Summary
מחקר זה מדגים את השירות ואת קלות מדידה הרחבה כמותית קרום התא שלה מתאם קיבולת דבק של תאים. בתור דוגמא מייצגת, אנחנו מראים כאן את הפרוטאין הקשורות Dickkopf 3 (DKK3) מעודד היווצרות מוגברת lobopodia תא adhesiveness ב adrenocortical קרצינומה של תאים במבחנה.
Abstract
הרחבת רפרטואר קרום התא של ממיקרו התנהגויות ממאירים שונים של תאים סרטניים, כולל פוטנציאל דבק, הנדידה שלהם. היכולת במדויק לסווג, לכמת תא הרחבות, למדוד את ההשפעה על קיבולת דבק של התא חיוני לקבוע איך איתות התא בהתנהגות התא סרטן ההשפעה של אירועים, תוקפנות. כאן, אנו מתארים את עיצוב במבחנה ואת השימוש תא סיומת כימות שיטה בשיתוף עם assay קיבולת אדהזיה במודל הוקמה במבחנה adrenocortical קרצינומה (ACC). באופן ספציפי, אנו לבחון את ההשפעות של DKK3, מדכאי בשם ולא גורם פרו-בידול, על פנוטיפ סיומת הממברנה של הקו הסלולרי ACC, SW-13. אנו מציעים מבחני אלה כדי לספק פשוטה יחסית, אמין, מדדים interpretable בקלות כדי מודד את המאפיינים הבאים בתנאים שונים ניסיוני.
Introduction
חגיגת Dysregulated איתות ממלא תפקיד קריטי ממאירות adrenocortical1. בין השיטות במחקר זה לחקור אם להחרשת DKK3, מווסת שלילי של חגיגת איתות, מייצג אירוע dedifferentiation בקליפת יותרת הכליה ומעודדת היווצרות הגידול בהקשר של התא-הרחבת רפרטואר שינויים. DKK3 הוא kDa 38 מופרש גליקופרוטאין עם פפטיד האות N-מסוף מחקרים קודמים הדגימו כי ביטויה נאכפים, גרמו מחזור מעצר התא עכבות התנהגות תוקפנית ממאיר, הפוך אפיתל-mesenchymal מעבר2.
ההתנהגות ממאיר של קרצינומה של adrenocortical (ACC) ואת סוגי סרטן אחרים, בחלק, מושפע את היכולת של תאים סרטניים ממשק עם המשטחים שמסביב, כולל של מטריצה חוץ-תאית, אשר בתורו מקלה על גידול התא הפלישה, הגירה3. תפקידו של קרום התא הספציפי של הרחבות בהתקדמות סרטן הוא להיות הפגינו יותר ויותר בהקשרים שונים, בעיקר דרך היווצרות של filopodia. לדוגמה, ביטוי של תעלות סידן מסוג L נמצאה זירוז היווצרות filopodia ולקדם גידול התא הפלישה4. באופן דומה, תמונה מרתקת, אקטין מחייב חלבון מינימלית לידי רקמה נורמלית, היא גם overexpressed בתאי סרטן בשיתוף עם היווצרות filopodia5. היווצרות Lobopodia מאפשרת fibroblasts שאינם ממאירים להעביר ביעילות דרך המטריקס הסלולר במיוחד, עם זאת, הוכח כי fibrosarcoma תאים להסתמך על פעילות מטאלופרוטאז במקום lobopodia כדי להקל על נדידת תאים ו הפלישה6. הראינו את הגידול הזה מדכאי, כולל ראס האגודה תחום המשפחה 1 isoform (RASSF1A), DKK3, יכול פונקציה כדי לשנות אלמנטים cytoskeletal, לקדם היווצרות lamellipodia ו stymie7,מאפיינים פולשני8.
ככזה, חיוני כדי לאפיין את ההשפעות של גנים המעורבים carcinogenesis והקשר שלהן כדי שינויים סיומת קרום התא, במיוחד הערכת היווצרות filopodia, lobopodia ו- lamellipodia בתנאי מבחן. טכניקות המדינה-של-באמנות הנוכחי כוללים את השימוש שיטות מיקרוסקופ משוכללים, תיוג פלורסנט, ו/או מחשב מורכבת אלגוריתמים עבור רכישת נתונים ופרשנות. בעוד ששיטות אלה מספקים כלים אנליטיים חדש ורב עוצמה, המורכבות שלהם מגבילה את השימוש הנרחב שלהם והתאמה של ניסויים בביולוגיה של התא. יתר על כן, כימות מדויק של התבוננות לשינויים תא סיומת מורפולוגיה אינו נמדד בדרך כלל9,10. לעומת זאת, אנחנו מציגים כאן טכניקה במדויק מכמתת תא סיומת שינויים באמצעות טכניקות מיקרוסקופיים סטנדרטיים ושיטות בקלות להתאמה במבחנה . שיטות אלה גם לכמת כל סוג סיומת תא בו-זמנית עבור כל תא ניתח וקבע שינויים כוללים בהתאם לדרישה ברפרטואר סיומת קרום התא. אנו גם מראים כיצד שינויים אלו יכולים להתחבר מאפייני אדהזיה תא.
