Summary
Ce manuscrit décrit les applications des électrodes sélectives proton et patch serrage des méthodes pour mesurer l’activité des systèmes de transport de protons. Ces méthodes surmonter certaines limitations des techniques communément utilisées pour étudier l’activité de transport de protons, tels que la sensibilité modérée, résolution temporelle et contrôle insuffisant milieu intracellulaire.
Abstract
Le transport des ions à travers les membranes cellulaires assure le contrôle précis de la teneur en ion au sein et en dehors de la cellule qui est indispensable pour la survie des cellules. Ces mécanismes de transport sont induits par les activités des protéines transporteur spécialisé. Plus précisément, pH dynamique est finement contrôlée par des systèmes d’extrusion membrane plasmique proton (H+), tels que le Na+/h+ famille de protéines échangeur (NHE). Malgré des efforts considérables afin d’étudier les mécanismes qui sous-tendent le règlement NHE, notre compréhension actuelle des propriétés biophysiques et moléculaires de la famille NHE est insuffisante en raison de la disponibilité limitée des méthodes pour mesurer efficacement l’activité NHE . Dans ce manuscrit, nous avons utilisé H+-électrodes sélectives au cours de la cellule entière patch serrage enregistrement afin de mesurer les flux induits par NHE H+ . Nous avons proposé cette approche pour surmonter certaines limitations de généralement utilisé des méthodes pour mesurer l’activité NHE, telles que l’absorption radioactif et molécules membranaires fluorescents. Mesure de l’activité NHE en utilisant la méthode décrite permet à haute sensibilité et la résolution temporelle et un contrôle plus efficace des concentrations intracellulaires de H+ . H+-électrodes sélectives sont basé sur le fait que l’activité de transporteur crée un gradient d’ions à proximité de la membrane cellulaire. Un H+-électrode sélective se déplaçant jusqu'à et à l’extérieur de la membrane cellulaire de manière répétitive, oscillatoire enregistre une différence de tension qui dépend des flux H+ . Alors que H+-électrodes sélectives permettent de détecter les flux de H+ sortir de la cellule, la méthode de serrage patch dans la configuration de la cellule entière est utilisée pour contrôler la composition ionique intracellulaire. En outre, application de la technique du géant patch clamp permet de modifier la composition intracellulaire non seulement des ions, mais aussi des lipides. L’activité de transporteur de l’isoforme NHE 3 (NHE3) a été mesurée à l’aide de cette approche technique pour étudier la base moléculaire du NHE3 règlement par phosphoinositides.
Introduction
Transport des ions et de solutés à travers la membrane de plasma est essentielle à la survie des cellules et, par conséquent, des organismes1. Transport sélectif d’ions et de solutés est obtenue par un ensemble de canaux spécialisé et protéines transporteur. Des mutations dans ces protéines se traduisent souvent par une variété d’affections cliniques, rendu canal et transporteur de protéines des cibles potentielles pour le traitement pharmacologique1. Malheureusement, la compréhension des mécanismes qui sous-tendent la fonction canal et le transporteur et la régulation est souvent limitée par les approches disponibles afin d’étudier leur activité2,3,4.
Plus précisément, transporteurs peuvent être grossièrement subdivisés en deux grands groupes selon qu’ils modifient le potentiel transmembranaire de la cellule au cours du transport de solutés : les transporteurs d’ion électrogénique altérant [par exemple, -phosphate de sodium cotransporteur 2 a (NaPi2a), échangeur de sodium-calcium (NCX), etc..] ou les transporteurs d’ion électriquement neutres non altération [p. ex., échangeur de sodium-proton (NHE), cotransporteur sodium-chlorure, NaPi2c, etc..]. Les activités de ces deux catégories de transporteurs ont été étudiées intensivement à l’aide de l’absorption des isotopes radioactifs et fluorescentes membrane perméable colorants2. Les deux approches estiment l’activité des transporteurs en mesurant les changements dans la concentration globale des ions cytoplasmiques spécifiques, et les deux méthodes ont des limites, telles que la sensibilité modérée et une résolution temporelle et un contrôle inadéquat de l’intracellulaire milieu. En effet, l’activité de nombreux transporteurs est dépendante de la concentration cytoplasmique des ions transportées (par exemple, NHE3, NCX), et les changements dans les concentrations de ces ions sont susceptibles de jouer un rôle important dans la régulation de l’activité de transporteur2 , 3 , 5. des mesures précises de ces mécanismes réglementaires se limite à l’aide de méthodes classiques.
