Summary
Kantitatif analiz fare siyatik sinir içinde hücre içeriğinin doku kıtlığı nedeniyle zordur. Bu iletişim kuralı doku sindirim ve sinir bağışıklık hücre gruplarından bireysel farelerin Akış Sitometresi Analizi için yeterli hücre sağlar hazırlık için bir yöntemi açıklar.
Abstract
Periferik sinir sistemi (PNS) sinir yerleşik bağışıklık hücreleri sağlıklı bir sinir içinde nöronal bütünlüğünü korumak için gereklidir. PNS bağışıklık hücreleri yaralanma ve hastalık, sinir fonksiyonu ve rejenerasyon kapasitesini etkileyen etkilenir. Nöronal bağışıklık hücreleri yaygın olarak ayirt (Eğer) tarafından incelenir. Eğer sinir, bağışıklık hücreleri konumunu belirleyen temel sadece yarı nicel olup yöntemi aynı anda analiz edilebilir işaretleri sayısı ve yüzey ifade derecesi ile sınırlı olup olmadığını tamamlayın. Bu çalışmada, Akış Sitometresi lökosit infiltrasyonu siyatik sinir veya dorsal kök ganglions (DRGs) bireysel farelerin kantitatif analiz için kullanıldı. Tek hücre analizi DAPI kullanılarak gerçekleştirilmiş ve çeşitli proteinler aynı anda yüzey ya da hücre içi ifade için analiz edildi. Bu protokole göre tedavi edildi her iki siyatik sinirleri bir fareden ≥ 30.000 tek çekirdekli olayları oluşturuyordu. Lökosit siyatik sinir, CD45, ifade tarafından belirlenen oranda yaklaşık %5 Toplam Hücre içeriğinin siyatik sinir ve DRG yaklaşık % 5-10 oldu. Her ne kadar bu iletişim kuralı öncelikle PNS içinde bağışıklık hücre nüfus odaklanır, aynı anda bir sayı işaretlerinin ölçmek için Akış Sitometresi esnekliğini diğer hücre nüfusları Schwann hücreleri, perisitlerden gibi sinir içinde mevcut anlamına gelir , fibroblastlar ve endotel hücreleri, de analiz bu yöntemi kullanarak. Bu yöntem bu nedenle PNS, neurotoxicology ve genetik modellerini nöropati veya diyabet gibi kronik hastalıkları gibi sistemik etkileri eğitimi için yeni bir yol sağlar.
Introduction
PNS dolaşımdan girin bağışıklık hücreleri CD45 ve CD11b, ifade tarafından tanımlanan sinir bütünlüğünü korumak ve her iki rejenerasyon ve dejenerasyonu1' rol için yardım et. Makrofajlar (CD68 onların ifade Mouse tarafından tanımlanan) daha fazla MHC ifade bir enflamatuar fenotip doğru eğilmiş onların yüzey (M1) Sınıf II ve CD86 veya daha fazla hücre içi CD206 bir anti-inflamatuar fenotip doğru ifade (M2)2 . Makrofaj fenotip eğriltme3sinyal, patojenler (M1) karşı savunma makrofajlar ve doku rejenerasyonu (M2) rolünde farklı görevler yansıtan Akt üzerinden düzenlenmiş bir dinamik işlemidir. Yaralı bir sinir rejenerasyon ilk sinir4,5ve anti-inflamatuar makrofajlar tarafından fagositoz miyelin enkaz gerektirir (CD68+CD206+) M2 makrofajlar axon akıbet tanıtmak için gösterilmiştir PNS6. İşe Alım veya makrofajlar PNS için azaltılmış veya Engelli fagositoz kapasiteli Engelli rejenerasyon ve sinir bütünlük bakımından sonuçlanabilir. MHC sınıf II, ifade inflamatuar M1 makrofajlar M2 makrofajlar fagositoz daha az yetenekli ve nöronal inflamasyon çeşitli nörodejeneratif hastalıkları7patogenezinde karıştığı.