כדוגמה ניסיוני, אנו נשתמש קו תא שנוצרה בעבר של SW-13, איזור SW-DDK3, אשר יש stably transfected עם pCMV6-הכניסה/DKK3 פלסמיד וקטורים צורונים overexpresses DKK3, גורם המבדילים בלוטת יותרת הכליה. Non-transfected SW-13 תאים ותאים SW-13 stably transfected עם וקטור ריק (pCMV6-ערך), המיועד SW-ניאו, ישמש פקדים ניסיוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מאפייני השלוחה תא
- לשמור על SW-13, SW-Neo ותאים SW-DKK3 ב תקן humidified החממה ב 37.0 ° C ו- 5% CO2 בינוני נשר שונה של Dulbecco בתוספת 10% סרום שור בעובר ו 10,000 U/mL פניצילין סטרפטומיצין (יועד 'מדיום הגידול').
- לספור תאים באמצעות hemocytometer, צלחת תאים 5,000 לכל בשביל SW-13, SW-Neo וקווים SW-DKK3 לתוך צלחות נפרדות 6-ובכן, גדלים בין לילה במדיום הגידול על coverslips זכוכית סטריליים דקה.
- לאחר צמיחה לילה, במשך כל, תשאף מדיום הגידול, לשטוף תאים עם 1 מ ל תמיסת מלח חמה באגירה פוספט (PBS) ולאחר מכן לתקן את התאים עם 1 מ"ל של 3.7% פורמלדהיד למשך 10 דקות.
- פורמלדהיד וביופסיה ותאי כתם לכל היטב עם 1 מ"ל של 0.05% קריסטל סגול במשך 30 דקות לשטוף עודף לצבוע משם באמצעות שלושה שוטף של יונים 1 מ"ל מים.
הערה: בהתאם לרמת צבע ספיגת, מספר שוטף נוספים עשוי להיות נחוץ כדי להסיר רקע מכתים לקדם ויזואליזציה תא.- בעזרת מלקחיים משופעת בסדר, לאחזר coverslips ולמקם אותם הפנים למטה על משטח זכוכית שכותרתו עם טיפה של ריאגנט הרכבה ברורות.
- תחת מיקרוסקופ אור, בחר באופן אקראי 20 צפיות של תאים שאינם חופפים כל coverslip עבור תא סיומת וזמינותו.
- קח photomicrographs-400 x הגדלה של כל שדה ראייה. ישירות לספור את המספר לכל סוג של סיומת עבור כל התאים נציג 20.
הערה: ככזה, 20 תאים מבודדים צריך להיבדק עבור כל תנאי שנבדקו להבטיח תוצאות אמינות. Filopodia הוגדרו על ידי הרחבות הסלולר עם בסיס של 5 מיקרון או פחות, של איפקס יחיד. Lobopodia הוגדרו על ידי הרחבות הסלולר עם בסיס של 5 עד 20 מיקרון של הרחבות המכיל אורך עם apices מרובים. Lamellipodia הוגדרו על ידי הרחבות תא שגדולים מ 20 מיקרונים אורך, עם או בלי apices. בהתאם לסוג התא שנבדקו, הגדלים של הרחבות התא עשויים להיות שונים ועשויה עידון של זיהוי הפרמטרים.
- קח photomicrographs-400 x הגדלה של כל שדה ראייה. ישירות לספור את המספר לכל סוג של סיומת עבור כל התאים נציג 20.
- לקבוע את המספר הממוצע של כל סיומת תא בכל סוג התא (קרי, SW-13, SW-Neo, SW-DDK) על פני הבארות 6 בחן.
- באמצעות מבחן סטטיסטי חד-כיווני השונות (ANOVA), להשוות הבדלים האחוז הממוצע של קרום התא הרחבות בין סוגי תאים בדיקה שונים.
2. אדהזיה Assay
- לשמור על SW-13, SW-Neo ותאים SW-DKK3 ב חממה humidified סטנדרטי-37.0 ° C ו- 5% CO2 במדיום הגידול.
- משתמש של hemocytometer, נחשב צלחת 100,000 תאים של SW-13, SW-Neo SW-DKK3 לכל טוב לתוך צלחות נפרדות 6-ובכן, גדלים בין לילה מדיום הגידול.
- זרע צלחות. ובכן 6 עבור כל סוג התא בדקה, באמצעות לוח אחד לכל אחד הנקודות הייעודית 6 נבדק מתחת.
