Summary
التحليل الكمي لمحتوى الخلية داخل العصب الوركي مورين أمر صعب نظراً لندرة هذه الأنسجة. ويصف هذا البروتوكول وسيلة لهضم الأنسجة والإعداد التي توفر خلايا كافية للتحليل الخلوي تدفق السكان الخلايا المناعية من الأعصاب من الفئران الفردية.
Abstract
الخلايا المناعية المقيم في الأعصاب في الجهاز العصبي المحيطي (PNS) ضرورية للحفاظ على سلامة الخلايا العصبية في عصب صحية. الخلايا المناعية من السندات الإذنية تتأثر بالإصابة والمرض، والتي تؤثر على وظيفة العصب وقدرتها على التجدد. عادة يتم تحليل الخلايا المناعية العصبية من الفلورة (إذا كان). بينما إذا كانت ضرورية لتحديد موقع الخلايا المناعية في العصب، إذا كان فقط نصف الكمية والأسلوب الذي يقتصر على عدد العلامات التي يمكن تحليلها في وقت واحد ودرجة التعبير السطحي. واستخدمت في هذه الدراسة، التدفق الخلوي للتحليل الكمي لتسلل الكريات البيض إلى الأعصاب الوركي أو الجذرية الظهرية جانجليونس (باﻷسعار) من الفئران الفردية. تم إجراء تحليل خلية مفردة باستخدام DAPI وحللت العديد من البروتينات في نفس الوقت للتعبير سواء السطحية أو داخل الخلايا. ولدت الأعصاب الوركي كلا من الماوس واحدة التي يعاملون وفقا لهذا البروتوكول ≥ 30,000 الأحداث الأنوية وحيدة. نسبة الكريات البيضاء في الأعصاب الوركي، يحددها التعبير عن CD45، كان حوالي 5% محتوى خلية الإجمالي في العصب الوركي وحوالي 5-10% في الرسم. على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز أساسا على السكان الخلايا المناعية داخل السندات الإذنية، مرونة التدفق الخلوي لقياس عدد من علامات في وقت واحد يعني أن السكان خلايا أخرى موجودة داخل العصب، مثل خلايا شوان، بيريسيتيس ، الخلايا الليفية، وخلايا بطانية، يمكن أيضا أن تحلل باستخدام هذا الأسلوب. ولذلك توفر هذه الطريقة وسيلة جديدة لدراسة التأثيرات الجهازية على السندات الإذنية، مثل نيوروتوكسيكولوجي والنماذج الوراثية للاعتلال العصبي أو الأمراض المزمنة، مثل داء السكري.
Introduction
الخلايا المناعية التي أدخل السندات الإذنية من التداول، حسب تعريف التعبير عن CD45 و CD11b، يساعد على المحافظة على سلامة العصب وتلعب دوراً على حد سواء في التجدد وانحطاط1. يمكن أن تكون منحرفة الضامة (المعرفة بواسطة التعبير عنها من CD68 في الماوس) نحو النمط الظاهري تحريضية، التعبير عن MHC أكثر من الدرجة الثانية و CD86 على سطحها (M1)، أو نحو النمط الظاهري للالتهابات، معربا عن مزيد من CD206 داخل الخلايا (M2)2 . انحراف من النمط الظاهري بلعم عملية دينامية وينظم من خلال Akt مما يشير إلى3، والتي تعكس مختلف مهام الضامة في الدفاع ضد العوامل الممرضة (M1) والدور في تجديد الأنسجة (M2). يتطلب التجديد العصب المتضرر أولاً البلعمه حطام المايلين التي الضامة في العصب4،5، والالتهابات (CD68+CD206+) أظهرت الضامة M2 لتعزيز ثمرة إكسون في 6من السندات الإذنية. انخفاض التوظيف أو الضامة للسندات الإذنية، أو قد يؤدي ضعف القدرة على البلعمه في التجدد البصر والحفاظ على سلامة الأعصاب. التهابات الضامة M1، التعبير عن MHC الدرجة الثانية، أقل قدرة على البلعمه من الضامة M2، والتهاب الخلايا العصبية المتورطة في الآلية المرضية لعدة أمراض الأعصاب7.
التغييرات التي تحدث للأعصاب المناعي المقيم نتيجة للأضرار التي قد تكون كمية، يظهر في فقدان CD45+ الكريات البيضاء (أو زيادة تسلل CD45+ الكريات البيضاء في حالة التهاب)، أو نوعية، مثل تغيير النمط الظاهري بلعم من M2 إلى النمط الظاهري M1. قد تم تحليلها في خلايا المناعة من السندات الإذنية تقليديا عن طريق إذا، استخدام الأجزاء المجمدة أو المواد جزءا لا يتجزأ من البارافين8. إذا كانت مطلوبة من أجل تحديد ترجمة الخلايا للفائدة. ومع ذلك، استخدام القياس الكمي إذا غالباً ما يعتمد على عد عدد صغير نسبيا من الخلايا في مقطع ضيقة للأنسجة، مما يجعل التقدير الكمي لا يمكن الاعتماد عليها وعرضه لتحيز الانتقاء. للتعرف على مجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية، تزامن الكشف عن علامات خارج الخلية و/أو داخل الخلايا المطلوب، بينما يتطلب تحديد النمط الظاهري بلعم علامات على الأقل اثنين على الأقل، على وجه التحديد، CD206 و MHC الفئة الثانية. كما الأكثر شيوعاً مجاهر المتاحة تقتصر على قنوات الألوان اثنين على الأقل، مثل fluorescein isothiocyanate (فيتك) وفيكوريثرين (PE)، وصف مجموعات فرعية محددة من الخلايا المناعية التي إذا يمكن أن تتطلب التقييدية وغير مكتملة، الحاجة إلى وجود عدة شرائح، مستمدة من نفس المنطقة من الفائدة، الملون، وحلل بالتوازي. هذا الجانب تستغرق وقتاً طويلاً ولذلك لا تصلح اللازمة لتحليل عينات كبيرة من مجموعات. وعلاوة على ذلك، أن معظم من علامات الاهتمام من خارج الخلية، يمكن الكشف في الأنسجة، والتي أما تم تضمينها في البارافين أو كريوكونسيرفيد، إشكالية بسبب الإخلال بسلامة الغشاء والإخفاء من [ابيتوبس]، فضلا عن فقدان مولدات المضادات للفائدة من استخدام المذيبات، مثل الأسيتون والميثانول9.