Sinir yerleşik bağışıklık sistemi hasarı sonucu olarak meydana gelen değişiklikler kantitatif, CD45 kaybına tezahür olabilir+ lökosit (veya artmıştır infiltrasyon CD45+ lökosit olgu iltihabı), veya nitel, gibi makrofaj fenotip m2 M1 fenotip için değişti. PNS bağışıklık hücreleri geleneksel olarak donmuş bölümleri veya malzeme8parafin gömülü kullanarak Eğer aracılığıyla analiz edilmiştir. Eğer ilgi hücrelerinin yerelleştirme belirlemek için gereklidir. Ancak, eğer kez miktar kullanarak nispeten az sayıda dar bir bölümü olan miktar güvenilmez ve seçim önyargı karşı savunmasız hale doku, Hücre sayımı dayanır. Makrofaj fenotip belirlenmesi en az en az iki işaretleri, özellikle CD206 ve MHC gerektirir iken bağışıklık hücreleri belirli alt kümeleri tanımlaması için hücre dışı ve/veya hücre içi işaretleri eşzamanlı tespiti gereklidir Sınıf II. En yaygın olarak kullanılabilir mikroskoplar floresein isothiocyanate (FITC) ve phycoerythrin (PE), gibi en az iki renk kanallarına sınırlıdır eğer tarafından bağışıklık hücreleri belirli alt kümeleri karakterizasyonu kısıtlayıcı ve eksik, gerektiren olabilir birden çok slayt, gerek hangi lekeli ve paralel olarak analiz ilgi, aynı alanından türetilmiş. Bu zaman alan yönü bu nedenle does değil gerekli ödünç vermek kendisi büyük örnek kümeleri çözümleme için. Ayrıca, ilgi işaretlerinin çoğu hücre dışı gibi algılama ya parafin veya cryoconserved katıştırılmış, doku membran bütünlüğü bozulma ve epitopları maskeleme, hem de kaybı nedeniyle sorunlu olabilir antijenlere aseton ve metanol9gibi çözücülerin kullanımından ilgi.
Buna ek olarak, Akış Sitometresi, optik ölçen ve süspansiyon tek hücre özelliklerini Floresan ışık, bir demeti geçerken sağlar hücre popülasyonlarının çözümlenmesi için daha pratik ve kapsamlı bir araç. Doku, dijital bir görüntüsünü üreten yerine Akış Sitometresi sağlar bir hücrenin göreli boyutu ve ileri dağılım (FSC), parçalı yapı/iç karmaşıklık anılacaktır yansıtıcı dizin içeren parametreleri ayarlama, otomatik bir miktar veya yan-dağılım (SSC) ve göreceli floresan yoğunluğu, hücre konjuge bir antikor gibi uygun bir fluorophore ile etiketli sağlayan. Tipik Akış Sitometresi iki, hava soğutmalı lazerler oluşur; bir argon lazer 488, mavi ışık üretir nm ve helyum-neon lazer üreten ışıkta 633 nm. Bu kombinasyon algılama ve ölçüm, için aynı anda, en az beş hedef yüzeyi veya hücre içi bölme içinde sağlar. Daha gelişmiş akış cytometers seçilen fluorochromes, en yüksek emisyon dalga boylarında önemli ölçüde örtüşmeyen sağlayan sekiz farklı fluorochromes tespiti için bir kez, izin birden çok lazerler bileşiminden oluşabilir.
Akış Sitometresi tarafından analiz etmek için doku ilgi ilk enzimatik, bir tek hücre süspansiyon oluşturmak için genellikle collagenase ile sindirilir olun gerekir. Fare siyatik sinir analiz daha önce her fareden alınan doku az miktarda nedeniyle zor olmuştur. Buna ek olarak, miyelin aksonlar çevresinde yüksek yağ içeriği hücre kurtarma engellemektedir ve enkaz büyük miktarlarda üretir. Siyatik sinir hazırlık ve sindirim için burada açıklanan yöntemi Barrette vd Schwann hücresi yalıtım kuralından adapte oldu 7ve sinirler için Akış Sitometresi Analizi, bireysel farelerin yeterli hücrelerden fareler arasında varyasyon azaltmak için izole amaçlamaktadır. Tek Kişilik hücrelerde ham doku Özet tanımlanması için DAPI kullanarak sık hücre kaybına neden axon enkaz kaldırmak gerek kaçınmanızı sağlar. Çamaşır deterjan zengini arabellek AIDS hücrelerinin sürümdeki ile birkaç kez böylece verim artırma yağlı enkaz içinde sıkışmış. Bu protokole göre tek bir fareden her iki tam uzunlukta siyatik sinir sindirim ≥30, 000 tek çekirdekli olayları oluşturur ve en az 3 kez bu rakam DRG alınmadı. CD45 oranı+ lökosit yapıldı Toplam hücre içeriğini siyatik sinir Özet ve yaklaşık yaklaşık % 5'i DRG Özet % 5-10. CD45 çoğunluğu+ siyatik sinir hücrelerinde ifade makrofaj işaretleri, CD68 ve CD206.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vahşi-C57BL/6 o farelerde tip (erkek; 10-12 hafta) standart 12 h açık/koyu döngüsünde tutuldu ve ücretsiz erişim için standart chow diyet ve su temin edilmiştir. Tüm hayvan deneyleri ilgili yönergelere uygun olarak yerel hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından yürütülen ve bölgesel yetkilisi Karlsruhe, Almanya (G216/10) itibariyle yerel hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış.
1. perfüzyon fare
- Kurban fare (C57BL/6; Erkek; 10-12weeks) CO2 kullanarak veya yerel düzenlemelere uygun olarak.
