Application de mesure de l’électrophysiologie pour étudier l’activité des transporteurs de l’Electro-neutre
Summary
Ce manuscrit décrit les applications des électrodes sélectives proton et patch serrage des méthodes pour mesurer l’activité des systèmes de transport de protons. Ces méthodes surmonter certaines limitations des techniques communément utilisées pour étudier l’activité de transport de protons, tels que la sensibilité modérée, résolution temporelle et contrôle insuffisant milieu intracellulaire.
Abstract
Le transport des ions à travers les membranes cellulaires assure le contrôle précis de la teneur en ion au sein et en dehors de la cellule qui est indispensable pour la survie des cellules. Ces mécanismes de transport sont induits par les activités des protéines transporteur spécialisé. Plus précisément, pH dynamique est finement contrôlée par des systèmes d’extrusion membrane plasmique proton (H+), tels que le Na+/h+ famille de protéines échangeur (NHE). Malgré des efforts considérables afin d’étudier les mécanismes qui sous-tendent le règlement NHE, notre compréhension actuelle des propriétés biophysiques et moléculaires de la famille NHE est insuffisante en raison de la disponibilité limitée des méthodes pour mesurer efficacement l’activité NHE . Dans ce manuscrit, nous avons utilisé H+-électrodes sélectives au cours de la cellule entière patch serrage enregistrement afin de mesurer les flux induits par NHE H+ . Nous avons proposé cette approche pour surmonter certaines limitations de généralement utilisé des méthodes pour mesurer l’activité NHE, telles que l’absorption radioactif et molécules membranaires fluorescents. Mesure de l’activité NHE en utilisant la méthode décrite permet à haute sensibilité et la résolution temporelle et un contrôle plus efficace des concentrations intracellulaires de H+ . H+-électrodes sélectives sont basé sur le fait que l’activité de transporteur crée un gradient d’ions à proximité de la membrane cellulaire. Un H+-électrode sélective se déplaçant jusqu’à et à l’extérieur de la membrane cellulaire de manière répétitive, oscillatoire enregistre une différence de tension qui dépend des flux H+ . Alors que H+-électrodes sélectives permettent de détecter les flux de H+ sortir de la cellule, la méthode de serrage patch dans la configuration de la cellule entière est utilisée pour contrôler la composition ionique intracellulaire. En outre, application de la technique du géant patch clamp permet de modifier la composition intracellulaire non seulement des ions, mais aussi des lipides. L’activité de transporteur de l’isoforme NHE 3 (NHE3) a été mesurée à l’aide de cette approche technique pour étudier la base moléculaire du NHE3 règlement par phosphoinositides.
Introduction
Transport des ions et de solutés à travers la membrane de plasma est essentielle à la survie des cellules et, par conséquent, des organismes1. Transport sélectif d’ions et de solutés est obtenue par un ensemble de canaux spécialisé et protéines transporteur. Des mutations dans ces protéines se traduisent souvent par une variété d’affections cliniques, rendu canal et transporteur de protéines des cibles potentielles pour le traitement pharmacologique1. Malheureusement, la compréhension des mécanismes qui sous-tendent la fonction canal et le transporteur et la régulation est souvent limitée par les approches disponibles afin d’étudier leur activité2,3,4.
Plus précisément, transporteurs peuvent être grossièrement subdivisés en deux grands groupes selon qu’ils modifient le potentiel transmembranaire de la cellule au cours du transport de solutés : les transporteurs d’ion électrogénique altérant [par exemple, -phosphate de sodium cotransporteur 2 a (NaPi2a), échangeur de sodium-calcium (NCX), etc..] ou les transporteurs d’ion électriquement neutres non altération [p. ex., échangeur de sodium-proton (NHE), cotransporteur sodium-chlorure, NaPi2c, etc..]. Les activités de ces deux catégories de transporteurs ont été étudiées intensivement à l’aide de l’absorption des isotopes radioactifs et fluorescentes membrane perméable colorants2. Les deux approches estiment l’activité des transporteurs en mesurant les changements dans la concentration globale des ions cytoplasmiques spécifiques, et les deux méthodes ont des limites, telles que la sensibilité modérée et une résolution temporelle et un contrôle inadéquat de l’intracellulaire milieu. En effet, l’activité de nombreux transporteurs est dépendante de la concentration cytoplasmique des ions transportées (par exemple, NHE3, NCX), et les changements dans les concentrations de ces ions sont susceptibles de jouer un rôle important dans la régulation de l’activité de transporteur2 , 3 , 5. des mesures précises de ces mécanismes réglementaires se limite à l’aide de méthodes classiques.