في المقابل، التدفق الخلوي، الذي يقيس الضوئية والأسفار خصائص الخلايا المفردة في تعليق كما أنها تمر عبر شعاع من الضوء، يوفر وسيلة أكثر عملية وشاملة لتحليل السكان الخلية. التدفق الخلوي، بدلاً من إنتاج صورة رقمية للأنسجة، ويقدم القياس الكمي الآلي لتعيين المعلمات، التي تشمل الحجم النسبي للخلية ومؤشر يعكس، يشار إلى الأمام مبعثر (FSC)، تعقد الحبوبية/الداخلية أو الجانب-مبعثر (SSC)، وكثافة نسبية الأسفار، توفير أن الخلية قد وصفت مع فلوروفوري مناسبة، مثل جسم مترافق. Cytometer تدفق نموذجي يتكون من اثنين، الليزر تبريد الهواء؛ ليزر أرجون وتنتج الضوء الأزرق في 488 نانومتر وليزر هيليوم نيون ينتج ضوء في 633 نانومتر. هذه التركيبة تسمح لكشف وقياس، وفي نفس الوقت، مالا يقل عن خمسة أهداف على السطح أو داخل المقصورة داخل الخلايا. يمكن أن تتكون سيتوميتيرس تدفق أكثر تقدما من أشعة الليزر المتعددة، والتي تسمح للكشف عن فلوروتشروميس مختلفة تصل إلى ثمانية في وقت واحد، مما يوفر عدم تداخل موجات انبعاثات الذروة من فلوروتشروميس المحدد إلى حد كبير.
لتحليل بالتدفق الخلوي، الأنسجة للفائدة يجب أولاً أن انزيماتيكالي يهضم، عموما مع كولاجيناز، توليد تعليق خلية واحدة. تحليل مورين الوركي الأعصاب كانت صعبة بسبب كمية صغيرة من الأنسجة التي تم الحصول عليها من كل الماوس. وباﻹضافة إلى ذلك، محتوى الدهون عالية المايلين حول محاور عصبية يعوق الانتعاش الخلية وتنتج كميات كبيرة من الحطام. الأسلوب الموصوفة هنا لإعداد العصب الوركي والهضم تم تكييفها من بروتوكول عزل خلايا شوان المشبك et al. 7، ويهدف إلى عزل خلايا كافية من أعصاب الفئران الفردية لتحليل التدفق الخلوي، بغية الحد من التباين بين الفئران. استخدام DAPI لتحديد خلايا مفردة في خلاصة النسيج الخام التي تلتف على ضرورة إزالة الحطام إكسون، الأمر الذي يؤدي عادة إلى فقدان الخلية. الغسيل عدة مرات مع الإيدز عازلة المنظفات الغنية في الإفراج عن الخلايا محاصرين داخل الحطام الدهنية، مما يؤدي إلى زيادة المحصول. الهضم من كلا الأعصاب الوركي كاملة الطول من ماوس واحدة وفقا لهذا البروتوكول يولد إيه ثري زيرو، 000 الأحداث الأنوية واحد وتم استرداد على الأقل 3 إضعاف هذا العدد من الرسم. نسبة CD45+ الكريات البيضاء بحوالي 5 في المائة محتوى خلية الإجمالي في الخلاصة العصب الوركي وحوالي 5-10% في الخلاصة DRG. غالبية CD45+ الخلايا في العصب الوركي أعرب عن علامات بلعم، CD68 و CD206.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأبقى في دائرة الضوء/الظلام ح 12 القياسية البرية من نوع C57BL/6 الفئران (الذكور؛ 10-12 أسبوعا) وتم توفير حرية الوصول إلى النظام الغذائي تشاو القياسية والمياه. جميع التجارب على الحيوانات كانت أجرته لجنة الاستخدام والعناية بالحيوانات المحلية وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة ووافقت عليها لجنة رعاية الحيوانات المحلية واستخدامها في الهيئة الإقليمية في كارلسروه، ألمانيا (G216/10).
1. نضح للماوس
- التضحية بالماوس (C57BL/6؛ الذكور؛ 10-12weeks) باستخدام CO2 أو وفقا للوائح المحلية.
