Analyse af immunceller i enkelt ischiadicus nerver og dorsalrods Ganglion fra et enkelt museklik bruge flowcytometri

Summary

Kvantitativ analyse af celleindhold inden for murine iskiasnerven er vanskelig på grund af knaphed på vævet. Denne protokol beskriver en metode til væv fordøjelse og præparat, der giver tilstrækkelig celler flow flowcytometri analyse af immun cellepopulationer fra nerver af individuelle mus.

Abstract

Nerve-resident immun celler i det perifere nervesystem (PNS) er afgørende for at opretholde neuronal integritet i en sund nerve. Immunceller af PNS påvirkes af skade og sygdom, som påvirker nervefunktion og kapacitet til regenerering. Neuronal immunceller er almindeligt analyseret ved immunofluorescens (IF). Mens hvis er essentielle for placering af immunceller i nerve, hvis er kun semi-kvantitative og metoden er begrænset til antallet af mærker, der kan analyseres samtidig og graden af overflade udtryk. I denne undersøgelse, blev flowcytometri brugt til kvantitativ analyse af leukocyt perkolatnedsivning i ischiadicus nerver eller dorsalrods ganglier (DRG) af individuelle mus. Enkelt celle analyse blev udført ved hjælp af DAPI og flere proteiner blev analyseret samtidigt til enten overflade eller intracellulære udtryk. Begge ischiadicus nerver fra en mus, der blev behandlet efter denne protokol genereret ≥ 30.000 enkelt nukleeret begivenheder. Andelen af leukocytter i ischiadicus nerver, bestemmes af udtryk for CD45, var ca. 5% af samlede celleindholdet i iskiasnerven og ca 5-10% i DRG. Selv om denne protokol fokuserer primært på befolkningens immun celle i PNS, betyder fleksibilitet af flowcytometri at måle en række markører samtidig, at de andre celler befolkninger stede i nerve, såsom Schwann celler, pericytes , fibroblaster og endotelceller, kan også analyseres ved hjælp af denne metode. Denne metode giver derfor et nyt middel til at studere systemiske virkninger på PNS, såsom neurotoxicology og genetiske modeller af neuropati eller kroniske sygdomme som sukkersyge.

Introduction

Immunceller, der indtaste PNS fra omsætning, hjælpe som defineret af udtryk for CD45 og CD11b, med at bevare integriteten af nerve og spille en rolle både i regenerering og degeneration¹. Makrofager (defineret ved deres ekspression af CD68 i mus) kan være skæv i retning af en inflammatorisk fænotype, udtrykker flere MHC klasse II og CD86 på deres overflade (M1), eller mod en anti-inflammatorisk fænotype, udtrykker flere intracellulære CD206 (M2)² . Skævvridning af makrofag fænotype er en dynamisk proces reguleret gennem Akt signalering³, og som afspejler de forskellige opgaver af makrofager i forsvar mod patogener (M1) og rolle i væv revitalisering (M2). Regenerering af en skadet nerve først kræver fagocytose af myelin resterne af makrofager i nerve^4,5, og anti-inflammatoriske (CD68⁺CD206⁺) M2 makrofager har vist sig at fremme axon udvækst i den PNS⁶. Reduceret ansættelse eller makrofager til PNS eller nedsat arbejdsevne fagocytose kan resultere i forringet regenerering og vedligeholdelse af nerve integritet. Inflammatorisk M1 makrofager, udtrykker MHC klasse II, er mindre i stand af fagocytose end M2 makrofager, og neuronal betændelse er involveret i patogenesen af flere neurodegenerative sygdomme⁷.

De ændringer, der opstår på nerve bosiddende immunsystemet som følge af skader kan være kvantitative, manifesterer sig i tab af CD45⁺ leukocytter (eller øget infiltration af CD45⁺ leukocytter i sag betændelse), eller kvalitative, som ændring af makrofag fænotype fra M2 til M1 fænotype. Immunceller af PNS har traditionelt analyseret ved hjælp af IF, ved hjælp af frosne snit eller paraffin-embedded materiale⁸. Hvis der kræves til bestemmelse af lokalisering af celler af interesse. Dog afhængig kvantificering ved hjælp af hvis ofte tælle et relativt lille antal celler i en smal del af væv, gør kvantificering upålidelige og sårbare over for udvalg bias. Til identifikation af specifikke delmængder af immunceller er samtidige påvisning af ekstracellulære og/eller intracellulære markører påkrævet, mens bestemmelse af makrofag fænotype kræver mindst mindst to markører, specielt CD206 og MHC klasse II. Som oftest tilgængelige mikroskoper er begrænset til mindst to-farve kanaler, såsom fluorescein isothiocyanat (FITC) og phycoerythrin (PE), kan karakterisering af de specifikke delmængder af immunceller af hvis være begrænsende og ufuldstændige, der kræver behovet for at have flere dias, stammer fra det samme område af interesse, der er plettet og analyseret parallelt. Dette tidskrævende aspekt derfor ikke nødvendige egner sig analysen af stor stikprøve sæt. Desuden, som de fleste af markørerne af interesse er ekstracellulære, påvisning i væv, der enten er blevet integreret i paraffin eller cryoconserved, kan være problematisk på grund af afbrydelse af membran integritet og maskering af epitoper, samt tab af antigener af interesse fra brugen af opløsningsmidler, acetone og methanol⁹.

