Summary
Deze studie toont het nut en het gemak van kwantitatieve celmembraan extensie meting en de correlatie met zelfklevende capaciteit van cellen. Als een representatief voorbeeld, laten we zien hier dat Dickkopf-gerelateerde eiwitten 3 (DKK3) bevordert de vorming van de verhoogde lobopodia en cel hechting in adrenocortical carcinoom cellen in vitro.
Abstract
De celmembraan extensie repertoire moduleert verschillende kwaadaardige gedrag van kankercellen, met inbegrip van hun potentieel zelfklevende en trekvogels. De mogelijkheid om nauwkeurig te classificeren en te kwantificeren cel extensies en te meten van het effect op van een cel zelfklevende capaciteit is van cruciaal belang om te bepalen hoe cel-signalering gebeurtenissen effect kanker cel gedrag en agressie. Hier beschrijven we de in vitro ontwerp en het gebruik van een cel kwantificering uitbreidingsmethode in combinatie met een hechting capaciteit test in een vastgestelde in vitro model voor adrenocortical carcinoom (ACC). Specifiek, testen we de effecten van DKK3, een vermeende tumor suppressor en een Pro-differentiatie factor, op het membraan extensie fenotype van de ACC cellijn, SW-13. Stellen wij voor deze tests om relatief eenvoudige, betrouwbare en makkelijk interpreteerbaar maatstelsel meet deze kenmerken onder verschillende experimentele omstandigheden.
Introduction
Dysregulated WNT signalering speelt een cruciale rol in adrenocortical maligniteiten1. De methoden die worden gebruikt in deze studie onderzoeken of zwijgen van DKK3, een negatieve regulator van de WNT signalering, vertegenwoordigt een dedifferentiation gebeurtenis in de bijnierschors en bevordert de vorming van de tumor in het kader van cel-extensie repertoire wijzigingen. DKK3 is een 38 kDa glycoproteïne met een N-terminal signaal peptide afgescheiden en vorige studies hebben aangetoond dat haar gedwongen meningsuiting in de arrestatie van de celcyclus resulteerde, geremd agressief gedrag van de kwaadaardige en omgekeerd epitheliale-mesenchymale overgang2.
Het maligne gedrag van adrenocortical carcinoom (ACC) en andere vormen van kanker is, gedeeltelijk beïnvloed door het vermogen van tumorcellen met de omringende oppervlakken, met inbegrip van de extracellulaire matrix, wat op zijn beurt tumor cel invasie vergemakkelijkt en migratie3. De rol van specifieke celmembraan extensies in de progressie van kanker wordt steeds worden aangetoond in verschillende contexten, vooral via de vorming van filopodia. Bijvoorbeeld, is overexpressie van L-type calcium kanalen gebleken dat induceren filopodia vorming te bevorderen van tumor cel invasie4. Ook Fascin, een bindende eiwit minimaal actine uitgedrukt in normale weefsel, is ook overexpressie in kankercellen i.s.m. filopodia formatie5. Lobopodia formatie laat niet-maligne fibroblasten effectief migreren door middel van de extra-cellulaire matrix, echter het heeft aangetoond dat fibrosarcoma cellen vertrouwen op metalloproteinase activiteit in plaats van lobopodia te vergemakkelijken van cel migratie en invasie6. We hebben aangetoond dat tumor suppressors, met inbegrip van de Ras vereniging domein familie 1 isovorm een (RASSF1A) en DKK3, kan functioneren te veranderen cytoskeletal elementen en bevordering van de vorming van de lamellipodia en invasieve eigenschappen7,8te belemmeren.
Als zodanig, is het cruciaal voor het karakteriseren van de effecten van genen betrokken bij carcinogenese en hun relatie tot de celmembraan extensie, wijzigingen specifiek beoordeling van filopodia, lobopodia en lamellipodia vorming onder testomstandigheden. Huidige state-of-the art technieken omvatten het gebruik van steeds geavanceerdere Microscopie methodes, fluorescerende labelen en/of complexe algoritmes voor data-acquisitie en interpretatie. Hoewel deze methoden nieuwe en krachtige analytische instrumenten bieden, beperkt hun complexiteit hun wijdverbreid gebruik en aanpassingsvermogen in cel biologie-experimenten. Bovendien, de precieze kwantificering en de observatie van veranderingen in cel extensie morfologie is niet typisch gemeten9,10. In tegenstelling, introduceren we een techniek hier die nauwkeurig kwantificeert cel extensie wijzigingen met behulp van standaard microscopische technieken en gemakkelijk aanpasbaar in vitro methoden. Deze methoden ook kwantificeren van elk celtype uitbreiding gelijktijdig voor elke cel geanalyseerd en algemene wijzigingen in het celmembraan extensie repertoire vaststellen. Ook laten we zien hoe deze veranderingen kunnen betrekking hebben op de eigenschappen van de hechting van de cel.