ملاحظة: النزيف الرجعية-المداري يمكن إنجازها للحصول على تحكم الكريات البيضاء، استخدام الأنابيب المغلفة يدتا 1.5 مل. هذا الأسلوب من نزيف من كفاءة فورا بعد التضحية. يمكن أن يؤديها التجويف الصفاقى، وكذلك الغسل (PCL) للحصول على مراقبة الضامة، استخدام برنامج تلفزيوني ساخن مسبقاً في 37 درجة مئوية لتجنب تراص الباردة من الدم، والتي قد تعيق التروية. - تطهير الماوس برش الفراء في البطن متحررا مع 70% v/v الإيثانول ومسح مرارا وتكرارا مع أنسجة مع شاش القطن. باستخدام مقص غير حادة، تقطع فتح في جلد البطن بشق طولي.
- كشف التجويف الجنبي بأول إجراء شق في الحجاب الحاجز باستخدام مقص منحنى، كليلة وثم توسيع شق على الطول من القفص الصدري. إجراء خفض مماثل في الجانب كونترالاتيرال حتى القص يمكن بعناية رفع بعيداً.
- مع رؤية واضحة للقلب والأوعية الرئيسية، إدراج قياس فراشة 23 إبرة، متصلاً بحقنه 50 مل مليئة ببرنامج تلفزيوني المثلج، في الدائرة اليسرى من القلب.
- جعل شق إلى الاذين الأيمن من القلب باستخدام مقص آيريس لخلق كبير من منفذ ممكن دون الأضرار بالشريان الاورطي تنازلي، وثم بلطف خفض المحاقن للمضي قدما نحو 30 مل من برنامج تلفزيوني. يجب أن يشغل الإفرازات واضحة. تطهير الكبد و/أو الكلي يمكن استخدامها كمؤشر التروية الجيدة.
2-تشريح العصب الوركي والرسم
ملاحظة: بالنسبة لتشريح الأعصاب الوركي، الجلد أعلاه عضلة يتم إزالة مكسيموس والماوس وضع الجانب البطني أسفل بينما تمتد السفلية.
- على الصعيد الثنائي تشريح الأعصاب الوركي كله بفصل أنسجة العضلات من الفخذ الظهرية العليا، ومتابعة العصب على طول العمود الفقري. قطع العصب حيث أنه يخرج من العمود الفقري، ومباشرة فوق الركبة في الطرف الآخر.
ملاحظة: تجنب المناولة المفرطة للعصب مثل سحق أو سحب مع الملقط. - باستخدام الملقط، نقل nerve(s) قصت، حوالي 2 سم كل الأعصاب، إلى 1.5 مل أنبوب يحتوي على 1 مل برنامج تلفزيوني المثلج ومخزن على الجليد.
ملاحظة: العصب يمكن تخزينها بين عشية وضحاها على الجليد.
ملاحظة: لتشريح الرسم، استخدام الملقط ومشرط، فصل الجلد من الأنسجة اللينة الكامنة التي يسقط بلطف الجلد الخلفية المتبقية للكشف عن سرطان عنق الرحم والصدر وأسفل الظهر مناطق العمود الفقري. إزالة الرأس بالقطع الموجودة في قاعدة الجمجمة باستخدام زوج حادة مقص. - قص أضلاعه متوازية مع وعلى مقربة من العمود الفقري في كلا الجانبين، قبل فصل في الأحشاء متصل بالجانب الأمامي من العمود الفقري. قص قصبة وإزالة العمود الفقري بعرضي خفض مستوى قصبة. باستخدام مقص آيريس، قطع بعيداً أي العضلات والدهون، والأنسجة الناعمة الأخرى من العمود الفقري.
- مكان العمود الفقري مع الجانب الظهرية مواجهة وفتحه، بدءاً من نهاية والذيلية، بانزلاق طرف واحد مقص في القناة الفقري في موقف 03:00 ص وعظم مقصوص. كرر هذا الإجراء في موقف 09:00 ص.
ملاحظة: من المهم قص بالضبط في مركز لتجنب إتلاف في الرسم. - كرر القطع من جنبا إلى جنب حتى يتم الوصول إلى نهاية روسترال والحبل الشوكي يتم كشفها تماما. استخدام مجهر تشريح، إزالة النخاع الشوكي لفضح الأعصاب العمود الفقري، والتي يمكن استخدامها لتحديد موقع باﻷسعار داخل العمود الفقري.
- إزالة باﻷسعار القطني التي تشيد بلطف على الجذر الظهرية سحب الرسم في قنوات الفقري، ثم قطع الأعصاب والأنسجة الضامة مع قزحية مقص لإزالة باﻷسعار.
ملاحظة: من الممكن لتقييد جمع "الرسم" L4-L6، التي تسهم في العصب الوركي. - استخدام الملقط، نقل باﻷسعار إلى أنبوب 1.5 مل تحتوي على حوالي 1 مل من برنامج تلفزيوني المثلج، وتخزين على الجليد.
ملاحظة: العصب يمكن تخزينها بين عشية وضحاها على الجليد.
3-الهضم العصب الوركي والرسم
- تعد وسائل الإعلام الهضم (دميم، 10 مم حبيس، 5 ملغ/مل جيش صرب البوسنة، كولاجيناز 1.6 ملغ/مل نوع 4) تستكمل مع 100 ميكروغرام/مل ديوكسيريبونوكليسي، ومخزن على الجليد.