Derimod flyde flowcytometri, som måler optisk og fluorescens Karakteristik af enkelt celler i suspension som de passerer gennem en stråle af lys, giver en mere praktisk og omfattende midler til analyse af cellepopulationer. Flowcytometri, i stedet for at producere et digitalt billede af væv, giver en automatiseret kvantificering af sæt parametre, som omfatter en celles relative størrelse og reflekterende indeks, omtales som den forward scatter (FSC), granulering/indre kompleksitet eller side-scatter (SSC) og relative fluorescens intensitet, at give, at cellen er blevet stemplet med et passende fluorophore, såsom en konjugeret antistof. Et typisk flow forskellige består af to, luftkølede lasere; en argon laser producerer blåt lys på 488 nm og en helium-neon-laser producerer lys på 633 nm. Denne kombination giver mulighed for påvisning og måling, samtidig, i hvert fald fem mål på overfladen eller inden for den intracellulære rum. Mere avanceret flow cytometers kan bestå af flere lasere, som giver mulighed for påvisning af op til otte forskellige fluorokromer på én gang at give, at peak emission bølgelængder af de valgte fluorokromer ikke overlapper betydeligt.

Til at analysere ved flowcytometri, skal vævet af interesse først enzymatisk fordøjes, generelt med collagenase, til at generere en enkelt celle suspension. Analyse af murine ischiadicus nerver har tidligere været vanskelig på grund af den lille mængde af væv fremstillet af hver mus. Desuden det høje fedtindhold af myelin omkring axoner hæmmer celle opsving og producerer store mængder af snavs. Den metode beskrevet heri for iskiasnerven forberedelse og fordøjelsen blev tilpasset fra Schwann celle isolation protokol af Barrette et al. ⁷, og har til formål at isolere nok celler fra nerver af individuelle mus for flow flowcytometri analyse, for at reducere variation mellem mus. Ved hjælp af DAPI til identifikation af enkelt celler i rå væv digest omgår behovet for at fjerne axon snavs, hvilket ofte fører til celletab. Vask flere gange med en vaskemiddel-rige buffer aids i udgivelsen af celler fanget i den fede vragrester, dermed øger udbyttet. Fordøjelsen af både fuld længde ischiadicus nerver fra en enkelt mus efter denne protokol genererer ≥30, 000 enkelt nukleeret begivenheder og mindst 3 gange så mange var hentet fra DRG. Andelen af CD45⁺ leukocytter var ca. 5% af samlede celleindholdet i iskiasnerven digest og ca 5-10% i DRG-digest. Fleste af CD45⁺ celler i iskiasnerven udtrykt makrofag markører, CD68 og CD206.

Protocol

Wild-type C57BL/6 mus (hanner; 10-12 uger) blev holdt i standard 12 h lys/mørke cyklus og blev givet fri adgang til standard chow kost og vand. Alle dyreforsøg blev foretaget i overensstemmelse med de relevante retningslinjer af lokale Animal Care og brug udvalget og godkendt af de lokale Animal Care og brug Udvalget på den regionale myndighed i Karlsruhe, Tyskland (G216/10).