Als een experimentele voorbeeld gebruiken we een eerder gemaakte cellijn van SW-13, aangewezen SW-DDK3, die heeft zijn stabiel transfected met pCMV6-post/DKK3 plasmide vectoren en constitutively overexpresses DKK3, een onderscheidende factor in de bijnier. Non-transfected cellen van het SW-13 en SW-13 cellen stabiel transfected met lege vector (pCMV6-Entry), aangewezen SW-Neo, zal dienen als experimentele besturingselementen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mobiele extensie kenmerken
- Handhaven van SW-13, SW-Neo en SW-DKK3 cellen in een standaard bevochtigde incubator bij 37.0 ° C en 5% CO,2 in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium aangevuld met 10% foetale runderserum en 10.000 U/mL penicilline en streptomycine (uitgeroepen tot 'groeimedium').
- Cellen met behulp van een hemocytometer, tellen en plaat 5.000 cellen per putje voor SW-13, SW-Neo en SW-DKK3 lijnen in aparte 6-Wells-platen en 's nachts groeien in groeimedium op steriele glazen coverslips.
- Nadat overnachting groei, voor elk putje, gecombineerd het groeimedium, wassen van cellen met 1 mL warme-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), en vervolgens het herstellen van de cellen met 1 mL van 3,7% formaldehyde gedurende 10 minuten.
- Aspirate formaldehyde en vlek cellen in elk putje met 1 mL 0,05% kristalviolet voor 30 min. Wash overmaat kleurstof weg met behulp van drie wasbeurten van 1 mL gedeïoniseerd water.
Opmerking: Afhankelijk van het niveau van opname van kleurstof, verschillende extra wasbeurten kunnen nodig zijn om achtergrond kleuring ter bevordering van de cel visualisatie te verwijderen.- Met behulp van fijn omver te werpen pincet, ophalen van coverslips en leg hen gezicht naar beneden in een gelabelde glasplaatje met een daling van duidelijke montage reagens.
- Onder een lichte Microscoop, willekeurig 20 weergave van niet-overlappende cellen te kiezen uit elke dekglaasje aan voor de cel extensie assay.
- Neem photomicrographs bij 400 x vergroting van elke gezichtsveld. Direct het aantal elk type extensie voor elk van de 20 representatieve cellen.
Opmerking: zo 20 geïsoleerde cellen moeten worden onderzocht voor elke geteste voorwaarde om betrouwbare resultaten te waarborgen. Filopodia werden gedefinieerd door cellulaire extensies met een base van 5 micron of minder en een enkele apex. Lobopodia werden gedefinieerd door cellulaire extensies met een basis van 5 tot 20 micron van lengte met extensies met meerdere apices. Lamellipodia werden gedefinieerd door cel extensies die groter zijn dan 20 micron in lengte en met of zonder apices. Afhankelijk van de geteste celtype, de grootte van de cel extensies afwijken en verfijning van de identificatie van de parameters kunnen vereisen.
- Neem photomicrographs bij 400 x vergroting van elke gezichtsveld. Direct het aantal elk type extensie voor elk van de 20 representatieve cellen.
- Bepaal het gemiddelde aantal de extensie van elke cel in elk celtype (d.w.z., SW-13, SW-Neo, SW-DDK) over de 6 putten onderzocht.
- Met behulp van een statistische toets van one-way variantieanalyse (ANOVA), vergelijk verschillen in het gemiddelde percentage van de celmembraan extensies onder de verschillende test celtypes.
2. hechting Assay
- Handhaven van SW-13, SW-Neo en SW-DKK3 cellen in een standaard bevochtigde incubator bij 37.0 ° C en 5% CO2 in groeimedium.
- Met behulp van een hemocytometer, tellen en plaat 100.000 cellen van SW-13, SW-Neo en SW-DKK3 per putje in aparte 6-Wells-platen en 's nachts groeien in groeimedium.
- Zaad 6-Wells-platen voor elk celtype getest, met behulp van één plaat voor elk van de 6 punten van de aangewezen tijd getest onder.
Opmerking: De tijdstippen kunnen variëren voor verschillende soorten cellen.
- Na een incubatieperiode van overnachting, cellen met warme PBS keer wassen dan Voeg 0,5 mL 1 x niet-enzymatische cell dissociatie oplossing aan elk putje.