Pour surmonter ces limites, patch clamp méthodes sont utilisées pour étudier l’activité de transporteur2,6. Plus précisément, l’auto-référentielle électrodes sélectives (ISEs)7,8 , combiné avec le patch, système de serrage a récemment permis la mesure électroneutre transporteur activité3,4 , 5. ISEs sont basé sur le fait que l’activité de transporteur crée un gradient d’ions à proximité de la membrane cellulaire. Une ISE se déplaçant vers le haut et loin de la membrane cellulaire dans une répétition, mode oscillatoire enregistre une différence de tension (µV). Différences de tension peuvent être convertis en valeurs du flux ionique à l’aide d’une méthode d’étalonnage qui s’applique la première loi de Fick de la diffusion2,9. Tandis que SIES sont utilisés pour détecter le flux d’ions mobiles de cellules, la méthode de serrage patch dans les deux cellules entières ou des configurations de dedans-dehors est utilisé pour contrôler la composition ionique intracellulaire et potentiels de membrane. En outre, l’application de la technique du géant patch clamp permet la modification de la composition intracellulaire de non seulement des ions, mais aussi des lipides et protéines,3,5.
En résumé, la polyvalence de la méthode de serrage patch contre que d’autres méthodes pour étudier, activité de transporteur a fait patch de serrage appropriés pour surmonter les problèmes habituels de ces autres méthodes. La combinaison d’auto-référence ISEs et techniques de patch clamp offre la possibilité unique de mesurer l’activité des transporteurs électroneutre dans un environnement expérimental étroitement contrôlé et à découvrir le roman moléculaire et biophysique Propriétés de la membrane cellulaire des transports3,4,5. Cette approche a été utilisée avec succès pour étudier l’activité de la NHE. La famille de protéine chez les mammifères NHE catalyse l’échange net électroneutre de sodium extracellulaire (Na+) pour proton intracellulaire (+H)10,11 utilisant un gradient de Na+ vers l’intérieur. Chez les mammifères, la famille de protéine NHE comprend 11 protéines apparentées (NHE1-9 et NHA1-2) et un spermatozoïde spécifiques NHE10,12,13.
NHEs (famille SLC9a) sont retrouvent partout dans les organismes vivants la plupart de simples procaryotes aux eucaryotes supérieurs et sont impliqués dans une variété de cellule vitale fonctions10,11, y compris contrôler la défense cellulaire de salinité en procaryotes, maintenir acide-base l’homéostasie et cell volume et régulation de l’absorption de sel et d’eau dans divers épithéliums spécialisés10,12,14,15. Ont a déterminé les principaux rôles biologiques de NHEs et l’importance de leurs fonctions par le biais de plusieurs études ; Cependant, peu d’études ont étudié les propriétés biophysiques et moléculaires des mammifères NHEs en raison des limites méthodologiques4. Récemment, l’application de l’auto-référence ISEs au cours de la cellule entière patch serrage a révélé de nouveaux mécanismes moléculaires d’isoformes NHE réglementés par des changements de la concentration intracellulaire des ions, de phospholipides et de protéines3, 4.
Plus précisément, le protocole prévu dans ce manuscrit présente les méthodes et les approches pour l’étude de l’activité et la régulation de l’isoforme NHE 3 (NHE3), un acteur majeur dans l’absorption de Na+, Cl–, HCO3– et fluide dans les bordure en brosse de l’épithélium rénal et intestinal,14,16. Nouvel aperçu des différences dans la sensibilité de l’activité NHE3 à phosphoinositides intracellulaires (phosphatidylinositide 4, 5-bisphosphate [PI (4,5) P2] et phosphatidylinositide 3,4,5-triphosphate [PI(3,4,5]P3]) est signalé. Protéines de transport de cellules, telles que les canaux et les transporteurs, sont réglementés par les phosphoinositides17, et NHE3 lie directement les PI (4,5) P2 et P3 de PI (3,4,5)18. Se fondant sur la littérature actuelle, soit phosphoinositide pourrait être pertinente pour la régulation physiologique ou physiopathologique de NHE35,18,19. Nos résultats supportent les rôles distincts pour PI (4,5) P2 et P3 de PI (3,4,5) dans la régulation de l’activité NHE3. Cette distinction n’a été possible en raison de l’application de techniques ISE en combinaison avec l’enregistrement de cellules entières patch clamp. Cette technique permet également le contrôle de la teneur cellulaire en phosphoinositides par la perfusion intracellulaire des phosphoinositides différents pendant la mesure de l’activité NHE3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Malgré les fonctions essentielles des transporteurs, les méthodes disponibles pour étudier leur activité sont inefficaces et insuffisants. Une seule limitation est que les méthodes disponibles mesurent mouvement ionique médiée par l’activité de transporteur sans tenir compte des fluctuations de la composition en ions intracellulaires au cours de l’expérience4. La méthode présentée permet un contrôle précis des compositions des ions intracellulaires et extracellulaires et offre un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Eric Fishback (Université Des Moines, Des Moines, Iowa, USA) pour son aide avec le tournage et le montage de la vidéo. Les cellules fibroblastes PS120 exprimant de manière stable NHE3-wt ou NHE3-YRK ont été gracieusement fournis par le Dr Mark Donowitz (école de médecine de l’Université de Johns Hopkins, Baltimore, MD, é.-u.).
Materials
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I – cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 | |
References
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. . Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. . Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L’Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. . Microelectrode Techniques – The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).