Pour surmonter ces limites, patch clamp méthodes sont utilisées pour étudier l’activité de transporteur2,6. Plus précisément, l’auto-référentielle électrodes sélectives (ISEs)7,8 , combiné avec le patch, système de serrage a récemment permis la mesure électroneutre transporteur activité3,4 , 5. ISEs sont basé sur le fait que l’activité de transporteur crée un gradient d’ions à proximité de la membrane cellulaire. Une ISE se déplaçant vers le haut et loin de la membrane cellulaire dans une répétition, mode oscillatoire enregistre une différence de tension (µV). Différences de tension peuvent être convertis en valeurs du flux ionique à l’aide d’une méthode d’étalonnage qui s’applique la première loi de Fick de la diffusion2,9. Tandis que SIES sont utilisés pour détecter le flux d’ions mobiles de cellules, la méthode de serrage patch dans les deux cellules entières ou des configurations de dedans-dehors est utilisé pour contrôler la composition ionique intracellulaire et potentiels de membrane. En outre, l’application de la technique du géant patch clamp permet la modification de la composition intracellulaire de non seulement des ions, mais aussi des lipides et protéines,3,5.
En résumé, la polyvalence de la méthode de serrage patch contre que d’autres méthodes pour étudier, activité de transporteur a fait patch de serrage appropriés pour surmonter les problèmes habituels de ces autres méthodes. La combinaison d’auto-référence ISEs et techniques de patch clamp offre la possibilité unique de mesurer l’activité des transporteurs électroneutre dans un environnement expérimental étroitement contrôlé et à découvrir le roman moléculaire et biophysique Propriétés de la membrane cellulaire des transports3,4,5. Cette approche a été utilisée avec succès pour étudier l’activité de la NHE. La famille de protéine chez les mammifères NHE catalyse l’échange net électroneutre de sodium extracellulaire (Na+) pour proton intracellulaire (+H)10,11 utilisant un gradient de Na+ vers l’intérieur. Chez les mammifères, la famille de protéine NHE comprend 11 protéines apparentées (NHE1-9 et NHA1-2) et un spermatozoïde spécifiques NHE10,12,13.
NHEs (famille SLC9a) sont retrouvent partout dans les organismes vivants la plupart de simples procaryotes aux eucaryotes supérieurs et sont impliqués dans une variété de cellule vitale fonctions10,11, y compris contrôler la défense cellulaire de salinité en procaryotes, maintenir acide-base l’homéostasie et cell volume et régulation de l’absorption de sel et d’eau dans divers épithéliums spécialisés10,12,14,15. Ont a déterminé les principaux rôles biologiques de NHEs et l’importance de leurs fonctions par le biais de plusieurs études ; Cependant, peu d’études ont étudié les propriétés biophysiques et moléculaires des mammifères NHEs en raison des limites méthodologiques4. Récemment, l’application de l’auto-référence ISEs au cours de la cellule entière patch serrage a révélé de nouveaux mécanismes moléculaires d’isoformes NHE réglementés par des changements de la concentration intracellulaire des ions, de phospholipides et de protéines3, 4.
Plus précisément, le protocole prévu dans ce manuscrit présente les méthodes et les approches pour l’étude de l’activité et la régulation de l’isoforme NHE 3 (NHE3), un acteur majeur dans l’absorption de Na+, Cl–, HCO3– et fluide dans les bordure en brosse de l’épithélium rénal et intestinal,14,16. Nouvel aperçu des différences dans la sensibilité de l’activité NHE3 à phosphoinositides intracellulaires (phosphatidylinositide 4, 5-bisphosphate [PI (4,5) P2] et phosphatidylinositide 3,4,5-triphosphate [PI(3,4,5]P3]) est signalé. Protéines de transport de cellules, telles que les canaux et les transporteurs, sont réglementés par les phosphoinositides17, et NHE3 lie directement les PI (4,5) P2 et P3 de PI (3,4,5)18. Se fondant sur la littérature actuelle, soit phosphoinositide pourrait être pertinente pour la régulation physiologique ou physiopathologique de NHE35,18,19. Nos résultats supportent les rôles distincts pour PI (4,5) P2 et P3 de PI (3,4,5) dans la régulation de l’activité NHE3. Cette distinction n’a été possible en raison de l’application de techniques ISE en combinaison avec l’enregistrement de cellules entières patch clamp. Cette technique permet également le contrôle de la teneur cellulaire en phosphoinositides par la perfusion intracellulaire des phosphoinositides différents pendant la mesure de l’activité NHE3.