- Swirl de plaat om te verspreiden van de cel dissociatie oplossing. Gecombineerd de aangewezen plaat op bepaalde tijdstippen (bijvoorbeeld 1, 2, 3, 5, 10 en 15 min) en daarna wassen met 1 mL warme PBS driemaal.
- Tussen de wasbeurten, tik zachtjes op de platen als u wilt loskoppelen van losjes gekoppelde cellen.
- Gecombineerd eventuele resterende PBS en fix de resterende cellen gekoppeld aan de plaat met 1 mL van 3,7% formaldehyde gedurende 10 minuten.
- Vlekken van cellen met 1 mL 0,05% kristalviolet voor 30 min dan wassen van overtollige kleurstof weg met 1 mL gedeïoniseerd water. Titreer wassen ter bevordering van de visualisatie van de cel.
Opmerking: Afhankelijk van het niveau van opname van kleurstof, verschillende extra wasbeurten kunnen nodig zijn ter bevordering van de visualisatie van de cel. - Met behulp van een lichte Microscoop op 100 x vergroting, graaf bevestigd de resterende cellen in elk putje voor elke plaat.
Opmerking: Gebruik van transparante linialen of markering fijne pen gidsen aan de onderzijde van de plaat zal helpen om te voorkomen dat herhaalde tellen van dezelfde cellen. - Het gemiddelde aantal gekoppelde cellen per putje voor elke plaat bepaalt.
- Vergelijk het tarief van onthechting van de cel tussen SW-13, SW-Neo en SW-DDK3 cellen gedurende de bepaalde periode met behulp van een two-way ANOVA statistische toets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de bovenstaande testen, werden de gevolgen van DKK3 overexpressie voor cel extensie morfologie en eigenschappen van cel adhesie getest in de gevestigde ACC cellijn SW-13, in vitro. Overexpressing van DKK3 cellen werden gegenereerd door stabiel transfecting SW-13 cellen met Myc-DDK tagged pCMV6-post/DKK3 plasmide vectoren en uitgeroepen tot SW-DKK3. Stabiel met lege vector pCMV6-Entry transfected cellen werden op dezelfde manier gemaakt als een transfectie en passaging controle en gedefinieerd als SW-Neo. SW-13 cellen werden gebruikt als een extra oudercel-besturingselement. Overexpressie van DKK3 in de SW-DKK3 werd bevestigd door kwantitatieve PCR in real time en Western blot technieken8.
Kort, geteste cellen SW-13, SW-Neo en SW-DKK3 werden geteeld 's nachts in 6 goed platen op cover slips. Cellen werden vervolgens vast met formaldehyde en gekleurd met crystal violet. Eigenschappen van de uitbreiding van de cellen werden dan gekwantificeerd onder microscopie per de parameters hierboven beschreven. Op analyse, SW-DKK3 cellen weergegeven een meer gedifferentieerde fenotype opgemerkt door verhoogde lobopodia en multidirectionele cel polariteit (p = 0,01, one-way ANOVA, Figuur 1 en Figuur 2), suggestief voor een gebrek aan beweeglijkheid van de directionele. In tegenstelling, ouderlijke SW-13 en SW-Neo cellen onderhouden polariteit en grotere filopodia in de stand van een planaire gerangschikt weergegeven (p = 0,01, one-way ANOVA, Figuur 1 en Figuur 2)8.
Om te bepalen of verhoogde lobopodia formatie eigenschappen van de bijlage van de cel gewijzigd, hebben we een cel adhesie test uitgevoerd. Kort, cellen werden 's nachts gekweekt en mobiele-detachement werd uitgevoerd met de niet-enzymatische cell dissociatie oplossing in progressieve tijd intervallen tot 15 min. cellen werden dan vaste met formaldehyde, gekleurd met kristalviolet en geteld met behulp van een licht Microscoop. SW-DKK3 cellen toonde een significant groter bijlage affiniteit in vergelijking met SW-13 en SW-Neo cellen (p < 0,01, 2-way ANOVA, Figuur 3). Deze resultaten wijzen erop dat de DKK3 bevordert de vorming van de lobopodia, die op zijn beurt cel bijlage8 bevordert.