1. perfusion af musen

1. Offer mus (C57BL/6; Hanner; 10-12weeks) ved hjælp af CO₂ eller i overensstemmelse med lokale regulativer.
   Bemærk: Retro-orbital blødning kan udføres for at opnå kontrol leukocytter, ved hjælp af EDTA-belagt 1,5 mL rør. Denne metode af blødning er kun effektiv straks efter ofringen. Yderligere, peritoneale hulrum lavage (PCL) kan udføres for at opnå kontrol makrofager, bruger forvarmet PBS ved 37 ° C for at undgå kolde agglutination af blodet, hvilket kan hæmme perfusion.
2. Desinficere musen ved sprøjtning pels på maven rigeligt med 70% v/v ethanol og gentagne gange aftørring med en vævet med bomuld gaze. Brug sløv saks, skåret åben abdominal huden af en langsgående indsnit.
3. Udsætte den pleural hulrum ved først at gøre et snit i mellemgulvet ved hjælp af buede, sløv saks og derefter udvide indsnittet langs hele længden af brystkassen. Gøre en tilsvarende nedskæring på de kontralaterale side indtil brystbenet kan blive omhyggeligt løftet væk.
4. Med et klart overblik over hjertet og de store fartøjer, Indsæt en sommerfugl 23¾ gauge kanyle, forbundet til en 50 mL sprøjte fyldt med iskolde PBS, i det venstre kammer i hjertet.
5. Gøre et snit til højre atrium i hjertet ved hjælp af iris saks til at skabe så stor af en stikkontakt som muligt uden at beskadige den nedadgående aorta, og derefter presse forsigtigt på sprøjten til at skubbe ca 30 mL PBS. Ekssudat bør køre klar. Clearing af leveren og/eller nyrerne kan bruges som en indikator for en god perfusion.

2. dissektion af iskiasnerven og DRG

Bemærk: For dissektion af ischiadicus nerver, huden ovenstående gluteus maximus er fjernet og musen er placeret ventrale side ned mens strækker ud underekstremiteterne.

1. Bilateralt dissekere hele ischiadicus nerver ved at adskille muskelvæv fra den dorsale overlår, og følg nerven langs rygsøjlen. Skær den nerve, hvor det udgange fra rygsøjlen og umiddelbart over knæet i anden enden.
   Bemærk: Undgå overdreven håndtering af nerve såsom knusning eller trække med pincet.
2. Brug af pincet, overføre den skåret nerve(s), ca. 2 cm pr. nerve, til en 1,5 mL rør indeholdende 1 mL iskold PBS og opbevares på is.
   Bemærk: Nerven kan opbevares natten over på is.
   Bemærk: For DRG-dissektion, pincet og en skalpel, frigør huden fra de underliggende blødt væv ved forsigtigt skrælning off de resterende tilbage hud at udsætte de cervikale, torakal og lumbal spinal regioner. Fjerne hovedet ved at skære i bunden af kraniet med en sløv saks.
3. Snit ribbenene parallelt med og tæt på rygsøjlen på begge sider, før afmontering indvolde tilsluttet den forreste side af rygsøjlen. Skær lårben og fjern rygsøjlen ved et tværsnit på niveau med lårben. Ved hjælp af iris saks, skåret væk enhver muskel, fedt og andre bløde væv fra rygsøjlen.
4. Placer rygsøjlen med den dorsale side opad og åbne det, fra slutningen caudale ved at skubbe en spidsen af saksen i rygmarvskanalen ved 3 klokken stilling og knoglen Bekkasin. Gentag fremgangsmåden på ni klokken.
   Bemærk: Det er vigtigt at skære præcist i midten til at undgå at beskadige DRG.
5. Gentag skære fra side til side, indtil den rostralt slutningen er nået og rygmarven er fuldt eksponeret. Ved hjælp af en dissektion mikroskop, fjerne rygmarv at eksponere spinal nerver, som kan bruges til at lokalisere DRG i rygsøjlen.
6. Fjerne de lumbale DRG ved forsigtigt tugging på dorsalrods at trække DRG i rygsøjlen kanalerne, derefter klipning nerver og bindevæv med iris saks til at fjerne DRG.
   Bemærk: Det er muligt at begrænse samling til L4-L6 DRG, som bidrager til iskiasnerven.
7. Brug af pincet, overføre DRG til en 1,5 mL rør indeholdende ca. 1 mL iskold PBS, og opbevares på is.
   Bemærk: Nerven kan opbevares natten over på is.