Not: Retro-orbital kanama kontrolü lökosit, 1,5 mL EDTA kaplı borular kullanarak elde etmek için gerçekleştirilebilir. Kanama bu yöntem yalnızca kurbandan sonra hemen etkilidir. Ayrıca, Periton boşluğuna lavaj (PCL) denetim makrofajlar, 37 ° C'de soğuk Aglutinasyon perfüzyon engel olabilir kan önlemek için Önceden ısıtılmış PBS kullanarak elde etmek için gerçekleştirilebilir. - Fare kürk karnına liberal % 70 v/v etanol ile püskürtme ve art arda bir doku ile pamuk gazlı bez ile silerek tarafından dezenfekte edin. Künt makas kullanırken, karın cilt tarafından boyuna bir kesi kesmiş.
- Plevral boşluğu içine belgili tanımlık kesme göğüs kafesi tüm uzunluğu boyunca uzanan ve kavisli, künt makas kullanarak diyafram bir kesi yaparak ortaya çıkarmak. Göğüs kemiği dikkatlice uzakta kaldırdı kadar kontralateral tarafında benzer bir kesim yapmak.
- Kalp ve büyük damarlarının açık bir görünümü ile bir kelebek 23¾ ölçmek için bir 50 mL şırınga bağlı iğne, INSERT kalbin sol odanın içine buz gibi PBS ile dolu.
- Iris makas inen aorta zarar vermeden mümkün olduğu kadar büyük bir çıkış oluşturmak için kullanırken kalbin sağ atrium için bir kesik yapın ve sonra yavaşça yaklaşık itmeye şırınga bunalıma girmek PBS 30 mL. Çıktı tıkanmadan akıyor. Karaciğer ve/veya böbrekler takas iyi bir perfüzyon bir göstergesi olarak kullanılabilir.
2. diseksiyon siyatik sinir ve DRG
Not: siyatik sinirleri diseksiyon için cilt yukarıdaki gluteus maximus kaldırılır ve fare ventral yan aşağı alt ekstremite uzanan iken konumlandırılmış.
- Çift taraflı bütün siyatik sinir kas dokusu üst dorsal kalça ayırarak incelemek ve sinir omurga takip etmek. Nerede omurga ve hemen diğer ucunda diz üstü çıkar sinir kesti.
Not: kırma veya Forseps ile çekerek gibi sinir aşırı kullanımı önlemek. - Forseps kullanarak, çıkarılan gangliyonlari, sinir, buz gibi PBS ve buz üzerinde mağaza 1 mL içeren bir 1,5 mL tüp için her yaklaşık 2 cm transfer.
Not: Sinir gecede buz üzerinde depolanabilir.
Not: alttaki yumuşak doku derisini nazikçe, göğüs, servikal ve Lomber spinal bölgeleri maruz kalan arka derisini soyma tarafından bir neşter ve forseps kullanarak DRG diseksiyon için bağlantısını kesin. Bir künt makas kullanarak kafatasının, keserek başından kaldırın. - İç organlar ayırma omurga ön tarafına bağlı önce kaburga ve omurga her iki tarafta yakın paralel kesti. Uyluk kesim ve kalça düzeyinde kesilmiş bir enine omurga kaldırmak. Iris makas kullanarak, herhangi bir kas, yağ ve diğer yumuşak dokularda omurga üzerinden sadece... kes gitsin.
- Omurga dorsal yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve açın, bir ucu makas vertebral kanala saat 3'te kaydırarak Kaudal sonunda başlangıç konumu ve kemik makasladım. Saat 9'konumundaki yordamı yineleyin.
Not: Tam ortasında DRG zarar görmesini önlemek için kesmek önemlidir. - Yan yana gelen kesme rostral sonuna ulaştı ve omurilik tamamen maruz kadar yineleyin. Diseksiyon mikroskop kullanarak, omurilik omurga içinde DRGs bulmak için kullanılan spinal sinirlerin ortaya çıkarmak için kaldırın.
- Lomber DRGs yavaşça DRGs kaldırmak için Iris makasla sinirler ve bağ dokusu kırpma vertebral Kanallar içine DRG çekmeye dorsal kök çekiştirmeye tarafından kaldırın.
Not: L4-L6 DRG koleksiyonuna kısıtlamak mümkün olan siyatik sinir katkıda bulunuyorlar. - Forseps kullanarak, DRGs buz gibi PBS yaklaşık 1 mL içeren bir 1,5 mL tüp aktarın ve buza depolayın.
Not: Sinir gecede buz üzerinde depolanabilir.
3. sindirim siyatik sinir ve DRG
- 100 µg/mL deoksiribonükleaz ve buz üzerinde mağaza ile takıma sindirim medya (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, 1.6 mg/mL collagenase tip 4) hazırlayın.
Not: 1 mL sindirim orta fare (siyatik sinirleri + DRGs) gerekli miktarıdır. Bir kez hazırlanan, aliquots sindirim medya-ebilmek var olmak stok-20 ° C'de - Siyatik sinir ve DRGs bir fare 500 µL sindirim medya içeren ayrı 1,5 mL tüpler içine aktarın. Siyatik sinirleri için malzeme bahar makas kullanarak 15-20 parçalar halinde doğrayın ve doku süspansiyonlar 37 ° C'de titreyen bir kuluçka nazik ajitasyon (≤ 450 d/d) ile 20 dk için kuluçkaya.