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Protocol
Remarque : Deux amplificateurs sont requis pour l’enregistrement de l’activité des transporteurs électriquement par un ISE auto-référentielle en conjonction avec le patch de serrage, un amplificateur de pince de patch pour maintenir la cellule en une configuration cellule entière et une haute impédance amplificateur ( électromètre) pour enregistrer l’activité de transporteur par l’intermédiaire de l’ISE (voir Table des matières). L’amplificateur de patch clamp est directement relié à la borne de carte d’acquisition. L’électromètre est connecté à l’amplificateur différentiel utilisée pour filtrer et amplifier le signal. L’amplificateur différentiel est reliée à la borne de carte d’acquisition. Capmeter, logiciel de pince de patch qui surveille la capacité de la cellule, a été utilisée dans les précédentes études20 (voir Table des matières). Les solutions de chambre et de la perfusion d’enregistrement sont maintenues à 37 ° C.
1. préparation des Pipettes pour ISEs
- Tirez sur les pipettes de verre borosilicaté capillaires d’un diamètre extérieur de 1,2 mm (voir Table des matières) à l’aide de la pipette puller2 .
- Polir la pipette à l’aide de la microforge. Le diamètre de l’embout de la pipette doit être 2 à 3 µm.
- Placez les pipettes dans un porte-pot pour pipettes avec l’embout de la pipette vers le haut (voir Table des matières).
ATTENTION : Effectuez des opérations 1.4-1.6 sous une hotte chimique bien aéré. - Mélanger le mélange de siliconage qui se compose de 1 goutte (~ 150 µL) de bis (diméthylamino) diméthyl silane et 10 gouttes de tétrachlorure de carbone (voir Table des matières).
- Versez le mélange de siliconage dans le bocal et bien fermer le couvercle.
- Incuber le bocal avec le mélange de siliconage pendant 24-48 h sous une hotte chimique à température ambiante jusqu'à ce que le mélange est complètement évaporé.
- Remblayer la pipette avec la résine sélectives appropriée pour créer une colonne d’environ 2 à 4 mm.
NOTE : Ionophore hydrogène j’ai cocktail B peut être utiliséspour enregistrement NHE activité (voir Table des matières). - Appuyez sur l’extrémité de la pipette pour répartir la résine sélectives à la pointe et placez la pipette verticalement dans le support de pot avec l’embout de la pipette vers le bas.
- Checkunder le microscope à dissection que le cocktail de résine a atteint l’extrémité de la pointe. Si nécessaire, appliquer une pression positive pour pousser la résine jusqu’au bout.
- Remblayer la moitié-pipette avec la solution appropriée (~ 100 μL). Ici, utilisez KCl 100 mM et 10 mM HEPES à un pH de 7.0 si vous utilisez ionophore j’ai cocktail B.
- Connectez l’ISE à l’électromètre et placer l’embout de l’ISE dans la solution de bain utilisée pour l’enregistrement. Zéro l’électromètre.
- Tester le H+-réponse sélective de ISE en changeant le pH de la solution du bain. Le moyen H+-réponse sélective de ISE est ~ 58 mV par unité de pH.
- Évaluer périodiquement la réponse de l’ISE à l’étalonnage.
2. préparation du Patch Clamp Pipettes pour l’enregistrement
Remarque : La méthode décrite par Donald Hilgemann dans son article sur l’enregistrement du Single-Channel21 est recommandée.
- Tirez sur les pipettes pour patch géant de capillaires en verre borosilicate (mmOD 2,0 / 1,5 mm ID) sur la pipette puller2,22,23.
- Utilisez une microforge montés sur la scène d’un microscope inversé pour faire une pipette large pointe (10-22 μm)23. Faire fondre un boudin (~ 0,5 mL) de verre mou sur le fil de platine épais de la microforge.
Remarque : Un fil de platine relativement épais est nécessaire (~0.5 mm) pour fabriquer des pipettes de patch géant. - Positionner la pipette à proximité de la perle de verre doux et appliquer de la chaleur totale jusqu'à ce que la pointe commence à s’estomper. Le fil de platine se déplace légèrement vers le centerduring de chauffage.