3. fordøjelse af iskiasnerven og DRG

1. Forbered fordøjelsen media (DMEM, 10 mM HEPES, 5 mg/mL BSA, 1,6 mg/mL collagenase Type 4) suppleret med 100 µg/mL af deoxyribonuclease og opbevares på is.
   Bemærk: Mængden af fordøjelsen medium kræves pr. mus (ischiadicus nerver + DRG) er 1 mL. Når der tilberedes, kan delprøver af fordøjelsen medier opbevares ved-20 ° C.
2. Overføre ischiadicus nerver og DRG fra en mus i separate 1,5 mL rør indeholdende 500 µL af fordøjelsen medier. For ischiadicus nerver, snittes materiale i 15-20 stykker ved hjælp af foråret saks og derefter inkuberes væv suspensioner i en rystende inkubator ved 37 ° C i 20 min. med blid agitation (≤ 450 rpm).
3. Gentagne gange hakkede cellesuspension gennem 1.000 µL pipette tip til mekanisk adskille ufuldstændigt fordøjet væv.
   Bemærk: Hvis suspensionen er vanskeligt at titreres, derefter skåret pipette spidsen med en saks til at oprette en stump ende. Inkuber væv suspension ved 37 ° C i 20 min. med blid agitation (≤ 450 rpm).
4. Gentag ændring gennem en 1.000 µL pipette tip og inkuberes i en yderligere 10 min. ved 37 ° C med blid agitation (≤ 450 rpm).
5. Forberede FACS buffer (PBS suppleret med 10% FCS og 1 mM EDTA) og opbevares på is. Skylles og lægges i blød en rustfrit stål skærm med en maskestørrelse på 140 µm med FACS buffer i 60 x 15 mm petriskål på is.
   Bemærk: Nylon skærm filtre bør undgås, da det fører til en betydelig nedgang i udbyttet af nukleeret celler.
6. Gentagne gange igennem væv suspensioner 140 µm skærmen filter, som det er afholdt over petriskål, med stump pincet, på is. Indsamle cellesuspension fra petriskålen og overføre det til en ny 1,5 mL tube opbevares på is.
7. Skubbe nogen ufuldstændigt fordøjet væv, der er tilbage på filtreres gennem af gentagne ændring med en 1.000 µL pipette spids. Skyl filteret skærmen to gange med 500 µL af FACS buffer og indsamle den resulterende cellesuspension i petriskålen at kombinere med cellesuspension fra trin 3.6.
   Bemærk: Hvis strømmen forskellige bruges er følsomme over for snavs, cellesuspension fra trin 3.7 kan videregives gennem et 70 µm skærmen filter; dog kan dette føre til en tab i udbyttet af nukleeret celler.
8. Centrifugeres celle suspensioner ved 300 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten og celle resuspenderes i 1 mL af FACS buffer. Gentag trinnet vask en gang.
9. Resuspenderes celle i 150-350 µL af FACS buffer, afhængigt af antallet af farvning, der er påkrævede (150 µL FACS buffer pr. farvning panel).

4. farvning af iskiasnerven og DRG med Fluorescently mærket antistoffer til flowcytometri