ملاحظة: كمية متوسطة الهضم المطلوبة للماوس (الأعصاب الوركي + باﻷسعار) 1 مل. وبمجرد إعداد، يمكن تخزين مختبرين لوسائط الإعلام الهضم عند-20 درجة مئوية. - نقل الأعصاب الوركي وبالاسعار من الماوس واحد في أنابيب منفصلة 1.5 مل تحتوي على 500 ميليلتر لوسائل الإعلام في الهضم. للأعصاب الوركي، ختم المواد إلى 15-20 قطعة باستخدام مقص الربيع واحتضان ثم تعليق الأنسجة في حاضنة تهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع الانفعالات لطيف (≤ 450 لفة في الدقيقة).
- تريتوراتي مرارا وتكرارا بتعليق خلية عن طريق ميليلتر 1,000 ماصة تلميح إلى أيوناتها ميكانيكيا أي أنسجة غير كامل الهضم.
ملاحظة: إذا كان من الصعب الوقف تيتراتي، ثم قطع طرف الماصة مع مقص لخلق وضع نهاية غير حادة. احتضان تعليق الأنسجة في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع الانفعالات لطيف (≤ 450 لفة في الدقيقة). - كرر تريتوريشن من خلال تلميح ماصة ميليلتر 1,000 واحتضانها لمزيد 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الانفعالات لطيف (≤ 450 لفة في الدقيقة).
- إعداد المخزن المؤقت نظام مراقبة الأصول الميدانية (برنامج تلفزيوني وتستكمل مع يدتا FCS ومم 1 10%)، وتخزين على الجليد. شطف ونقع على شاشة الفولاذ المقاوم للصدأ مع حجم فتحات الشباك من 140 ميكرون مع المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية في 60 × 15 ملم طبق بيتري على الجليد.
ملاحظة: ينبغي تجنب مرشحات النايلون الشاشة كما أنه يؤدي إلى خسارة كبيرة في إنتاج الخلايا المنواه. - مرارا وتكرارا تمرير المعلقات الأنسجة من خلال مرشح الشاشة 140 ميكرون، كما يقام على طبق بيتري، مع الملقط حادة، على الجليد. جمع تعليق خلية من طبق بيتري وتحويلها إلى أنبوب 1.5 مل جديدة المخزنة على الجليد.
- دفع أي أنسجة غير كامل الهضم التي تظل في عامل التصفية من خلال طريق تريتوريشن المتكررة مع تلميح ماصة ميليلتر 1,000. شطف التصفية الشاشة مرتين مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية وجمع تعليق الخلية الناتجة في طبق بتري الجمع مع تعليق خلية من الخطوة 3، 6.
ملاحظة: إذا كان سيتوميتير تدفق المستخدمة حساسة للحطام، يمكن تمرير تعليق خلية من الخطوة 3، 7 من خلال عامل تصفية شاشة 70 ميكرومتر؛ ومع ذلك، وهذا قد يؤدي إلى خسارة في عائد الخلايا المنواه. - الطرد المركزي من تعليق خلية في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية. كرر هذه الخطوة الغسيل مرة واحدة.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 150-350 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية، اعتماداً على العدد من تلطيخ هي المطلوبة (150 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت كل لوحة المصبوغة).
4-تلطيخ العصب الوركي والرسم مع الأجسام المضادة فلوريسسينتلي المسمى للتدفق الخلوي
- نقل 100 ميليلتر للعصب الوركي أو تعليق خلية الرسم إلى الخامس-تتشكل أيضا في لوحة 96-جيدا على الجليد.
ملاحظة: الخلايا الملطخة بمفرده ضرورية لجميع الأجسام المضادة المستخدمة أنها سوف توفر الضوابط اللازمة لإعداد قياس التدفق فيما يتعلق بالمكاسب الجهد (PMT) أنبوب ضوئي والتعويض، وكذلك فيما يتعلق بالمساعدة على تمييز محددة من الربط غير محددة. بسبب محدودية المواد المتاحة من العصب الوركي وبالاسعار، الدم الكريات البيضاء والضامة من PCL (خطوات 1.1-1.2) يمكن أن تستخدم الضوابط الملطخة بمفرده، وتلطيخ للذي ينبغي أن يجري بالتوازي مع تلطيخ من الوركي العصب وبالاسعار. - تجمع باقي الخلايا المعلقات (حوالي 50 ميليلتر كل عينة) من الأعصاب الوركي أو عينات الرسم، ليكون بمثابة عنصر تحكم أونستاينيد.
- الطرد المركزي اللوحة في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية بعكس اللوحة على بن وتطبيق حادة نفض الغبار من المعصم، واضغط برفق الجافة على مناشف ورقية.