- Eteignez le feu et pousser l’embout de la pipette dans la perle de verre. Le fil de refroidissement va se rétracter et casser l’embout de la pipette.
- Réappliquer la chaleur pour lisser la pointe de pipette et créer un embout de la pipette du diamètre désiré. Le diamètre de la pointe dépend de la taille de la cellule pour être patché (8-10 μm dans cette étude).
3. préparation des cellules
- Échauffement de la saline de tampon phosphate (PBS) sans Ca2 + et Mg2 +, solution de trypsine-EDTA et le milieu de culture à 37 ° C.
- Laver les cellules deux fois avec du PBS. Utiliser 1 mL de tampon pour la plaque de culture cellulaire 35 mm de diamètre.
- Ajouter 0,5 mL de trypsine aux cellules pour plaque de culture cellulaire 35 mm de diamètre.
Remarque : Lorsque les cellules commencent à la rafle, secouer la plaque pour fixer hors des cellules. - Arrêter l’action de la trypsine en ajoutant 5 mL (quantité pour plaque de culture cellulaire 35 mm de diamètre) du milieu de culture complet additionné de sérum de veau fœtal 10 %.
NOTE : Le temps de réaction à la trypsine est type cellulaire dépendante. - Placer les cellules sur un agitateur avec bascule pour éviter la formation de touffes.
- Utiliser des cellules pour jusqu'à 2 h après la trypsinisation.
Remarque : Le temps peut varier selon la lignée cellulaire.
4. Elaboration d’un système de Perfusion Intra-Pipette
- Couper à la bonne taille du tube de quartz (150 µm OD / 75 µm ID) pour préparer la ligne de perfusion intra-pipette.
- Insérez un côté du tube quartz dans un cône de pipette 200 µL. Coller le tube de quartz sur la pointe et coupez l’extrémité de la pointe avec une lame de rasoir tranchante.
- Se connecter à la ligne de perfusion (tubulure de quartz collé à la pointe) à un petit morceau de tube de silicone qui pourrait servir de réservoir pour la solution de perfusion intra-pipette.
- Raccordez le tuyau de silicone d’une seringue pour créer une pression positive.
- Insérez l’extrémité libre du tube quartz à travers le tube de polyéthylène du titulaire de la pipette de la perfusion de port (voir Table des matières).
- Évaluer la ligne de perfusion avec la solution de la pipette.
5. préparation des Solutions
- Préparer une solution de la pipette fortement tamponnée pour enregistrement NHE (115 mM potassium aspartate (KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, tuyaux de 12,5 mM, vadrouilles de 12,5 mM et 12,5 mM MES, pH 6,0 ajusté avec de l’acide aspartique).
NOTE : Préparer la solution de la pipette stock et le filtre. Ajouter Mg-ATP avant l’enregistrement. - Préparer une solution de bain renouvelé chaque fois (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2et 0,1 mM Tris-HCl pH 8,2).
6. enregistrement de l’activité de transporteur
- Maintenir la chambre d’enregistrement et toutes les solutions à 37 ° C, parce que l’activité de transporteur est dépendante de la température.
- Placer les cellules dans la chambre d’enregistrement. Attendez qu’ils laisser tomber au fond de la chambre, mais ne les laissez pas attacher à la chambre.
- Choisissez une cellule appropriée. Mesurer le diamètre de la cellule avec le micromètre oculaire. Choisir les cellules avec un diamètre similaire.
Remarque : En règle générale, une grande cellule aura surface plus cellulaire et éventuellement plusieurs transporteurs, exprimés sur sa membrane plasmique, donc aussi avoir plus d’activité de transporteur. Cependant, ce n’est pas nécessairement correct, comme activité de transporteur dépend du transporteur spécifique et le type de cellule à l’étude. - Monter la pipette de microélectrodes sélectives pour le micromanipulateur, remblayer la pipette serrage patch avec la solution intracellulaire, assurez-vous que la solution atteint l’extrémité de la pipette2.
Remarque : Il peut nécessiter plusieurs robinets douces pour éliminer les bulles d’air dans l’embout de la pipette. - Montez la pipette serrage patch au stade principal de l’électrophysiologie, mis en place2,22,23.