Figuur 1: gedwongen uitdrukking van DKK3 celmembraan extensies verandert. SW-13 (A), SW-Neo (B)en SW-DKK3 (C) cellen werden geteeld op glas coverslips, vaste met formaldehyde, gekleurd met kristalviolet en beeld. Photomicrographs worden genomen met behulp van een lichte Microscoop bij 400 x vergroting. SW-13 en SW-Neo cellen gevormd meestal filopodia (rode pijlpunten) en lamellipodia (blauwe arc) cel extensies. SW-DKK3 cellen gevormd daarentegen meer lobopodia (kleine groene bogen), met in de omgeving van afwezigheid van lamellipodia, en zeer weinig filopodia. Terwijl de SW-13 (A) en SW-Neo (B) -cellen worden weergegeven als gepolariseerde (oranje pijlen) met filopodia op de voorrand en lamellipodia aan de rand van de achterblijvende, cellen SW-DKK3 (C) gelijkmatig verdeelde multidirectionele lobopodia toonde. Experimenten werden uitgevoerd in tweevoud. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: DKK3 bevordert de vorming van de lobopodia. De relatieve vertegenwoordiging van filopodia, lobopodia en lamellipodia per cel voor elk celtype werden berekend door de classificatie van cel extensies op afzonderlijke cellen. Cellen in twintig photomicrographs van willekeurig genomen microscopische veld standpunten (400 x vergroting) van SW-13, SW-Neo en SW-DKK werden gebruikt voor kwantificering. Foutbalken aangegeven standaarddeviatie en (*) geeft aan p < 0.01 met een one-way ANOVA vertegenwoordigen een aanzienlijke toename van het aantal lobopodia in SW-DKK cellen. Een totaal van 20 cellen werden onderzocht voor elke geteste celtype en experimenten werden uitgevoerd in tweevoud. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: DKK bevordert cel adhesie. Honderdduizend SW-13, SW-Neo en SW-DKK3 cellen per putje van 6-Wells-platen mochten 's nachts groeien en werden behandeld voor Detachement bij de aangewezen tijd punten (x-as). De resterende gekoppelde cellen werden vastgesteld, gekleurd en geteld en de percentages van de resterende gekoppelde cellen werden uitgezet (y-as). Foutbalken geven standaarddeviatie en (*) geeft p < 0,01 en (*) geeft aan p < 0.001 met behulp van een 2-way ANOVA vertegenwoordigen een aanzienlijke toename van de SW-DKK cel bijlage sterkte. Elk experiment begonnen met 100.000 cellen en experimenten werden uitgevoerd in tweevoud. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we een in vitro kwantitatieve methode karakteriseren cel extensies met gemak, paar pit-watervallen en betrouwbare reproduceerbaarheid die kan worden toegepast voor de verschillende testomstandigheden. Eenvoudige, kwantificeerbare hechting en/of beweeglijkheid testen kunnen bovendien gelijktijdig worden uitgevoerd om te correleren potentiële functionele betekenis van waargenomen veranderingen in celmembraan extensies.
Deze methoden kunnen echter enkele mogelijke beperkingen inhouden. Ten eerste, de criteria die u hier opgeeft om te identificeren van de verschillende soorten cel extensies zijn gebaseerd op adrenocortical SW-13 cel morfologie en vandaar moeten waarschijnlijk verfijning bij de indeling van de parameters wanneer toegepast op andere typen cellen en/of experimentele omstandigheden. Verder moeten uitgebreide tijdsverloop experimenten, de mogelijke invloeden van celmembraan extensie wijzigingen op de celcyclus en celdood worden beschouwd.
Ten tweede, het protocol zich beroepen op de potentiële geïndividualiseerde bellen door de examinator, die de bepaling van de reproduceerbaarheid als gevolg van Inter waarnemer variatie kan beperken. Het hoge aantal cellen die zijn onderzocht voor iedere testgroep waarschijnlijk overwint deel van dit bias; in het bijzonder wanneer 20 cellen worden onderzocht voor elke assay. Opneming van meerdere personen uit te voeren van de extensie die u aanroept in een geblindeerde mode wordt voorgesteld om het verzachten van de potentiële subjectieve aanroepende bias.
Tot slot, zorg moet worden genomen wanneer wijzigingen in cel extensie klasse schakelaar koppelen aan wijzigingen in de eigenschappen van de bestandsbijlage, waar een vereenvoudigde versie van hechting eigenschappen zou kunnen het resultaat van zijn voorkeur voor bevestiging substraat gewijzigd in plaats van de veranderde affiniteit voor de geteste substraat. Koppeling van de cel extensie klasse schakelaar met migratie of invasie in het kader van de verschillende onderdelen van de extra-cellulaire matrix kan verduidelijken de waargenomen hechting eigenschappen.
Kortom, biedt het protocol hier geschetste een eenvoudige en betrouwbare methode voor het meten van de functionele betekenis van celmembraan extensie schakelaar onder verschillende testomstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De Stichting Arbo subsidie gefinancierd dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