- لتلطيخ السطحية، ريسوسبيند كل من الكريات الخلية في 20 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت الذي يحتوي على الأجسام المضادة للفائدة (CD45-A647، CD11b-بيركب/Cy5.5 و MHC Class الثاني-البيوتين) واحتضانها، محمية من الضوء، على الجليد لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: تمييع جسم الأمثل (1) ينبغي أن تكون مصممة قبل استخدامها قبل تنفيذ سلسلة تمييع وفقا للشركة المصنعة معلومات المنتج؛ (2) ويمكن تخفيض ستينينجس الخاصة بعدم بالحضانة مع كتلة Fc في هذه الخطوة، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة؛ وايستب (3) مراقبة ستينينجس عموما غير مطلوبة عند استخدام الأجسام المضادة الأولية مباشرة مترافق مع فلوروفوري و/أو عندما تنتج antigen(s) لمصلحة السكان متميزة. - إضافة 130 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لكل بئر والطرد المركزي اللوحة في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية كما تم وصفه سابقا (الخطوة 4، 3) وتغسل الكريات خلية مرتين مع 150 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
ملاحظة: إذا كان استخدام جسم مضاد أونكونجوجاتيد الأولية أو جسم الابتدائي مترافق إلى البيوتين، ثم يمكن إضافتها كاشف ثانوية مناسبة، مترافق فلوروفوري، في هذه المرحلة ويتم تكرار الخطوات 4.4-4.5. وفي حالة هذا البروتوكول، استخدمت streptavidin-PE/Cy7 أو ستريبتافيدين-بيركب للكشف عن MHC Class الثاني في تركيبة مع CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5، أو في تركيبة مع CD68--آسيا والمحيط الهادئ و F4/80-PE/Cy7، على التوالي. - للتثبيت، وبعد آخر خطوة الغسيل، ريسوسبيند الكريات الخلية في 100 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني (درجة الحموضة 7.4). احتضان لوحة على الجليد لمدة 10 دقائق وثم الطرد المركزي في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية كما هو موضح سابقا (الخطوة 4، 3) وتغسل الكريات الخلية مرة واحدة مع 150 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية.
تنبيه: بارافورمالدهيد السامة؛ ملابس الحماية المناسبة مثل القفازات والنظارات و ما إلى ذلك.
ملاحظة: ريسوسبيند الكريات الخلية في 150 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية ومخزن محمية من الضوء، عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى يومين. إذا كان مطلوباً لا تلطيخ داخل الخلايا، ثم الانتقال إلى الخطوة 4.11 بعد سينتريفوجينج اللوحة في ز 400 x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. - لتلوين داخل الخلايا، ريسوسبيند الكريات الخلية في 150 ميليلتر من المنظفات buffer+0.5% نظام مراقبة الأصول الميدانية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء على 15 دقيقة الطرد المركزي اللوحة في 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية كما هو موضح سابقا (الخطوة 4، 3) وتغسل بيليه الخلية مرة واحدة مع 150 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت + المنظفات 0.5%. ريسوسبيند بيليه الخلية في 20 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية buffer+0.5% المنظفات التي تحتوي على الأجسام المضادة للفائدة (CD68-آسيا والمحيط الهادئ، CD206-PE) واحتضانها، محمية من الضوء، في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- إضافة 130 ميليلتر من المنظفات buffer+0.5% نظام مراقبة الأصول الميدانية لكل بئر والطرد المركزي اللوحة في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية كما تم وصفه سابقا (الخطوة 4، 3) وتغسل الكريات خلية مرتين مع 150 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت + المنظفات 0.5%.
ملاحظة: إذا كان استخدام جسم مضاد أونكونجوجاتيد الأولية أو جسم الابتدائي مترافق إلى البيوتين، ثم كاشف ثانوية مناسبة، يضاف إلى فلوروفوري، يمكن إضافتها في هذه المرحلة، وتكرار الخطوات 4.9-4.10. - ريسوسبيند الكريات الخلية في 150 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية + 0.5% المنظفات ومخزن، ومحمية من الضوء، عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى يومين.
- ريسوسبيند الكريات الخلية مع 150 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت + 0.5% المنظفات وتستكمل مع 5 ميكروغرام/مل DAPI واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. الطرد المركزي اللوحة في 400 غرام x لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية كما تم وصفه سابقا (الخطوة 4، 3).
- ريسوسبيند الكريات الخلية في 150 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنبوب مناسب مسمى نظام مراقبة الأصول الميدانية. تخزين في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء، حتى جاهزة للتحليل.
ملاحظة: بعد تعليق في برنامج تلفزيوني، الخلايا ينبغي تحليله في غضون ساعات، منذ DAPI سوف ننأى ببطء من الحمض النووي، مما يؤدي إلى خسارة في إشارة.
5-الإعداد للتدفق الخلوي وتشغيل عينات
- ضمان أن سيتوميتير تدفق مجهز بأشعة الليزر المناسبة و/أو تصفية مجموعات قياس fluorophores المستخدمة لوصمة عار الخلايا. ويمكن تحديد هذا تحت التكوين الافتراضي سيتوميتير على النظام. في حالة هذا البروتوكول، حللت الخلايا باستخدام cytometer تدفق مجهزة بأشعة الليزر الثلاثة (405 نانومتر، 488 نانومتر، و 633 نانومتر) السماح للكشف عن ≤ 5 فلوروفوريس.
- تحديد القنوات المناسبة للكشف عن فلوروفوريس للفائدة. يتم الكشف عن جميع إشارات الفلورية أفضل مع التضخيم اللوغاريتمي.
- حدد معدل تدفق ملائم للعينات. هذه المعلمة يمكن أن تختلف تبعاً للنظام المتبع، وينبغي أن يحدد تجريبيا. وفي حالة هذا البروتوكول، استخدمت بمعدل تدفق ميد--إلى--مرحبا (35-60 ميليلتر/دقيقة) لمنع انسداد الإبرة.
- حدد العدد الإجمالي للأحداث/الخلايا التي سيتم جمعها كل عينة. ينبغي أن يكون الحد الأدنى لعدد من الأحداث 1,000,000.