Remarque : Il est important de garder la scène tête à un angle de 45 degrés à l’axe horizontal, car cela garantit un angle d’entrée pour la pipette qui convient à la formation d’un joint très résistant. - Appliquez une petite pression positive (~ 5 cm H2O) à la pipette pour réduire le risque de blocage de la pointe et le placer dans la solution du bain.
- Arrêtez la pipette serrage une fois que l’extrémité se trouve à proximité de la cellule.
- Soulager la pression positive tandis que pipette touche la cellule et appliquez une légère pression négative (~ 5 cm H2O) pour obtenir un > 1000 joint MΩ (un Giga ohms) sur la membrane de la cellule avec le patch pipette23.
- Placez la pipette avec la cellule dans le plan focal de l’ISE, et déplacez la pipette avec la cellule à proximité de l’ISE (~ 5-10 µm)2,5 , mais éviter permettant à la cellule contact l’ISE (Figure 1 a).
- S’assurer que le potentiel de maintien est de 0 mV.
- Briser le sceau avec la série des succions courtes pour obtenir la configuration cellule entière.
- Déplacer l’ISE (ou une pipette de patch clamp) lentement de gauche-droite ou haut-bas pour enregistrer l’activité du transporteur (Figure 1 b).
- Enregistrer au moins 5-8 pics (Figure 1, de A à B).
- Appliquer des perturbations onde carrée lors de l’enregistrement pour surveiller la qualité de l’étanchéité et la capacité de la membrane cellulaire (Figure 1).
- Estimer le flux de H+ (
) de la différence de concentration de H+ libre entre la surface de la cellule et la solution de vrac (ΔH+)
Remarque :
et 
sont H+ et tampon respectivement les coefficients de diffusion BT est la concentration du tampon total, KD est la constante de dissociation de la mémoire tampon, r est la cellule rayon, et 
détermine le changement de l’équilibre dans la concentration de lié H+ pour un petit changement dans H gratuit+. H+ indique un proton libre en solution. Pour être cohérent avec les études antérieures, H+ flux sont converties en unités de flux électrophysiologiques en calculant l’équivalent actuel des flux (/faraday) en pA3,,5]. - Normaliser le flux de protons à la surface des cellules qui peut être calculée de la dimension des cellules ou à la capacité de la membrane.
) de la différence de concentration de H+ libre entre la surface de la cellule et la solution de vrac (ΔH+)
et 
sont H+ et tampon respectivement les coefficients de diffusion BT est la concentration du tampon total, KD est la constante de dissociation de la mémoire tampon, r est la cellule rayon, et 
détermine le changement de l’équilibre dans la concentration de lié H+ pour un petit changement dans H gratuit+. H+ indique un proton libre en solution. Pour être cohérent avec les études antérieures, H+ flux sont converties en unités de flux électrophysiologiques en calculant l’équivalent actuel des flux (Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un auto-référentielle ISE au cours de l’enregistrement de cellules entières patch clamp a été appliqué pour étudier la régulation de l’activité NHE3 par phosphoinositides. PS120 cellules fibroblastes24, qui n’ont pas l’expression de la membrane plasmique endogène NHEs, ont été utilisés. NHE3 sauvage (NHE3-wt) ou NHE3 mutants qui ne sont pas lier phosphoinositides [tyrosine 501, 503 d’arginine et la lysine 505 ont été remplacés par alanine, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] ont été exprimées stablement PS120 cellules fibroblastes18.