הערה: הנקודות הזמן עשויים להשתנות עבור סוגי תאים שונים.
- לאחר דגירה לילה, שטיפת תאים עם החמים PBS פעם לאחר מכן להוסיף 0.5 מ ל 1 x תא הלא-אנזימטי דיסוציאציה פתרון טוב לכל.
- מערבולת את הצלחת להפיץ את הפתרון דיסוציאציה התא. וארוקן את הצלחת המיועד בנקודות זמן מוגדר (קרי, 1, 2, 3, 5, 10 ו- 15 דקות) ולאחר מכן לשטוף עם פתרון PBS חמים 1 מ ל שלוש פעמים.
- בין שוטף, טפח בעדינות את הצלחות להתנתק תאים המחוברים באופן רופף.
- תשאף כל PBS הנותרים, תיקון התאים הנותרים מחובר לצלחת עם 1 מ"ל של 3.7% פורמלדהיד למשך 10 דקות.
- כתם תאים עם 1 מ"ל של 0.05% קריסטל סגול במשך 30 דקות ולאחר מכן לשטוף את עודף צבע עם 1 מ ל מים יונים. Titrate השטיפה כדי לקדם את התא חזותי.
הערה: בהתאם לרמת צבע ספיגת, מספר שוטף נוספים עשוי להיות נחוץ כדי לקדם את התא להדמיה. - באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה x 100, לספור תאים המצורפת כל היטב על כל צלחת.
הערה: שימוש בסרגלים שקוף או סימון עט בסדר מדריכים בצד התחתון של הצלחת יסייע למנוע ספירת חוזרת ונשנית לאותם התאים. - לקבוע את המספר הממוצע של תאים המצורפת לכל טוב על כל צלחת.
- להשוות את הקצב של ניתוק התא בין SW-13, SW-Neo ותאים SW-DDK3 על פני תקופת זמן נתון באמצעות מבחן סטטיסטי דו-כיווני ANOVA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות את מבחני לעיל, ההשפעות של ביטוי DKK3 על מורפולוגיה השלוחה תא והמאפיינים תא אדהזיה נבדקו הקו תא ACC הוקמה SW-13, במבחנה. תאים overexpressing DKK3 נוצרו כתוצאה stably transfecting SW-13 תאים עם Myc-DDK מתויגות pCMV6-הכניסה/DKK3 פלסמיד המומנט ואת איזור בשם SW-DKK3. באופן דומה, תאים stably transfected עם וקטור ריק pCMV6-כניסה היו שנוצר כפקד תרביות תאים, passaging ומוגדר בשם SW-Neo. SW-13 תאים שימשו פקד האב תאים נוספים. ביטוי של DKK3 ב- SW-DKK3 אושר ע י ה-PCR כמותי בזמן אמת, ווסטרן כתם טכניקות8.
בקצרה, נבדקו תאים SW-13, SW-Neo SW-DKK3 היו גדל בין לילה 6 צלחות היטב על שער גולשת. התאים היו לאחר מכן קבועה עם פורמלין, מוכתם קריסטל ויולט. מאפייני השלוחה תא היו אז לכמת תחת מיקרוסקופ לכל שאר הפרמטרים המתוארים לעיל. על ניתוח, SW-DKK3 התאים מוצג פנוטיפ יותר הבדיל שהצהיר lobopodia מוגברת, קוטביות תא רב-כיווני (p = 0.01, חד-כיווני אנובה, איור 1 , איור 2), רמיזות של חוסר תנועתיות כיוונית. לעומת זאת, SW-13 הורים ותאי SW-Neo מתוחזק קוטביות ומוצגים filopodia גדולה יותר מסודרים כיוון מישורי (p = 0.01, חד-כיווני אנובה, איור 1 , איור 2)8.
כדי לקבוע שאם היווצרות מוגברת lobopodia שונה מאפייני קובץ מצורף תא, ביצענו assay אדהזיה של התא. בקצרה, התאים גדלו בן לילה ובוצע ניתוק התא עם תא אנזימטי דיסוציאציה פתרון בזמן מתקדמת מרווחי עד 15 דק תאים היו ולאחר מכן קבועה עם פורמלין, מוכתם קריסטל ויולט, וספרתי באמצעות אור מיקרוסקופ. SW-DKK3 תאים הראה משיכה מצורף גדול יותר באופן משמעותי לעומת תאים SW-13 ו- SW-ניאו (p < 0.01, 2-way ANOVA, איור 3). תוצאות אלו מצביעות על DKK3 מקדמת את היווצרות lobopodia, אשר בתורו מקדם התא מצורף8.