- Art arda hücre süspansiyon mekanik olarak eksik olarak sindirilir herhangi bir doku ayırmak için 1.000 µL pipet ucu ile triturate.
Not: süspansiyon titre zorlanırsanız, pipet ucu künt bir sonu oluşturmak için makasla sonra kesti. Doku süspansiyon için nazik ajitasyon (≤ 450 d/d) ile 20 dk 37 ° C'de kuluçkaya. - 1000 µL pipet ucu ile toz tekrarlayın ve nazik ajitasyon (≤ 450 d/d) ile 37 ° C'de daha bir 10 min için kuluçkaya.
- FACS arabellek (PBS % 10 FCS ve 1 mM EDTA ile desteklenmiş) hazırlamak ve buz üzerinde. Durulama ve 60 x 15 mm Petri kabına buzda bir paslanmaz çelik ekran FACS arabelleği ile 140 µm kafes büyüklüğü ile ıslatın.
Not: naylon ekran filtreleri önemli çekirdekli hücre verim kaybına yol açar gibi kaçınılmalıdır. - Tekrar tekrar buza künt Forseps ile Petri kabına üzerinde tutulur gibi doku süspansiyonlar 140 µm ekran filtreden geçmek. Hücre süspansiyon Petri kabına toplamak ve buz üzerinde depolanan bir yeni 1,5 mL tüp aktarmak.
- Filtre üzerinden 1.000 µL pipet ucu ile tekrarlanan toz tarafından kalan herhangi bir eksik olarak sindirilir doku itin. Ekran filtresiyle iki kez 500 µL FACS arabelleği durulama ve Petri kabına adım 3,6 gelen hücre süspansiyon ile birleştirmek için elde edilen hücre süspansiyon toplamak.
Not: kullanılan Akış Sitometresi enkaz için hassas ise, hücre süspansiyon adım 3.7 70 µm ekran filtre geçirilebilir; Ancak, bu çekirdekli hücre verim kaybına neden olabilir. - Hücre süspansiyonlar, 300 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atın ve hücre Pelet FACS arabellek 1 mL resuspend. Bir kez bu çamaşır tekrarlayın.
- Hücre Pelet gerekli (150 µL FACS başına arabellek boyama Masası) olan 150-350 µL FACS arabelleği, boyama bağlı olarak resuspend.
4. boyama siyatik sinir ve DRG Fluorescently etiketli antikorlar ile Akış Sitometresi için
- Siyatik sinir veya DRG hücre süspansiyon 100 µL buzda bir V-şekilli bir 96-şey tabak içinde de içine aktarın.
Not: Tek lekeli hücreleri gibi onlar-ecek sağlamak gerekli kontrolleri ile ilgili photomultiplier tüp (PMT) gerilim kazançları ve tazminat, de Akış Sitometresi üzerinden belirli ayırt etmeye yardımcı olması için oluşturmak için kullanılan tüm antikorlar için gereklidir non-spesifik bağlama. Sınırlı malzeme siyatik sinir ve DRGs mevcut nedeniyle, lökosit kan ve makrofajlar PCL (Adım 1.1-1.2)--dan-ebilmek var olmak kullanılmış tek lekeli denetimleri boyama hangi-meli var olmak kılınmak siyatik boyama ile paralel için sinir ve DRGs. - Kalan havuzu süspansiyonlar (yaklaşık 50 µL örnek başına) siyatik sinir veya DRG örnekleri, bir günahı denetimi olarak hizmet etmek veya hücreleri.
- 400 x g 4 ° C'de 5 min için plaka santrifüj kapasitesi Süpernatant plaka üzerinde bir depo gözü ters çevirme ve bilek keskin bir fiske uygulayarak atın ve kağıt havlu üzerine kuru hafifçe dokunun.
- Yüzey boyama, her hücre pellet FACS arabellek faiz (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 ve MHC sınıf II-Biotin) antikorları içeren 20 µL içinde resuspend ve kuluçkaya, ışık, buz 30 dk için korunuyorsunuz.
Not: (1 en iyi antikor seyreltme üreticinin ürün bilgilerine göre seyreltme serisi gerçekleştirerek kullanmadan önce kararlı olmalıdır; (2) spesifik olmayan stainings üreticinin yönergelerine göre bu adımda, Fc-bloklu kuluçka tarafından azaltılabilir; ve (3) izotip kontrol stainings genellikle birincil antikorlar doğrudan bir fluorophore ile ve/veya ilgi antigen(s) ayrı nüfus üretmek zaman Birleşik kullanırken gerekli değil. - Her şey için 130 µL FACS arabelleği ekleyin ve 400 x g 4 ° C'de 5 min için plaka santrifüj kapasitesi Süpernatant gibi daha önce açıklanan (Adım 4.3) ve hücre topakları 150 µL FACS arabelleği ile iki kez yıkayın atın.