1. Overføres 100 µL af iskiasnerven eller DRG cellesuspension til en V-formet i en 96-brønd plade på is.
   Bemærk: Single-farvede celler er nødvendige for alle antistoffer bruges som de vil give den nødvendige kontrol for at konfigurere flowcytometri photomultiplier tube (PMT) spænding gevinster og kompensation, samt at hjælpe skelne specifikke fra ikke-specifik binding. På grund af den begrænsede materiale til rådighed fra iskiasnerven og DRG, blod leukocytter og makrofager fra PCL (trin 1,1-1,2) kan bruges som enkelt-farvede kontrolelementerne, farvning for der skal udføres samtidig med farvningen af den ischiadicus nerve og DRG.
2. Pool de resterende celler suspensioner (ca 50 µL pr. sample) fra enten ischiadicus nerver eller DRG prøver, der skal tjene som en unstained kontrol.
3. Centrifugeres plade på 400 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten ved at invertere pladen over en bin og anvende en skarp flick i wrist, og forsigtigt trykke tørre på papirservietter.
4. For overflade farvning, resuspend hver celle pellets i 20 µL af FACS buffer som indeholder antistoffer af interesse (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 og MHC klasse II-Biotin), og der inkuberes, beskyttet mod lys, i isbad i 30 min.
   Bemærk: (1) den optimale antistof fortynding skal være beslutsom inden brug ved at udføre en fortyndingsrække ifølge producentens produktinformation; (2) ikke-specifik stainings kan reduceres ved inkubering med Fc-blok på dette trin, ifølge producentens anvisninger; og (3) Isotype kontrol stainings er generelt ikke påkrævet, når du bruger primær antistoffer direkte konjugeret med et fluorophore, og/eller når antigen(s) af interesse producere forskellige populationer.
5. Tilføje 130 µL af FACS buffer til hver brønd og centrifugeres plade på 400 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten som tidligere beskrevet (trin 4.3) og vaske celle pellets to gange med 150 µL af FACS buffer.
   Bemærk: Hvis du bruger en ukonjugeret primære antistof eller en primær antistof konjugeret med biotin, derefter en passende sekundære reagens, konjugeret med et fluorophore, kan lægges på dette punkt og trin 4.4-4.5 gentages. I forbindelse med denne protokol, blev streptavidin-PE/Cy7 eller Streptavidin-PerCP brugt til at registrere MHC klasse II i kombination med CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5 eller i kombination med CD68-APC og F4/80-PE/Cy7, henholdsvis.
6. Til fiksation, efter den sidste vask trin, resuspend celle pellets i 100 µL af 4% PARAFORMALDEHYD i PBS (pH 7,4). Inkuber plade i isbad i 10 min og derefter centrifugeres ved 400 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten som tidligere beskrevet (skridt 4.3) og vaske celle pellets engang med 150 µL af FACS buffer.
   Forsigtig: PARAFORMALDEHYD er giftige; bær passende beskyttelse såsom handsker og briller, osv.
   Bemærk: Resuspend celle pellets i 150 µL af FACS buffer og opbevares beskyttet mod lyset ved 4° C i op til to dage. Hvis der kræves ingen intracellulær farvning, derefter fortsætte til trin 4.11 efter centrifugering plade på 400 x g i 5 min. ved 4 ° C.
7. Intracellulær farvning, resuspend celle pellets i 150 µL FACS buffer+0.5% vaskemiddel og inkuberes ved stuetemperatur, beskyttet mod lys for 15 min. plade på 400 x g der centrifugeres i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten som tidligere beskrevet (skridt 4.3) og vaske den celle pellet engang med 150 µL af FACS buffer + 0,5% vaskemiddel. Resuspenderes celle i 20 µL FACS buffer+0.5% vaskemiddel der indeholder antistoffer af interesse (CD68-APC, CD206-PE), og der inkuberes, beskyttet mod lys ved stuetemperatur i 30 min.
8. Tilføje 130 µL FACS buffer+0.5% vaskemiddel til hver brønd og centrifugeres plade på 400 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten som tidligere beskrevet (trin 4.3) og vaske celle pellets to gange med 150 µL af FACS buffer + 0,5% vaskemiddel.
   Bemærk: Hvis du bruger en ukonjugeret primære antistof eller en primær antistof konjugeret med biotin, derefter en passende sekundære reagens, konjugeret med et fluorophore, kan tilføjes på dette punkt og trin 4.9 4.10 gentages.
9. Resuspend celle pellets i 150 µL af FACS buffer + 0,5% vaskemiddel og butik, beskyttet mod lys ved 4 ° C i op til to dage.
10. Resuspend celle pellets med 150 µL FACS buffer + 0,5% vaskemiddel suppleret med 5 µg/mL DAPI og Inkuber i 5 min. ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Centrifugeres plade på 400 x g i 5 min. ved 4 ° C. Supernatanten som tidligere beskrevet (trin 4.3).
11. Resuspend celle pellets i 150 µL af PBS og overførsel til en passende mærket FACs tube. Opbevares ved stuetemperatur, beskyttet mod lys, indtil klar til analyse.
    Bemærk: Efter resuspension i PBS, cellerne analyseres inden for timer, da DAPI vil langsomt tage afstand fra DNA, fører til et tab af signal.