- إنشاء التبعثر مؤامرات ضمن ورقة عمل عالمي للتعاون بين بلدان الجنوب-مقابل ألف منتدى التعاون الأمني، فضلا عن كل فلوروفوري من الفائدة مقابل FCS-ألف. إنشاء طريقة عرض إحصائية التي سيتم عرض العدد من الأحداث وشدة الفلورسنت يعني (MFI) ل fluorophores المحدد.
- قم بتعيين الجهد قنوات منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب-أ، مثل خلايا أصغر تناسب السفلي الأيسر 10% من مؤامرة مبعثر. تحديد خلفية الأسفار والأسفار عينة الحد الأدنى من الضوابط أونستاينيد من الأعصاب الوركي أو باﻷسعار. تحديد بوابة الأصل (P1) استناداً إلى مبعثر مؤامرة من DAPI فقط تلوين عناصر التحكم.
ملاحظة: هذا ليس بوابة جمع، يعود في جزء منه، إلى الطبيعة غير المتجانسة للسكان DAPI + في السندات الإذنية. - استخدام مبعثر منتدى التعاون الأمني مؤامرات لكل من فلوروفوريس للفائدة، وضبط الفولتية بحيث تندرج الخلايا لعنصر التحكم أونستينيد الربع أقل من مؤامراتهم مبعثر كل منهما. ثم يتم إنشاء بوابات فوق هذه المنطقة لتحديد تلك الخلايا التي إيجابية بالنسبة لكل من كل العلامات/فلوروفوريس. ويؤكد وضع بوابة تشغيل عنصر التحكم الملطخة بمفرده (الخطوة 4، 1).
ملاحظة: يمكن تنفيذها في هذه المرحلة تعويضاً عن تداخل أطياف الانبعاث أو تطبيق رجعي مع برمجيات التحليل المناسب. - بمجرد تم تعيين cytometer تدفق أعلى، كما هو موضح، يمكن تشغيل العينات.
- بعد التشغيل، يمكن تجاهل عينة المواد المتبقية ويمكن تصدير الملفات FCS لمزيد من التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وأعدت، وفقا للبروتوكول، من ستة صحية الفئران C57BL/6 تعليق خلية من كامل طول الوركي الأعصاب والرسم الرئيسية وتنقسم إلى ثلاثة مختبرين مساوية لتلطيخ. عداد تلطيخ مع DAPI، الذي بقع الحمض النووي، يسمح للكشف عن عدد السكان وحيد الخلية (الشكل 1A–ب، اللوحة العلوية). الغسيل DAPI، قبل تحليل التدفق الخلوي، انخفض إلى حد ما شدة الفلورسنت الأنقاض غير المنبسطة، مما يسمح لاختيار عدد السكان منفصلة خلال منتدى التعاون الأمني-محور الأحداث المنبسطة واحد أو نوع. يتم تطبيق لا بوابة جمع كنوع من السندات الإذنية موزعة على نطاق كبير من منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب (الشكل 1). هضم الأنسجة المواد على ارتفاع نهاية المحور منتدى التعاون الأمني، الذي يتضمن تنظيماً غير كامل، لا بد من استبعاد في اختيار القميص السكان (الشكل 1A–ب). قد ييسر استخدام قطعة كثافة (أسفل اللوحة) لعرض النتائج في استبعاد الحطام الكبيرة (أسفل اللوحة). يمكن الحصول على مجموعة نوع 30,000 ≥ بانتظام من اثنين من كامل الوركي الأعصاب وإيه تو زيرو زيرو، ويمكن الحصول على نوع 000 باﻷسعار (الشكل 1). من الأعصاب الوركي، أعرب حوالي 5% نوع CD45 على سطحها، في حين تم العثور على حوالي 5-10% في باﻷسعار، وبالتالي تحديد هذه الخلايا الكريات البيضاء الأصلية المكونة للدم (الشكل 2A).
أغلبية CD45+ نوع أعرب أيضا عن MHC الدرجة الثانية، بطريقة تدريجية (الشكل 2). في باﻷسعار، يمكن استخدام CD11b للكشف عن خلايا microglial مثل (CD45قاتمة، مهسيي+ و CD11b+) (الشكل 2B، اللوحة العلوية). إلا أن هذه الفئة من السكان microglia غائب من الأعصاب الوركي (الشكل 2B، لوحة أقل). أغلبية من نوع التعبير عن CD45 في السندات الإذنية هي CD68+ الضامة. في العصب الوركي والرسم، 2-5% نوع أعرب عن CD68 (الشكل 3A). كافة الخلايا معربا عن CD68 كما أعرب CD45 (البيانات لا تظهر). في باﻷسعار، CD68+ الضامة كانت غير متجانسة أكثر في التعبير عنها من كلا MHC الفئة الثانية و CD206، علامة للحصول على M2 الضامة، مما في الأعصاب الوركي (الشكل 3B–د). في الأعصاب الوركي، معظم الضامة المشترك أعرب MHC الفئة الثانية و CD206 (الشكل 3B–د، أفرقة أقل)؛ عادة، حوالي 60-80% CD68+ الضامة وأعرب عن CD206، بينما نسبة أصغر من CD68+ المشترك وأعرب عن CD206 في باﻷسعار (الشكل 3B). من المثير للاهتمام، علامة بلعم M1 CD86 لم يولد أي تلطيخ إيجابية لا على الضامة من العصبية ولا من PCL (البيانات لا تظهر). علامة بلعم، F4/80، وأظهر تعبير غير متجانسة سواء في الرسم أو في الأعصاب الوركي (الشكل 3B–ج)، تلطيخ نسبة من CD68– ، والخلايا مهسيي– . وعلاوة على ذلك، لا تتداخل التعبير F4/80 تماما مع التعبير CD68.