Not: çekimsiz bir birincil antikor veya biotin için Birleşik bir birincil antikor kullanıyorsanız, o zaman bir fluorophore için Birleşik bir uygun ikincil reaktif bu noktada eklenebilir ve adımlar 4.4-4.5 yinelenir. Bu protokol söz konusu olduğunda, MHC sınıf II CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5 ile birlikte veya CD68-APC ve F4/80-PE/Cy7, birlikte sırasıyla algılama streptavidin-PE/Cy7 veya Streptavidin-PerCP kullanıldı. - Son yıkama adım sonra fiksasyon için PBS (pH 7,4) %4 paraformaldehyde 100 µL hücre granül resuspend. Plaka 10 min için buz üzerinde kuluçkaya ve vasıl 400 x g 4 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Yukarıda açıklanan (adım olarak 4.3) süpernatant atın ve hücre topakları bir kez 150 µL FACS arabelleği ile yıkayın.
Dikkat: Paraformaldehyde toksik; eldiven ve gözlük, vbgibi uygun koruma giymek.
Not: hücre topakları 150 µL FACS arabellek ve iki güne kadar 4 ° C'de ışık korunuyorsunuz mağaza içinde Resuspend. Hiçbir hücre içi boyama gerekiyorsa, 4.11 400 x g 4 ° C'de 5 min için plaka centrifuging sonra tutamaçlarından - Hücre içi boyama için hücre topakları FACS buffer+0.5% deterjan 150 µL içinde resuspend ve 15 dakika santrifüj 400 x g de plaka 4 ° C'de 5 dakika süreyle ışık korunuyorsunuz oda sıcaklığında kuluçkaya Yukarıda açıklanan (adım olarak 4.3) süpernatant atın ve hücre Pelet kez 150 µL FACS arabellek + %0.5 deterjan ile yıkayın. Hücre Pelet FACS buffer+0.5% deterjan faiz (CD68-APC, CD206-PE) antikorları içeren 20 µL içinde resuspend ve kuluçkaya, ışık, oda sıcaklığında 30 dakika korunuyorsunuz.
- Her şey için 130 µL FACS buffer+0.5% deterjan ekleyin ve 400 x g 4 ° C'de 5 min için plaka santrifüj kapasitesi Süpernatant gibi daha önce açıklanan (Adım 4.3) ve hücre topakları iki kez 150 µL FACS arabellek + %0.5 deterjan ile yıkayın atın.
Not: bir çekimsiz birincil antikor veya biotin için Birleşik bir birincil antikor kullanıyorsanız, o zaman bir fluorophore için Birleşik bir uygun ikincil reaktif bu noktada eklenebilir ve adımları 4,9-4,10 tekrarladı. - Hücre topakları ışığa, iki güne kadar 4 ° C'de korunuyorsunuz 150 µL FACS arabellek + %0.5 deterjan ve mağaza, resuspend.
- Hücre topakları 150 µL FACS tampon + 5 µg/mL ile DAPI takıma % 0.5 deterjan ile resuspend ve oda sıcaklığında ışıktan korunan 5 min için kuluçkaya. 400 x g 4 ° C'de 5 min için plaka santrifüj kapasitesi Daha önce açıklandığı gibi süpernatant (Adım 4.3) atmak.
- Hücre topakları 150 µL PBS ve uygun şekilde etiketli bir FACs tüp transfer resuspend. Analiz için hazır kadar gelen ışık, korumalı oda sıcaklığında saklayın.
Not: DAPI sinyal kaybına yol açan DNA, yavaş yavaş ayırmak bu yana PBS içinde resuspension sonra hücreleri saat içinde analiz edilmelidir.
5. Kurulum Akış Sitometresi ve çalışan örnekleri
- Akış Sitometresi uygun lazerler ile donatılmıştır ve/veya filtre hücreleri leke için kullanılan fluorophores ölçmek için ayarlar olduğunu emin olun. Bu varsayılan sitometresi yapılandırma sistemi altında belirlenebilir. Bu iletişim kuralı durumunda hücreleri üç lazerler ile donatılmış bir Akış Sitometresi kullanarak analiz edildi (405 nm, 488 nm ve 633 nm) ≤ tespiti için 5 fluorophores izin verme.
- Uygun kanallar fluorophores ilgi algılanması için seçin. Tüm floresan sinyallerini en iyi Logaritmik güçlendirme ile tespit edilir.
- Örnekleri için bir uygun akış hızı seçin. Bu parametre kullanılan sistem bağlı olarak değişebilir ve ampirik olarak tespit edilmelidir. Bu iletişim kuralı olması durumunda, MED-HI (35-60 µL/dak) bir Debi iğne tıkanmasını önlemek için kullanıldı.