איור 1: ביטוי שנאכפת DKK3 הפיצולים הרחבות קרום התא. SW-13 (א), SW-ניאו (B)ו- SW-DKK3 (ג) התאים היו גדל על coverslips זכוכית דקה, קבוע עם פורמלין, מוכתם קריסטל ויולט, עם תמונה. Photomicrographs נלקחים באמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה x 400. תאים SW-13 ו- SW-Neo נוצרו בעיקר filopodia (חץ אדום) והרחבות תא lamellipodia (arc כחול). לעומת זאת, תאים SW-DKK3 נוצרו יותר lobopodia (arcs ירוק קטן), עם היעדר ליד lamellipodia, מעט מאוד filopodia. בעוד התאים (B) SW-13 (א) ו- SW-Neo מופיע להיות מקוטב (כתום חצים) עם filopodia בחוד, lamellipodia בקצה לקרטע, SW-DKK3 תאים (ג) הראה המתפלג lobopodia רב-כיווני. הניסויים בוצעו ב כפילויות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: DKK3 מקדמת את היווצרות lobopodia. הייצוג היחסי של filopodia, lobopodia ו- lamellipodia עבור כל תא עבור כל סוג התא חושבו באמצעות ליווח תא שלוחות תאים בודדים. בתאים photomicrographs עשרים בתחום מיקרוסקופיים נלקח באופן אקראי של תצוגות (400 x הגדלה) של SW-13, SW-Neo SW-DKK שימשו כמת. קווי שגיאה המצוין סטיית תקן ומציין (*) p < 0.01 באמצעות של אנובה בכיוון אחד המייצג עלייה משמעותית במספר lobopodia בתאים SW-DKK. סכום כולל של 20 תאים נבדקו עבור כל סוג התא שנבדקו, הניסויים בוצעו ב כפילויות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: DKK מקדמת אדהזיה תא. מאה אלף SW-13, SW-Neo ותאים SW-DKK3 לכל טוב של לוחות 6-ובכן היו מותר לגדל בן לילה וטופלו על ניתוק בנקודות הייעודית (ציר x). התאים הנותרים המצורפת היו קבועים, צבעונית, נספרים, האחוזים של התאים הנותרים המצורפת היו המותווים (ציר y). קווי שגיאה מציינות סטיית תקן ומציין (*) p < 0.01 ו (*) מציינת p < 0.001 שימוש של 2-way ANOVA המייצג לעליה משמעותית SW-DKK תא הכוח המצורף. ניסוי התחיל עם 100,000 תאים, הניסויים בוצעו ב כפילויות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן נתאר במבחנה כמותיים שיטה לאפיון תא הרחבות עם נוחות, כמה נפילות בור הפארמצבטית אמין זה יכול להיות מיושם בתנאים שונים. יתר על כן, מבחני אדהזיה ו/או תנועתיות פשוטות, הניתנות לכימות, ניתן לבצע בו זמנית לתאם פוטנציאליים תפקודית משמעות השינויים שנצפו בהרחבות קרום התא.
עם זאת, שיטות אלה עשויים להציג כמה מגבלות אפשריות. ראשית, הקריטריונים שצוינו כאן כדי לזהות סוגים שונים של תאים הרחבות מבוססים על מורפולוגיה תאים SW-13 adrenocortical, ולכן סביר להניח שיהיה עליך עידון בסיווג פרמטרים כאשר חל על סוגי תאים אחרים ו/או תנאי הניסוי. יתר על כן, בניסויים זמן-קורס מורחב, ההשפעות פוטנציאלי של קרום התא סיומת. שינויים על מחזור התא ומוות תא צריכים לקחת בחשבון.
שנית, הפרוטוקול עשוי להסתמך על תגובותיהם פוטנציאלי מתקשר על ידי הבודק, אשר יכול להגביל הפארמצבטית של וזמינותו עקב הבין-הצופה וריאציה. המספר הגבוה של תאים נבדקים עבור כל קבוצה המבחן סביר מתגבר על חלק הנטיה הזו; באופן ספציפי, כאשר תאים 20 נבדקים עבור כל וזמינותו. הכללת אנשים מרובים לבצע הרחבה מתקשר באופן עיוור הוא הציע לצמצם הטיה קורא סובייקטיבית פוטנציאליים.
לבסוף, כדאי לשים לב כאשר שיוך שינויים במאפייני הקובץ המצורף, איפה גרסה מפושטת של מאפייני אדהזיה יכול להיות התוצאה של שינויים בבורר מחלקה השלוחה תא שינה העדפה מצורף תשתית במקום הקרבה שינו תשתית שנבדקו. צימוד בבורר מחלקה סיומת תא עם הגירה או פלישה בהקשר של רכיבים שונים של מטריקס הסלולר במיוחד יכול להבהיר את המאפיינים אדהזיה שנצפו.
לסיכום, פרוטוקול שמפורטות כאן מספק שיטה פשוטה ואמינה למדידת משמעות תפקודית של קרום התא מתג סיומת בתנאים מבחן שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
קרן גרנט Ohse ממומנת עבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