Les traces sont présentés dans la Figure 2. La cellule était heldin une configuration cellule entière par une pipette pour patch de serrage et l’ISE a été placé devant la cellule. Dans cette position, l’ISE a recensé la concentration de H gratuit+ près de la membrane cellulaire (Figure 1 a) ; Ensuite, l’ISE (ou une pipette de patch clamp) a été manuellement déplacée latéralement 50 µm et enregistré la concentration de H gratuit+ dans la solution (Figure 1 b). Les écarts de tension enregistré, correspondant aux deux postes de la pipette avec la cellule devant ou loin de l’ISE, sont représentatifs de l’activité NHE3 (Figure 1). La perfusion intra-pipette d’apyrase (ATP-diphosphatase) diminue la concentration intracellulaire de l’ATP, diminuant par la suite le contenu phosphoinositide5. En accord avec les études rapportées antérieurement5,18,19, le contenu de diminution phosphoinositides médié par traitement apyrase réduit l’activité de NHE3 (~ 50 %), qui a enregistré une diminution de la tension amplitude de la vibration (Figure 2). L’effet de l’apyrase (rendue à 5 unités/ml) sur l’activité NHE3 est complètement renversée par la perfusion intra-pipette d’apyrase en combinaison avec 2 µM PI (3,4,5) P3 (Figure 2 et 3 a). Ces conclusions ont été corroborées par l’activité de NHE3 enregistrée dans les cellules PS120 exprimant de manière stable des mutants de NHE3 (NHE3-YRK) qui n’ont pas pas se lier phosphatidylinositides18. La perfusion de l’apyrase seul ou en combinaison avec PIP3 n’a pas affecté l’activité de NHE3 chez les mutants NHE3-YRK (Figure 3 b). L’activité de NHE3 endogène est également inhibée par un traitement apyrase opossum de cellules du rein (OK)3. La perfusion intra-pipette de PI (3,4,5) P3 inversé l’inhibition de l’activité NHE3 induite par l’apyrase dans les cellules OK (Figure 3). Ces résultats suggèrent que l’effet de PI (3,4,5) P3 sur NHE3 activité n’est pas spécifique au type de cellule.
Ensuite, nous avons cherché pour tester la spécificité du PIP3 sur la régulation induite par l’apyrase changements dans l’activité NHE3. Nous l’avons fait en testant l’effet sur la réduction d’apyrase dépendant sur l’activité de NHE3 après la perfusion des autres phosphoinositides, tels que PI (4,5) P2. PI (4,5) P2 (à 10 µM) n’affecte pas la diminution de l’activité NHE3 médiée par l’apyrase (Figure 4 a). Enfin, la perfusion des AMP-PNP, un analogue non hydrolysable de ATP, n’a pas bloqué theapyrase-dépendante inhibition de l’activité NHE3 (Figure 4 b). Ces résultats suggèrent un rôle de PI (3,4,5) P3, mais pas de PI (4,5) P2, dans la régulation de NHE3 après déplétion de l’ATP. L’identification des rôles distincts pour PI (4,5) P2 et P3 de PI (3,4,5) dans NHE3 règlement n’a été possible qu’en raison de la perfusion intercellulaire des phosphoinositides lors des mesures de ISE combinée à germes entiers patch clamp d’enregistrement5. Une action spécifique de PI (3,4,5) P3 plutôt que PI (4,5) P2 dans la régulation de l’activité NHE3 est utile pour déterminer si des phosphoinositides intracellulaires différentes réguler les fonctions de NHE3 différemment.
Figure 1 . Représentation schématique des H+ flux de mesure et la corrélation entre l’activité NHE et différences de potentiel enregistrés par la microélectrode pH.
Représentation schématique de la position de l’enregistrement. A. schéma du paramètre expérimental initial. La cellule est confiée dans la configuration de la cellule entière par la pipette serrage et placée en face de l’ISE. Dans cette position, l’ISE enregistre la concentration de H gratuit+ à proximité de la membrane cellulaire. B. l’ISE (ou patch clamp pipette) est manuellement déplacée latéralement ~ 50 µm et enregistre la concentration de H gratuit+ dans la solution dans cette position. C. représentation graphique des différences de tension enregistrée à l’aide de l’ISE. Les oscillations de position (cellule en face de l’ISE) à B (cellule loin de l’ISE) sont représentatifs de l’activité NHE. Le logiciel utilisé a enregistré la tension différences enregistrement par l’ISE et généré des perturbations d’onde carrée (20 mV, 0,2 kHz) pour surveiller la capacité de la membrane cellulaire et la qualité du patch clamp joint. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Exemple d’un enregistrement la valeur pour l’activité de transporteur de NHE3 dans une seule cellule PS120 exprimant de manière stable NHE3-wt avant et après la perfusion avec apyrase et PI (3,4,5) P3 (PIP3).
Après l’enregistrement initial, la cellule a été appauvrie d’ATP par la perfusion intra-pipette d’apyrase. NHE3 activité progressivement diminué et a été restaurée par perfusion intra-pipette PIP3. Ajout de l’apyrase est indiqué par la barre rouge et PIP3 addition est indiquée par la barre verte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Effet de déplétion de l’ATP et de la perfusion de PIP3 sur l’activité de transporteur de NHE3 dans les cellules PS120 et OK.