- Örnek tahsil edilecek olaylar/hücre toplam sayısını seçin. Olayları en az sayıda 1.000.000 olmalıdır.
- Scatter araziler altında SSC-a karşı genel bir çalışma sayfası oluşturmak FSC-A, FCS-A. karşı ilgi her fluorophore için de Olaylar ve seçili fluorophores için ortalama floresan yoğunluğu (MFI) sayısını görüntüler istatistik bir görünüm oluşturun.
- En küçük hücre alt sol yüzde 10'u dağılım çizim uygun voltaj FSC-BIR ve SSC kanal ayarlayın. Arka plan Floresans ve en az örnek Floresans siyatik sinir veya üst (P1) kapısı dağılım dayalı karar vermek DRGs. günahı denetimlerinden salt DAPI gelen arsa belirleme denetimleri boyama.
Not: Bu bir koleksiyon kapı nedeniyle kısmen, PNS DAPI + kalabalıkta türdeş olmayan doğası değil. - FSC dağılım kullanarak her fluorophores ilgi için arsalar, böylece günahı kontrol hücreleri içinde onların anılan sıraya göre dağılım parsel çeyrek daha düşük voltaj ayarlayın. Gates bu durumda, her ilgili işaretleri/fluorophores için pozitif hücreleri tanımlamak için bu bölge üzerinde oluşturulur. Bir kapı yerleşimini tek lekeli denetim (Adım 4.1) çalıştırarak doğrulanır.
Not: emisyon spectra örtüşen için tazminat bu noktada gerçekleştirilen veya uygun analiz yazılımı ile geriye dönük olarak uygulanır. - Akış Sitometresi, açıklandığı gibi henüz belirlenmedi sonra örnekleri çalıştırabilirsiniz.
- Koşmak sonra kalan örnek malzeme atılır ve FCS dosyaları daha ayrıntılı bir çözümleme için verilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre süspansiyonlar tam uzunlukta siyatik sinirleri ve tüm büyük DRG hazırlanan, protokole göre altı sağlıklı C57BL/6 fare ve boyama için üç eşit aliquots ayrıldı. DNA lekeleri, DAPI ile boyama sayaç için bir tek hücre nüfus (şekil 1A-B, üst paneli) algılama sağlar. Akış Sitometresi göre analiz önce DAPI dışarı yıkama bir ölçüde ayrı nüfus seçimi için tek parçalanmayabilir olaylar veya gömlek FSC-eksen üzerinde sağlar sigara parçalanmayabilir enkaz, floresan yoğunluğu azaldı. PNS gelen gömlek büyük aralığı FSC ve SSC (şekil 1 c) üzerinde dağıtılmış olarak koleksiyon geçidi yok uygulanır. Eksik olarak içeren FSC eksen yüksek ucunda malzeme doku sindirilmiş, singlet nüfus (şekil 1A-B) seçiminde dışlanması gerekir. Sonuçları görüntülemek için bir yoğunluğu Arsa (alt paneli) kullanarak büyük enkaz (alt paneli) hariç kolaylaştırabilir. ≥ 30.000 gömlek toplam düzenli olarak iki tam siyatik sinir ve ≥200 elde edilebilir, 000 gömlek DRGs (şekil 1 d) elde edilebilir. Böylece bu hücreleri hematopoetik kökenli (şekil 2A) lökosit tanımlama DRGs yaklaşık % 5-10 bulunmuştur ise siyatik sinir gömlek yaklaşık % 5'i CD45 onların yüzeyinde, dile getirdi.
CD45 çoğunluğu+ gömlek da MHC sınıf II, kademeli bir şekilde (şekil 2B) dile getirdi. DRGs, CD11b mikroglial gibi hücreleri tespit etmek için kullanılabilir (CD45dim, MHCII+ ve CD11b+) (şekil 2B, üst panel). Ancak, bu microglia nüfus yoktur siyatik sinir (şekil 2B, alt panel) üzerinden. Bir PNS CD45 ifade gömlek çoğu CD68+ makrofajlar. Siyatik sinir ve DRG gömlek % 2-5 CD68 ifade edilir (şekil 3A). Tüm hücreleri CD68 da ifade CD45 ifade (veri gösterilmez). DRGs, CD68,+ makrofajlar daha her iki MHC kendi ifadesinde heterojen daha siyatik sinir (şekil 3B-D) Sınıf II ve CD206, M2 makrofajlar, avans. Siyatik sinir çoğu makrofajlar birlikte ifade MHC sınıf II ve CD206 (şekil 3B-D, alt panelleri); genellikle, CD68 yaklaşık % 60-80+ makrofajlar ifade CD206, CD68 daha küçük bir kısmı+ birlikte CD206 DRGs (şekil 3B) içinde ifade. İlginçtir, M1 makrofaj işaret CD86 ne makrofajlar sinir dan ne de PCL (veri gösterilmez) üzerinden herhangi bir olumlu boyama oluşturmadı. Makrofaj marker, F4/DRG ve siyatik sinir (şekil 3B-C), türdeş olmayan bir ifade gösterdi CD68 bir kısmı boyama 80,- ve MHCII- hücreleri. Ayrıca, F4/80 ifade tam olarak CD68 ifade ile üst üste değil.