5. opsætning af flowcytometri og drift af prøver

1. Sikre at flow-Flowcytometret er udstyret med passende lasere og/eller filter indstiller til at måle fluorophores bruges til at plette cellerne. Dette kan bestemmes under forskellige standardkonfiguration på systemet. I forbindelse med denne protokol, celler blev analyseret ved hjælp af en flow forskellige udstyret med tre lasere (405 nm, 488 nm og 633 nm) giver mulighed for påvisning af ≤ 5 fluorophores.
2. Vælg de rette kanaler til påvisning af fluorophores af interesse. Alle fluorescerende signaler opdages bedst med logaritmisk forstærkning.
3. Vælg en passende strømningshastighed prøverne. Denne parameter kan variere afhængigt af systemet bruges og bør fastsættes empirisk. I forbindelse med denne protokol, blev en gennemstrømningshastighed på MED at HI (35-60 µL/min) brugt til at forhindre tilstopning af nålen.
4. Vælg det samlede antal hændelser/celler skal opkræves pr. prøve. Det mindste antal arrangementer bør være 1.000.000.
5. Oprette scatter parceller under en global regneark SSC-a versus FSC-A, samt for hver fluorophore af interesse versus FCS-A. Opret en statistisk visning, der viser antallet af hændelser og den gennemsnitlige fluorescerende intensitet (MFI) for den valgte fluorophores.
6. Sæt spændingen af FSC-A og SSC-A-kanaler, sådan at de mindste celler passer ind i den nederste venstre 10% af scatter plot. Bestem baggrund fluorescens og minimumsantal af stikprøver fluorescens fra den unstained kontrol fra enten ischiadicus nerver eller DRG. Bestem indgangen forælder (P1) baseret på scatter plot fra DAPI-kun farvning kontrol.
   Bemærk: Dette er ikke en samling gate, skyldes til dels af befolkningens DAPI + i PNS heterogene karakter.
7. Ved hjælp af FSC scatter observationsområder til hver af fluorophores af interesse, justere spændinger, så cellerne i kontrolelementet unstained falder ind under den nederste fjerdedel af deres respektive scatter parceller. Gates oprettes derefter over denne region at definere de celler, der er positive for hver af de respektive markører/fluorophores. Placeringen af en port er bekræftet af drift af kontrolelementet single-farvede (trin 4.1).
   Bemærk: Kompensation for overlappende emission spektre kan udføres på dette tidspunkt eller anvendes med tilbagevirkende kraft med relevant analyse software.
8. Når strømmen Flowcytometret er blevet oprettet, som beskrevet, kan prøverne køres.
9. Efter flugt, resterende prøvematerialet kan kasseres og FCS-filer kan blive eksporteret til yderligere analyse.

Representative Results

Celle suspensioner fra både fuld længde ischiadicus nerver og alle større DRG blev udarbejdet i henhold til protokollen, fra seks sunde C57BL/6 mus og opdelt i tre lige store delprøver til farvning. Counter farvning med DAPI, som pletter DNA, giver mulighed for påvisning af en enkelt celle population (figur 1A-B, øverste panel). Vask ud DAPI, inden analyse ved flowcytometri, faldt i et omfang fluorescerende intensiteten af ikke-nukleeret snavs, som giver mulighed for valg af en diskret befolkning over enkelt-nukleeret begivenheder eller slåbrokker FSC-akse. Ingen samling gate er anvendt som slåbrokker fra PNS er fordelt på et stort udvalg af FSC og SSC (figur 1 c). Materiale på den høje ende af FSC-akse, som indeholder ufuldstændigt fordøjet væv, skal være udelukket i udvælgelsen af singlet befolkning (figur 1A-B). Ved hjælp af en tæthed plot (nederste panel) til at vise resultaterne kan lette i udelukkelse af den store snavs (nederste panel). Ialt ≥ 30.000 slåbrokker regelmæssigt kan fås fra to fulde ischiadicus nerver og ≥200, 000 slåbrokker kan fås fra DRG (fig. 1 d). Fra ischiadicus nerver udtrykt ca. 5% af slåbrokker CD45 på deres overflade, der henviser til, at ca. 5-10% blev fundet i DRG, derved definere disse celler som leukocytter af hæmatopoietisk oprindelse (figur 2A).

Et flertal af CD45⁺ slåbrokker også udtrykt MHC klasse II, i en gradvis måde (figur 2B). I DRG, CD11b kan bruges til at registrere microglial-lignende celler (CD45^dim, MHCII⁺ og CD11b⁺) (figur 2B, øverste panel). Men denne mikroglia befolkning er fraværende fra ischiadicus nerver (figur 2B, nederste panel). Et flertal af slåbrokker udtrykker CD45 i PNS er CD68⁺ makrofager. I iskiasnerven og DRG, 2-5% af slåbrokker udtrykt CD68 (figur 3A). Alle celler, der udtrykker CD68 også udtrykt CD45 (data ikke vist). I DRG, CD68⁺ makrofager blev mere heterogene i deres udtryk for både MHC klasse II og CD206, en markør for M2 makrofager, end i ischiadicus nerver (figur 3B-D). I ischiadicus nerver, de fleste makrofager Co udtrykt MHC klasse II og CD206 (figur 3B-D, lavere paneler); typisk, ca. 60-80% af CD68⁺ makrofager udtrykt CD206, mens en mindre del af CD68⁺ Co udtrykt CD206 i DRG (figur 3B). Interessant, M1 makrofag markør CD86 ikke generere nogen positiv farvning, hverken på makrofager fra nerve eller fra PCL (data ikke vist). Makrofag markør, F4/80, viste en heterogen udtryk både i DRG og ischiadicus nerver (figur 3B-C), farvning en del af CD68^- og MHCII^- celler. Derudover F4/80 udtryk ikke fuldt overlapper med CD68 udtryk.