Effet de déplétion apyrase par l’intermédiaire de l’ATP sur l’activité NHE3 et réservant l’effet de l’apyrase sur NHE3 activités induites par la perfusion intra-pipette PIP3 : A. PS120 cellules exprimant NHE3-wt ou B. PS120 cellules exprimant NHE3-YRK, NHE3 mutants incapables lier les phosphoinositides. C. OK cellules exprimant NHE3 endogène. Cercles pleins montrent des données moyennes d’expériences individuelles (quatre expériences réalisées dans des conditions identiques). Barres d’erreur représentent les moyen ± erreurs-types (SE). * P < 0,05 vs contrôle, analyse de la variance. $ P < 0,5, apyrase < 0,01 $$P vs apyrase + PIP3, analyse de la variance. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Effet de PI (4,5) P2 (PIP2) et la perfusion PNA-PNP sur NHE3 activité après déplétion de l’ATP.
Effet de l’a. PIP2 ou B. Perfusion intra-pipette PNA-PNP sur la réduction de l’apyrase dépendante de l’activité NHE3 PS120 cellules exprimant NHE3-m/m cercles pleins montrent des données moyennes d’expériences individuelles (quatre expériences réalisées dans des conditions identiques). Barres d’erreur représentent le moyen ± SE. * P < 0,05, ** P < 0,01 vs contrôle, analyse de la variance. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Malgré les fonctions essentielles des transporteurs, les méthodes disponibles pour étudier leur activité sont inefficaces et insuffisants. Une seule limitation est que les méthodes disponibles mesurent mouvement ionique médiée par l’activité de transporteur sans tenir compte des fluctuations de la composition en ions intracellulaires au cours de l’expérience4. La méthode présentée permet un contrôle précis des compositions des ions intracellulaires et extracellulaires et offre un outil puissant pour modifier les ion intracellulaire, protéines et lipides compositions3,4,5.
L’étape la plus importante dans le présent protocole est la préparation de l’ISE qui est stable pendant une longue période25. Dans notre expérience, une ISE instable n’est pas bien siliconées (p. ex., la résine sélectives est redistribuée sur les côtés de pipette ISE), qui peuvent être détectées par une dérive incontrôlable et constante dans le signal de l’ISE. En outre, la répartition de la résine dans l’ISE doit être étroitement surveillée pendant l’expérience. La solution du bain peut pousser la résine sélectives à l’intérieur de la pipette d’ISE, créez une colonne de solution bain avant la résine25. Dans ce cas, l’ISE enregistre la concentration en ions de cette colonne et deviennent insensible aux changements dans les gradients ioniques pendant l’expérience. Réglage de la géométrie de l’ISE est clé pour obtenir une réponse ISE de l’ordre de 100 ms9 et surmonter les retards éventuels dans ISE temps-réponses par rapport aux changements de gradients ioniques.
La limitation majeure de la méthode présentée est héritée du patch de mesurage de l’activité de transporteur dans les cellules épithéliales de serrage. Lorsque détaché de l’appui et entretenu en suspension, des cellules épithéliales polarisées risquent de perdre la localisation polarisée de transporteurs sur la membrane apicale ou basolatérale.
Un correctif mis à jour le mesure de serrage doit être utilisé lors de l’étude des canaux et des transporteurs dans l’épithélium polarisé. Étant donné que cellules pourraient approcher dans un cylindre et non une sphère est importante lors de la transformation du gradient de H+ en flux par l’intermédiaire de la formule fournie. Dans ce cas, la formule doit être changée en 
où λ est la longueur du cylindre, r est le rayon du cylindre, ad x est la distance radiale à partir du milieu du cylindre sur lequel le gradient est mesurée5. Développement futur de cette technique puissante pour l’étude électroneutre transporteurs devrait se concentrer sur la modification de la méthode pour optimiser l’enregistrement cultivées dans une monocouche.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Eric Fishback (Université Des Moines, Des Moines, Iowa, USA) pour son aide avec le tournage et le montage de la vidéo. Les cellules fibroblastes PS120 exprimant de manière stable NHE3-wt ou NHE3-YRK ont été gracieusement fournis par le Dr Mark Donowitz (école de médecine de l’Université de Johns Hopkins, Baltimore, MD, é.-u.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I - cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 |
References
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