alíquotas iguais para a coloração. Contador de coloração com DAPI, que manchas de DNA, permite a detecção de uma população única célula (figura 1A–B, painel superior). Lavando o DAPI, antes da análise por citometria de fluxo, diminuiu de forma a intensidade fluorescente dos escombros não-nucleated, que permite a seleção de uma população discreta sobre o FSC-eixo de eventos único-nucleated ou camisolas. Sem Portal coleção é aplicado como as camisolas de PNS estão distribuídas em uma grande gama de FSC e SSC (Figura 1). O material na parte alta do eixo de FSC, contém incompletamente digerido o tecido, deve ser excluído da seleção da população singlet (figura 1A–B). Usar um enredo de densidade (painel inferior) para exibir os resultados pode facilitar a exclusão dos detritos grandes (painel inferior). Um total de 30.000 singletos ≥ pode ser regularmente obtido dois completa dos nervos ciático e 200, 000 singletos podem ser obtidos DRGs (Figura 1). Do nervo ciático, aproximadamente 5% dos singletos expressa CD45 na sua superfície, Considerando que cerca de 5-10% foram encontrados nos DRGs, definindo, assim, estas células como leucócitos de origem hematopoiética (Figura 2A).
A maioria da CD45+ camisolas também expressaram o MHC-classe II, de forma gradual (Figura 2B). Os DRGs, CD11b pode ser usada para detectar células microglial (CD45dim, MHCII+ e CD11b+) (Figura 2B, painel superior). No entanto, esta população de micróglia está ausente do nervo ciático (Figura 2B, painel inferior). A maioria dos singletos expressando CD45 no PNS são CD68+ macrófagos. No nervo ciático e DRG, 2-5% dos singletos expressa CD68 (Figura 3A). Todas as células expressando CD68 também expressaram CD45 (dados não mostrados). Nos DRGs, o CD68+ macrófagos foram mais heterogêneos em sua expressão de ambos MHC classe II e CD206, um marcador para macrófagos M2, do que no nervo ciático (Figura 3B–D). No nervo ciático, a maioria dos macrófagos co expressa MHC classe II e CD206 (Figura 3B–D, painéis inferiores); Normalmente, cerca de 60-80% do CD68+ macrófagos expressaram CD206, enquanto uma proporção menor do CD68+ co expressa CD206 nos DRGs (Figura 3B). Curiosamente, o marcador para macrófagos M1 CD86 não gera qualquer coloração positiva nem em macrófagos do nervo nem do PCL (dados não mostrados). O marcador para macrófagos, F4/80, mostrou uma expressão heterogênea em DRG e nos nervos ciático (Figura 3B–(C), manchando uma proporção da CD68– e células MHCII– . Além disso, expressão F4/80 não totalmente sobreposição com a expressão CD68.
Figura 1: dados representativos da análise de citometria de fluxo de DAPI-manchado nucleated células de DRG e nervo ciático. Todos os eventos coletados, mostrado como scatterplots (painel superior) ou densidade parcelas (painel inferior), de DRG (A) ou (B) nervo ciático (SN) de um rato representativo. As setas nos painéis inferiores indicam os portões, excluindo o material na parte superior do eixo do FCS. (C) fundos-gating das células coletadas em DAPI-portão (camisolas), mostrado no painel (A) no gráfico de dispersão CCD vs FSC. (D) número de camisolas do SN e todos os principais DRG de seis ratos saudáveis de C57BL/6. Dados representam média ± DP. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: fluxo cytometry análise de superfície expressão de CD45, MHC-classe II e CD11b na singletos de DRG e nervo ciático. Analisaram-se eventos selecionados em DAPI-portão (camisolas) mostrado na Figura 1 . (A) proporção dos singletos expressando CD45 no nervo ciático (SN) e DRG de seis ratos controle. (B) representante dispersão parcelas de camisolas de DRG (painel superior) e SN (painel inferior). Células expressando CD11b são indicadas com a cor azul. Dados representam média ± DP. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: fluxo cytometry análise da expressão de superfície de CD68, MHC-classe II e CD206 em camisolas de DRG e nervo ciático. Analisaram-se eventos selecionados em DAPI-portão (camisolas) mostrado na Figura 1 . (A) proporção os singletos expressando CD68 no nervo ciático (SN) e DRGs de seis ratos saudáveis de C57BL/6. (B) proporção de CD68+ macrófagos expressando co CD206 no SN e DRG de seis ratos saudáveis de C57BL/6. (C) representante dispersão de camisolas de DRG (painel superior) e SN (painel inferior), mostrando a expressão de II classe CD68 e MHC. (D) representante dispersão de camisolas de DRG (painel superior) e SN (painel inferior), mostrando a expressão CD68 e CD206. Células expressando F4/80 são indicadas com a cor magenta. Dados representam média ± DP. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os nervos ciático contêm uma grande proporção de lipídios, como colesterol, devido ao teor de mielina em torno dos axônios. Desde que as propriedades de lipídios mudam com a temperatura, diferentes resultados podem ser obtidos em temperaturas diferentes. Para garantir a preservação de células, todas as etapas neste protocolo após a digestão foram realizadas no gelo. Enquanto a consistência é recomendada por razões de reprodutibilidade dos resultados, pode ser possível aumentar o rendimento executando as etapas 3.6 e 3.7 à temperatura ambiente. Se os nervos no passo 3.8 não tem sido digeridos suficientemente, pequenos pedaços de nervo será visíveis na malha. Em caso de digestão insuficiente, o material retido na malha pode ser re-digerido pela transferência para um novo tubo de 1,5 mL contendo 250 µ l de mídia de digestão e repetindo as etapas 3.2-3.6. Se o rendimento é pobre e, em seguida, uma amostra da suspensão celular, depois de passar através da tela de engranzamento (passo 3.6) deve ser visto sob um microscópio óptico com trypan azul. Células viáveis, não-azul, devem estar visíveis juntamente com haste-como estruturas, que são fragmentos de axônios. Se não há células viáveis estão presentes, então a digestão condições e/ou entrega incorreta do material causou necrose. Se apenas grandes agregados são visíveis, então recomenda-se coletar o material por centrifugação e repita a digestão (etapas 3,2-3,6).