Şekil 1: Akış Sitometresi Analizi DAPI lekeli temsilcisi verileri parçalanmayabilir DRG ve siyatik sinir hücrelerinden. Tüm olayları toplanan, scatterplots (üst paneli) veya yoğunluğu (alt paneli),(a)DRG veya (B) siyatik sinir (SN) bir temsilci fare çizer gibi gösterildi. Oklar alt panelinde üst FCS eksen malzeme hariç kapıları, gösterir. (C) arka-geçişi hücrelerin DAPI-SSC FSC dağılım çizim(a)panelinde gösterilen kapısında (tekli), toplanan. SN ve altı sağlıklı C57BL/6 fare üzerinden tüm büyük DRG gömlek (D) sayısı. Verileri temsil eden ortalama ± SD Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Akış Sitometresi Analizi CD45, MHC sınıf II, yüzey ifade ve CD11b üzerinde gömlek DRG ve siyatik sinir. DAPI-gate (tekli) şekil 1 ' de gösterilen seçilen olayları analiz edildi. Siyatik sinir (SN) CD45 ifade gömlek(a)oranı ve DRG altı kontrol fare üzerinden. Gömlek DRG (üst paneli) ve SN (alt paneli), (B) temsilcisi dağılım grafiğini çizer. CD11b ifade hücreleri mavi renkle gösterilir. Verileri temsil eden ortalama ± SD Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Akış Sitometresi Analizi CD68, MHC sınıf II, yüzey ifade ve CD206 üzerinde gömlek DRG ve siyatik sinir. DAPI-gate (tekli) şekil 1 ' de gösterilen seçilen olayları analiz edildi. (A)oranı altı sağlıklı C57BL/6 fareler siyatik sinir (SN) ve DRGs CD68 ifade gömlek. (B) CD206 SN ve DRG altı sağlıklı C57BL/6 fare ortak ifade CD68 oranı+ makrofajlar. Gömlek DRG (üst paneli) ve CD68 ve MHC sınıf II ifade gösterilen SN (alt paneli) ve (C) temsilcisi scatter araziler. Gömlek DRG (üst paneli) ve CD68 ve CD206 ifade gösterilen SN (alt paneli) ve (D) temsilcisi scatter araziler. F4/80 ifade hücreleri kırmızı renkle gösterilir. Verileri temsil eden ortalama ± SD Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Siyatik sinir lipidler, kolesterol, miyelin aksonlar çevresinde içeriği nedeniyle gibi büyük bir oranda içerir. Bu yana sıcaklık ile lipidler özelliklerini değiştirmek, farklı sonuçlar farklı sıcaklıklarda alınabilir. Hücre koruma sağlamak için tüm merdiven içinde bu protokolü sindirim sonra buz üzerinde gerçekleştirilmiştir. Tutarlılık sonuçları tekrarlanabilirlik iyiliği için tavsiye edilir iken, 3,6 ve 3,7 oda sıcaklığında adımları uygulayarak verim artışı mümkün olabilir. Adımda 3.8 sinirler yeterince sindirmek değil, küçük parçalar halinde sinir mesh görünür hale gelir. Yetersiz sindirim durumunda mesh muhafaza malzemesi 250 µL sindirim medya ve yinelenen adımlar 3.2-3.6 içeren yeni bir 1,5 mL tüp aktararak yeniden sindirilir olun. Mesh ekran (Adım 3.6) üzerinden geçen trypan mavi ışık mikroskop altında görülmesi gerektiğini sonra verim yoksul, daha sonra hücre süspansiyon, bir örnek ise. Uygun, Sigara-mavi, hücreleri aksonlar oluşuyor çubuk benzeri yapıları ile birlikte görünür olmalıdır. Hiçbir hücrelerin varsa, o zaman sindirim koşullar ve/veya yanlış malzeme teslim var neden nekroz. O zaman büyük toplamları görülebilir yalnızca, Santrifüjü tarafından malzeme toplamak ve sindirim (Adım 3.2-3.6) tekrar tavsiye edilir.