رقم 1: بيانات تمثيلية من التدفق الخلوي تحليل الملون DAPI المنبسطة الخلايا من الرسم والعصب الوركي. جميع الأحداث التي تم جمعها، أظهرت كما سكاتيربلوتس (اللوحة العلوية) أو كثافة مؤامرات (اللوحة السفلي)، من الرسم (أ) أو (ب) العصب الوركي (SN) واحدة بالماوس الممثل. تشير الأسهم في لوحات أقل إلى البوابات، باستثناء المواد التي في أعلى المحور FCS. (ج) العودة النابضة للخلايا التي تم جمعها في DAPI-البوابة (نوع)، يظهر في لوحة (A) في مؤامرة مبعثر SSC مقابل منتدى التعاون الأمني. (د) عدد من نوع من التعطيل والرسم الرئيسية كل من الستة صحية الفئران C57BL/6. وتمثل البيانات يعني ± التنمية المستدامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: التدفق الخلوي تحليل التعبير السطحي من CD45، MHC الدرجة الثانية، و CD11b على نوع من الرسم والعصب الوركي. وجرى تحليل الأحداث المحددة في DAPI-البوابة (نوع) هو مبين في الشكل 1 . (أ) نسبة نوع التعبير عن CD45 في العصب الوركي (SN) والرسم من ستة مكافحة الفئران. مبعثر الممثل (ب) قطع من نوع من الرسم (اللوحة العلوية) والتعطيل (أسفل اللوحة). يتم الإشارة إلى الخلايا معربا عن CD11b باللون الأزرق. وتمثل البيانات يعني ± التنمية المستدامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التدفق الخلوي تحليل التعبير السطحي من CD68، MHC الدرجة الثانية، و CD206 على نوع من الرسم والعصب الوركي. وجرى تحليل الأحداث المحددة في DAPI-البوابة (نوع) هو مبين في الشكل 1 . (أ) نسبة من نوع التعبير عن CD68 في العصب الوركي (SN) وبالاسعار من ستة صحية الفئران C57BL/6. (ب) نسبة CD68+ الضامة المشترك معربا عن CD206 في التعطيل والرسم من ستة صحية الفئران C57BL/6. (ج) ممثل التبعثر مؤامرات من نوع من الرسم (اللوحة العلوية) والتعطيل (أسفل اللوحة) عرض التعبير الثاني فئة CD68 و MHC. (د) ممثل التبعثر مؤامرات من نوع من الرسم (اللوحة العلوية) والتعطيل (أسفل اللوحة) عرض التعبير CD68 و CD206. يتم الإشارة إلى الخلايا معربا عن F4/80 مع اللون الأرجواني. وتمثل البيانات يعني ± التنمية المستدامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأعصاب الوركي تحتوي على نسبة كبيرة من الدهون، مثل نسبة الكولسترول في الدم، بسبب محتوى المايلين حول محاور عصبية. نظراً لتغيير الخصائص للدهون مع درجة الحرارة، يمكن الحصول على نتائج مختلفة عند درجات حرارة مختلفة. لضمان الحفاظ على الخلية، وكافة الخطوات في هذا البروتوكول بعد الهضم أجريت على الجليد. في حين ينصح باتساق من أجل إمكانية تكرار نتائج النتائج، قد يكون من الممكن زيادة الغلة قبل تنفيذ الخطوات 3.6 و 3.7 في درجة حرارة الغرفة. إذا لم يهضم بما فيه الكفاية على الأعصاب في الخطوة 3، 8، قطع صغيرة من الأعصاب ستكون مرئية على الشبكة. في حالة الهضم غير كافية، يمكن هضمها بالمواد الإبقاء على الشبكة إعادة بنقل إلى أنبوب 1.5 مل جديدة تحتوي على 250 ميليلتر لوسائل الإعلام في الهضم، وتكرار الخطوات 3.2-3.6. إذا كان الغلة الفقراء، ثم عينة من تعليق خلية، بعد أن تمر عبر الشاشة مش (الخطوة 3، 6) ينبغي أن ينظر إلى تحت مجهر خفيفة مع تريبان الأزرق. يجب أن تكون قابلة للحياة، والأزرق، غير أن الخلايا مرئية جنبا إلى جنب مع قضيب مثل الهياكل، التي أجزاء من محاور عصبية. في حالة وجود أية خلايا قابلة للحياة، ثم ظروف الهضم أو تسليم غير صحيحة للمواد التي تسبب نخر. إلا إذا كان مجاميع كبيرة مرئية، ثم يوصي بجمع المواد بالطرد المركزي، وكرر الهضم (خطوات 3.2-3.6).