O método de análise de citômetro de fluxo de murino nervos ciático e DRGs é útil para questões envolvendo todo nervos e vários DRGs. recentemente tem havido um aumento do interesse na análise do PNS usando fluxo cytometry11,12 . Liu et al desenvolveram um método usando a papaína e dissociação mecânica dos nervos ciático e DRGs usando 21 e 23 G especificamente analisar tão pouco como seção de 1 cm do nervo, permitindo assim que para a análise do material do nervo de sites específicos de lesão11. O método apresentado aqui é recomendado para uso quando o efeito sobre o PNS é esperado para ser sistêmica, como em neurotoxicology e modelos genéticos de neuropatia ou doenças crônicas, como diabetes. Devido o baixo rendimento das células nucleadas, obtidos de nervo ciático, não é aconselhável tentar estudar eventos de pequenas populações com ≤ 100 condomínio fechados de um mouse individual. No entanto, acúmulo de material de vários ratos facilitaria o estudo de tais populações pequenas dentro do nervo. No entanto, seria de interesse para investigar se a dissociação enzimática do tecido usando agulhas de papaína e G 21 / 23G descrita por Liu et al . 11 poderia ser combinado com a coloração de citometria de fluxo de núcleos, conforme descrito no presente estudo, para melhorar o rendimento de células únicas. A capacidade de analisar quantidades muito pequenas de tecido é crucial para a realização de comparação entre ipsi e contralaterais DRGs unilateral nervo ciático axotomy a seguir. No entanto, isso está além do escopo deste estudo. Curiosamente, comumente usados marcadores para identificação de macrófagos foram encontrados para ter uma expressão inesperadamente heterogênea no PNS de ratos. Por exemplo, CD11b e F4/80 foram encontrados para ser expressa em uma grande proporção de não-hematopoiéticas, não-células apresentadoras no nervo ciático e DRGs. Além disso, no nervo ciático, CD68 nem todos+ macrófagos expressaram CD11b e F4/80, como seria de esperar do estudo de outros órgãos. Portanto, é recomendável que é tomar cuidado ao usar estes marcadores para o estudo de macrófagos no PNS e que outros marcadores, como CD163, devem ser investigados. Além disso, a sensibilidade dos diferentes marcadores para a dissociação enzimática também deve ser estabelecida como este talvez uma explicação para as diferenças observada na expressão, tais como com CD11b ou F4/80.
Este protocolo anteriormente foi usado para analisar as células imunes a PNS após desafio tóxico com estreptozotocina (STZ)13, um produto químico comumente usado para a indução do diabetes em roedores organismos modelo. Foi demonstrado que STZ, que ativa tanto TRPV1 e TRPA1, inicialmente causa uma depleção de células imunes no nervo ciático e DRGs, enquanto não causando qualquer inflamação no nervo. Embora os números de células do sistema imunológico nos DRGs recuperados, as células do sistema imunológico e nomeadamente macrófagos ainda significativamente foram esgotados três semanas pós desafio tóxico. Posteriormente foi hipotetisado que fagocitose de macrófagos de detritos de nervo, resultantes de um dano por hiperexcitabilidade do canal de íon pode ter levado para a apoptose de macrófagos, resultando em sua depleção da população celular geral. Não se sabe como outras toxinas de nervo periférico afetam os macrófagos residentes do nervo. Se depleção dos macrófagos é um resultado comum de tais agentes, isto pode ter implicações para o tratamento.
Verificou-se que apenas 5-10% das células nucleadas do nervo foram leucócitos de origem hematopoiética. As células restantes são, presumivelmente, uma mistura de outros tipos de células nervosas, nomeadamente células de Schwann, fibroblastos, pericitos e células endoteliais. Devido à capacidade dos sistemas de citometria de fluxo para medir vários parâmetros e fornecendo o que há marcadores específicos e/ou anticorpos disponíveis, é concebível que estes tipos de células também podem ser analisados usando esse método. Este método tem sido descrito para o material de murino. No entanto, com algumas modificações, ele tem também sido usado para a análise do material PNS do porco e do humano. Prevê-se que este método será mais útil para a análise de materiais das espécies maiores do que os ratos, no futuro.
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesses no que se refere este estudo.
Acknowledgments
Este estudo foi suportado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; SFB1118). Os autores gostaria de agradecer a Axel Erhardt para execução da maioria da dissecação e prestativamente transmitindo esse conhecimento e Dr. Volker Eckstein para auxiliar no aspecto técnico do citômetro de fluxo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve - tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
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