Fare siyatik sinir ve DRGs Akış Sitometresi Analizi yöntemi tüm sinirler ile ilgili sorular için yararlıdır ve birkaç DRGs kullanarak PNS analizini artan bir ilgi oldu. son zamanlarda Akış Sitometresi11,12 . Liu ve ark. papain ve siyatik sinirleri ve özellikle sinir bölümünü 1 cm kadar az analiz için 21 G ve 23 G kullanarak, böylece belirli sitelerden sinir malzeme analizi için izin DRGs mekanik ayrışma kullanarak bir yöntem geliştirdik yaralanma11. PNS etkisi sistemik, neurotoxicology ve genetik modellerini nöropati veya diyabet gibi kronik hastalıklarda olduğu gibi olması bekleniyor burada sunulan yöntem kullanım için önerilir. Nedeniyle düşük verim çekirdekli hücre siyatik sinir elde bu bireysel bir fare olaylardan geçişli küçük nüfus ≤ 100 ile çalışmaya girişimi için tavsiye edilmez. Ancak, birkaç fare malzemeden havuzu böyle küçük nüfus sinir içinde çalışma kolaylaştırmak. Yine de, papain ve 21 G/23 G iğneler kullanarak tekrar tekrar enzimatik doku ayrılma Liu ve ark. tarafından açıklanan olup olmadığını araştırmak ilgi olacak 11 Akış Sitometresi çekirdekleri, boyama ile tek hücreleri verimini artırmak için bu çalışmada, açıklandığı gibi birlikte. Çok az miktarda doku analiz yeteneği ipsi ve kontralateral DRGs tek taraflı siyatik sinir axotomy takip arasında karşılaştırma yapmak için önemlidir. Ancak, bu bu çalışmada kapsamý dýþýndadýr. İlginçtir, makrofajlar tanımlaması için yaygın olarak kullanılan işaretleri fareler PNS beklenmedik bir şekilde türdeş olmayan bir ifade için bulunamadı. Örneğin, CD11b ve F4/80 her ikisi de hematopoetik sigara, Sigara-antijen siyatik sinir ve DRGs hücreleri sunulması büyük bir kısmı ifade edilebilir bulunmuştur. Ayrıca, içinde siyatik sinir, tüm CD68+ makrofajlar ifade CD11b ve F4/80, diğer organlara kursundan beklendiği gibi. Bu nedenle bu işaretleri PNS makrofajlar incelenmesi için kullanırken dikkat alınır ve CD163 gibi diğer işaretleri araştırılmalıdır önerilir. Ayrıca, enzimatik ayrılma farklı işaretlere duyarlılığını da farklar için bir açıklama ifade, örneğin CD11b veya F4/80 ile gözlenen bu belki olarak kurulmalıdır.
Bu iletişim kuralı PNS bağışıklık hücreleri ile streptozotocin (STZ)13, kemirgen canlılar diyabet indüksiyon için yaygın olarak kullanılan bir kimyasal toksik meydan okuma sonra analiz etmek için daha önce kullanılmış. Bu TRPV1 ve TRPA1'ı etkinleştirir, STZ başlangıçta bağışıklık hücreleri tükenmesi siyatik sinir ve DRGs, herhangi bir iltihap sinir mucip değil iken neden olduğu gösterilmiştir. Her ne kadar iyileşti DRGs bağışıklık hücreleri, bağışıklık hücreleri ve özellikle makrofajlar numaraları hala önemli ölçüde tükenmiş üç hafta toksik meydan sonrası. Daha sonra olan o makrofaj fagositoz sinir enkaz, iyon kanal hyperexcitability tarafından sakatlıktan kaynaklanan genel hücre popülasyondan onların tükenmesi sonuçlanan makrofajlar, Apoptozis yol açmış olabilir. Diğer periferik sinir toksinleri sinir ikamet makrofajlar etkilemesi bilinen değil. Makrofajlar tükenmesi gibi ajanlar ortak bir sonucu ise bu tedavi için etkilerine sahip olabilir.
Bu bulundu sinir çekirdekli hücrelerden sadece 5-%10 lökosit hematopoetik kökenli idi. Kalan hücreleri muhtemelen diğer sinir hücresi türlerinin bir karışımını, yani Schwann hücreleri, perisitlerden, fibroblastlar ve endotel hücreleri. Birden çok parametre ve orada belirli işaretleri ve/veya antikor mevcut, bu hücre türleri bu yöntem kullanılarak da analiz edilebilir ki akla bunu sağlayan ölçmek için kapasitesi Akış Sitometresi sistemleri nedeniyle. Bu yöntem için fare malzeme tarif edilmiştir. Ancak, bazı değişikliklerle bu Ayrıca PNS malzeme domuz ve insan analizi için kullanılmıştır. Bu yöntem gelecekte türlerden fareler büyük malzeme analizi için daha yararlı olacağını tahmin edilmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar bu çalışmada açısından hiçbir çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Bu çalışmada Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; tarafından desteklenen SFB1118). Yazarlar Axel Erhardt diseksiyon çoğunu gerçekleştirmek ve yardımsever bu bilgi verici ve Dr Volker Eckstein Akış Sitometresi teknik açıdan yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve - tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
- DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neuroscience. 302, 174-203 (2014).
- Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C.
- Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
- Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
- Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
- Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
- Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies? Glia. 64, 475-486 (2016).
- Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
- Leong, T. Y. -M., Leong, A. S. -Y. How does antigen retrieval work? Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
- Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
- Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).
- Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).