Figur 1: repræsentative data fra flow flowcytometri analyse af DAPI-farvede nukleeret celler fra DRG og iskiasnerven. Alle begivenheder indsamlet, vist som scatterplots (øverste panel) eller tæthed parceller (nederste panel), fra (A) DRG eller (B) iskiasnerven (SN) af én repræsentativ mus. Pilene i panelerne lavere angiver gates, bortset fra materiale øverst FCS akse. (C) Back-gating af cellerne indsamlet i den DAPI-gate (slåbrokker), vist i panelet (A) på SSC vs FSC scatter plot. (D) antallet af slåbrokker fra både SN og alle større DRG fra seks sunde C57BL/6 mus. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Flow flowcytometri analyse af overflade udtryk for CD45, MHC klasse II, og CD11b på slåbrokker fra DRG og iskiasnerven. Begivenheder, der er valgt i den DAPI-gate (slåbrokker) vist i figur 1 blev analyseret. (A) andel af slåbrokker udtrykker CD45 i iskiasnerven (SN) og DRG fra seks kontrol mus. (B) repræsentative scatter arealer slåbrokker fra DRG (øverste panel) og SN (nederste panel). Celler, der udtrykker CD11b angives med blå farve. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Flow flowcytometri analyse af overflade udtryk for CD68, MHC klasse II, og CD206 på slåbrokker fra DRG og iskiasnerven. Begivenheder, der er valgt i den DAPI-gate (slåbrokker) vist i figur 1 blev analyseret. (A) andel af slåbrokker udtryk for CD68 i iskiasnerven (SN) og DRG fra seks sunde C57BL/6 mus. (B) andel af CD68⁺ makrofager Co udtrykker CD206 i SN og DRG fra seks sunde C57BL/6 mus. (C) repræsentative scatter parceller af slåbrokker fra DRG (øverste panel) og SN (nederste panel) viser CD68 og MHC klasse II udtryk. (D) repræsentative scatter parceller af slåbrokker fra DRG (øverste panel) og SN (nederste panel) viser CD68 og CD206 udtryk. Celler, der udtrykker F4/80 er angivet med magenta farve. Data repræsenterer gennemsnit ± SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Ischiadicus nerver indeholder en stor del af lipider, såsom kolesterol, på grund af indholdet af myelin omkring axoner. Da egenskaberne for lipider ændres med temperaturen, kan forskellige resultater opnås ved forskellige temperaturer. For at sikre celle bevarelse, blev alle trin i denne protokol efter fordøjelsen udført på is. Mens sammenhæng anbefales af hensyn til reproducerbarhed, kan det være muligt at øge udbyttet ved at udføre trin 3.6 og 3.7 ved stuetemperatur. Hvis nerver på trin 3.8 ikke har været tilstrækkeligt fordøjet, vil små stykker af nerve være synlige på trådnet. I tilfælde af utilstrækkelig fordøjelsen, kan materialet opbevares på trådnet fordøjes igen ved at overføre til en ny 1,5 mL tube indeholder 250 µL af fordøjelsen medier og gentage trin 3.2-3.6. Hvis udbyttet er fattige, så en stikprøve af cellesuspension, efter passerer gennem skærmen mesh (trin 3.6) skal ses under et lysmikroskop med trypan blå. Levedygtig, ikke-blå, celler skal ses sammen med stang-lignende strukturer, som er fragmenter af axoner. Hvis ingen levedygtige celler er til stede, har derefter den fordøjelse betingelser og/eller forkert aflevering af materialet forårsaget nekrose. Hvis kun store aggregater er synlige, så anbefales det at indsamle materialet ved centrifugering og Gentag fordøjelsen (trin 3.2-3.6).