أسلوب تحليل تدفق cytometer مورين الوركي الأعصاب وبالاسعار مفيد لمسائل تتعلق بالاعصاب كله وعده باﻷسعار. مؤخرا كان هناك اهتمام متزايد في تحليل استخدام السندات الإذنية التدفق الخلوي11،12 . ليو وآخرون، طورت أسلوب استخدام غراء والتفكك الميكانيكية الوركي الأعصاب وبالاسعار استخدام ز 21 و 23 ز على وجه التحديد تحليل أقل من القسم 1 سم للعصب، مما يسمح بتحليل المواد العصبية من مواقع محددة إصابة11. الطريقة المعروضة هنا من المستحسن استخدامه عندما يتوقع المنهجي، كما هو الحال في نيوروتوكسيكولوجي والنماذج الوراثية للاعتلال العصبي أو الأمراض المزمنة، مثل داء السكري تأثير على السندات الإذنية. بسبب انخفاض عائد الأنوية الخلايا التي تم الحصول عليها من العصب الوركي، من غير المستحسن محاولة لدراسة الأحداث قليلة السكان مع ≤ 100 بوابات من ماوس فردية. ومع ذلك، تجميع المواد من الفئران عدة سيسهل دراسة هؤلاء السكان صغيرة داخل العصب. ومع ذلك، أنه سيكون من مصلحة للتحقيق في ما إذا كان تفكك النسيج الانزيمية استخدام الإبر غراء وز 21/23 ز وصف ليو et al. يمكن الجمع بين 11 مع التدفق الخلوي تلطيخ نويات، كما هو موضح في هذه الدراسة، تعزيز عائد الخلايا المفردة. القدرة على تحليل كميات صغيرة جداً من الأنسجة أمر حاسم لإجراء مقارنة بين علوم و contralateral باﻷسعار عقب أكسوتومي العصب الوركي الانفرادية. ومع ذلك، وهذا يتجاوز نطاق هذه الدراسة. من المثير للاهتمام، تم العثور على علامات شائعة الاستخدام لتحديد الضامة لتعبير غير متجانسة بشكل غير متوقع في السندات الإذنية للفئران. على سبيل المثال، CD11b F4/80 كلاهما عثر وأن يعبر عن نسبة كبيرة من غير-المكونة للدم، وغير مستضد عرض الخلايا في العصب الوركي وبالاسعار. وعلاوة على ذلك، في الأعصاب الوركي، وليس كل CD68+ الضامة أعرب عن CD11b و F4/80، وكما كان متوقعا من الدراسة للأجهزة الأخرى. ولذا يوصي باتخاذ الحذر عند استخدام هذه العلامات لدراسة الضامة في السندات الإذنية، وأنه ينبغي التحقيق في علامات أخرى، مثل CD163،. وعلاوة على ذلك، ينبغي أيضا حساسية علامات مختلفة للانفصال الانزيمية كهذا ربما تفسيراً للفروق التي لوحظت في التعبير، كما هو الحال مع CD11b أو F4/80.
وقد استخدمت سابقا هذا البروتوكول لتحليل الخلايا المناعية في السندات الإذنية بعد التحدي السمية مع بالستريبتوزوتوسين (STZ)13، مادة كيميائية تستخدم عادة لتنظيم دورات تعريفية لداء السكري في نموذج الكائنات القوارض. وقد تبين أن STZ، الذي ينشط TRPV1 و TRPA1، يتسبب في البداية استنفاد الخلايا المناعية في العصب الوركي وبالاسعار، بينما لا تسبب أي التهاب في العصب. على الرغم من أن عدد الخلايا المناعية في باﻷسعار استردادها، والخلايا المناعية وخاصة الضامة قد استنفدت ما زال إلى حد كبير بعد ثلاثة أسابيع التحدي السامة. كان بعد ذلك الافتراض أن البلعمه بلعم الحطام العصب، ينجم عن الإصابة بايون قناة hyperexcitability قد أدت إلى المبرمج الضامة، أدى إلى نضوب بهم من السكان عامة الخلية. لا يعرف كيف تؤثر السموم العصبية المحيطية الأخرى العصبية الضامة المقيم. إذا استنفاد الضامة نتيجة هذه العوامل مشتركة هذا قد آثار بالنسبة للعلاج.
ووجد أن فقط 5-10% من الخلايا المنواه من العصبية كانت الكريات البيضاء الأصلية المكونة للدم. الخلايا المتبقية يفترض أنه خليط من أنواع الخلايا العصبية الأخرى، وهي خلايا شوان، بيريسيتيس، والخلايا الليفية، وخلايا بطانية. بسبب قدرة التدفق الخلوي نظم لقياس بارامترات متعددة وتوفير أن هناك علامات محددة و/أو الأجسام المضادة متاحة، فإنه يمكن تصور أن هذه الأنواع من الخلايا يمكن أيضا أن تحلل باستخدام هذا الأسلوب. لقد وصف هذا الأسلوب للمواد مورين. ومع ذلك، مع بعض التعديلات، أيضا استخدامه لتحليل المواد السندات الإذنية من الخنازير ومن البشرية. ومن المتوقع أن هذا الأسلوب سوف يكون أكثر فائدة لتحليل المواد من الأنواع أكبر من الفئران، في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
المؤلفين قد لا يوجد تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذه الدراسة.
Acknowledgments
هذه الدراسة وأيده الأوقيانوغرافية الألمانية (DFG؛ SFB1118). الكتاب يود أن يشكر إكسيل إيرهارت لأداء معظم التشريح ومفيد في نقل هذه المعارف، والدكتور فولكر اكستين للمساعدة في الجانب التقني ل cytometer التدفق.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve - tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
References
- DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neuroscience. 302, 174-203 (2014).
- Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).
- Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
- Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
- Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
- Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
- Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies? Glia. 64, 475-486 (2016).
- Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
- Leong, T. Y. -M., Leong, A. S. -Y. How does antigen retrieval work? Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
- Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
- Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).
- Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).