Flow Flowcytometret analysemetoden murine ischiadicus nerver og DRG er nyttig for spørgsmål involverer hele nerver og flere DRG. for nylig har der været en øget interesse i analysen af PNS benytter flow flowcytometri^11,12 . Liu et al. har udviklet en metode, ved hjælp af papain og mekaniske dissociation af ischiadicus nerver og DRG bruger 21 G og 23 G specifikt analysere så lidt som 1 cm afsnit af nerve, hvilket giver mulighed for analyse af nerve materiale fra bestemte websteder af skade¹¹. Metoden præsenteres her anbefales til brug, når effekten på PNS forventes at være systemisk, som i neurotoxicology og genetiske modeller af neuropati eller kroniske sygdomme som sukkersyge. På grund af det lave udbytte af nukleeret celler fremstillet af iskiasnerven, er det ikke anbefales at forsøge at studere små populationer med ≤ 100 gated hændelser fra en enkelt mus. Dog ville pooling af materiale fra flere mus lette undersøgelsen af sådanne små populationer i nerve. Ikke desto mindre, det ville være af interesse at undersøge, om den enzymatiske væv dissociation bruge papain og 21G / 23G nåle beskrevet af Liu et al. ¹¹ kunne kombineres med flow flowcytometri farvningen af kerner, som beskrevet i denne undersøgelse, at øge udbyttet af enkelt celler. Evnen til at analysere meget små mængder af væv er afgørende for at udføre sammenligning mellem ipsi- og kontralaterale DRG efter ensidige iskiasnerven axotomy. Dette er dog uden for rammerne af denne undersøgelse. Interessant, fandtes almindeligt anvendte markører for identifikation af makrofager for at have en uventet heterogene udtryk i PNS af mus. For eksempel, blev CD11b og F4/80 begge fundet skal udtrykkes på en stor del af ikke-hæmatopoietisk, ikke-antigen præsentere celler i både iskiasnerven og DRG. Desuden, i ischiadicus nerver, ikke alle CD68⁺ makrofager udtrykt CD11b og F4/80, som ville have forventet fra studiet af andre organer. Det anbefales derfor at forsigtighed tages når du bruger disse markører for studiet af makrofager i PNS, og at andre markører, såsom CD163, bør undersøges. Følsomheden af de forskellige markører til den enzymatiske dissociation bør desuden også etableres som dette måske en forklaring på forskellene observeret i udtryk, som med CD11b eller F4/80.

Denne protokol er tidligere blevet brugt til at analysere immunceller i PNS efter giftige udfordring med streptozotocin (STZ)¹³, et kemikalie, der er almindeligt anvendt til induktion af diabetes i model gnaver organismer. Det var vist, at STZ, som aktiverer både TRPV1 og TRPA1, i første omgang forårsager en udtynding af immunceller i både iskiasnerven og DRG, mens de ikke forårsager nogen betændelse i en nerve. Selv om antallet af immunceller i DRG inddrives, immunceller og navnlig makrofager var stadig betydeligt forarmet sende tre uger giftige udfordring. Det blev efterfølgende hypotese at makrofag fagocytose af nerve debris, som følge af skade af ion-kanal hyperexcitabilitet kan have ført til apoptose af makrofager, hvilket resulterer i deres nedbrydning fra befolkningens generelle celle. Det vides ikke, hvordan andre perifere nerve toksiner påvirker nerve bosiddende makrofager. Hvis nedbrydningen af makrofager er et fælles resultat af sådanne agenser kan det have konsekvenser for behandling.

Det blev konstateret, at kun 5-10% af de nucleated celler fra nerve var leukocytter hæmatopoietisk oprindelsesland. De resterende celler er formentlig en blanding af de andre nerve celletyper, nemlig Schwann celler, pericytes, fibroblaster og endotelceller. På grund af flowcytometri kapacitet er systemer til at måle flere parametre og forudsat, at der særlige markører og/eller antistoffer tilgængelige, det tænkeligt at disse celletyper kan også analyseres ved hjælp af denne metode. Denne metode er blevet beskrevet for murine materiale. Men med nogle ændringer, det er også blevet brugt til analyse af PNS materiale fra svin og mennesker. Det forventes, at denne metode vil være mere nyttigt for analyse af materiale fra arter, der er større end mus, i fremtiden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6 Mouse	Charles River	C57BL/6NCrl
DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate)	Thermo	31885023	The source of this material is not important
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Collagenase Type 4	Worthington Biochemical Corp., US	LS004188
Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I	Sigma-Aldrich	DN25-1g
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated	Sigma-Aldrich	F4135
Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5	Biolegend	101228	Clone M1/70
Antibody against MHC class II, biotinylated	Biolegend	107603	Clone M5/114.15.2
Antibody against CD45-A647	Biolegend	107603	Clone 30-F11
Antibody against CD68-APC	Biolegend	137007	Clone FA/11
Antibody against CD206-PE	Biolegend	141706	Clone C068C2
Antibody against F4/80-PE/Cy7	Biolegend	123113	Clone BM8
Streptavidin-PE/Cy7	Biolegend	405206	Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5
Streptavidin-PerCP	Biolegend	405213	Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark
Cell dissociation sieve - tissue grinder kit	Sigma-Aldrich	CD1
V-Shaped, 96-well plates	Greiner/Sigma	M8185
5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm	BD Biosciences	352008
60x15mm petri dish	Greiner/Sigma	Z643084
BD LSR II Flow Cytometer	BD Biosciences