Summary
Este manuscrito describe las aplicaciones de electrodos selectivos de protón y parche sujeción métodos para medir la actividad de los sistemas de transporte de protones. Estos métodos superaran algunas limitaciones de las técnicas comúnmente utilizadas para estudiar la actividad de transporte de protones, como sensibilidad moderada, resolución de tiempo y control insuficiente medio intracelular.
Abstract
El transporte de iones a través de las membranas celulares asegura el control fino del contenido de iones dentro y fuera de la célula que es indispensable para la supervivencia de la célula. Estos mecanismos de transporte están mediados por la actividad de proteínas transportadoras especializadas. Específicamente, pH dinámica es finalmente controlado por sistemas de extrusión de protones (H+) membrana plasmática, como el Na+/+ h familia de proteínas de intercambiador (NHE). A pesar de grandes esfuerzos para estudiar los mecanismos que subyacen la regulación NHE, nuestra comprensión actual de las propiedades biofísicas y moleculares de la familia NHE es insuficiente debido a la limitada disponibilidad de métodos para medir con eficacia la actividad NHE . En este manuscrito, utilizamos H+-electrodos selectivos durante celulares parche sujeción grabación para medir flujo inducido NHE H+ . Nos propone este enfoque para superar algunas limitaciones de típicamente utiliza métodos para medir la actividad NHE, tales como la absorción radiactiva y fluorescente membrana permeants. Medición de la actividad NHE usando el método descrito permite la alta sensibilidad y resolución de tiempo y un control más eficiente de la concentración intracelular de H+ . H+-electrodos selectivos están basado en el hecho de que actividad transportista crea un gradiente de iones en proximidad cercana a la membrana celular. Un H+-Electrodo selectivo moviendo hasta y lejos de la membrana celular de manera repetitiva, oscilatoria registra una diferencia de voltaje que depende del flujo de H+ . Mientras que H+-electrodos selectivos se utilizan para detectar flujo H+ móvil fuera de la célula, el método de patch clamp en la configuración de célula entera se utiliza para controlar la composición de iones intracelulares. Por otra parte, aplicación de la técnica de abrazadera del remiendo gigante permite la modificación de la composición intracelular de iones, pero también lípidos. La actividad de transportador de las isoformas NHE 3 (NHE3) se midió usando este enfoque técnico para estudiar la base molecular de la regulación NHE3 de fosfoinosítidos.
Introduction
Transporte de iones y solutos a través de la membrana plasmática es esencial para la supervivencia de las células y, por ende, de los organismos1. Transporte selectivo de iones y solutos se logra mediante una serie de canales especializados y proteínas transportadoras. Las mutaciones en estas proteínas a menudo resultan en una variedad de condiciones clínicas, haciendo canales y transportador de proteínas potenciales dianas para el tratamiento farmacológico1. Desgraciadamente, entender los mecanismos subyacentes a canal y transportador de la función y la regulación está limitada a menudo por los métodos disponibles para estudiar su actividad2,3,4.
Específicamente, transportadores pueden aproximadamente sub-dividirse en dos grandes grupos dependiendo de si altera el potencial de transmembrana de la célula durante el transporte de solutos: los transportadores de iones electrógenos alterar [p. ej., sodio fosfato transportador de co 2a (NaPi2a), intercambiador de sodio-calcio (NCX), etcetera.] o los transportadores de iones no alterar electroneutral [p. ej., intercambiador de sodio-proton (NHE), cloruro de sodio Co transportador, NaPi2c, etcetera.]. Las actividades de ambas clases de transportadores han sido estudiadas extensivamente mediante captación de isótopos radiactivos y membrana-permeant fluorescente tintes2. Ambos enfoques estiman la actividad de los transportadores por la medición de cambios en la concentración mayor de iones citoplasmáticas específicas, y ambos métodos tienen limitaciones, como la sensibilidad moderada y resolución de tiempo y control inadecuado de la intracelular medio. De hecho, la actividad de muchos transportadores es dependiente en la concentración citoplasmática de iones llevados (por ejemplo, NHE3, NCX) y cambios en las concentraciones de estos iones se esperan jugar un papel importante en la regulación de la actividad de transporter2 , 3 , 5. medición precisa de estos mecanismos de regulación se limita mediante métodos clásicos.
Para superar estas limitaciones, métodos de abrazadera del remiendo se utilizan para estudiar la actividad de transportador2,6. En concreto, el auto hace referencia a electrodos ion-selectivos (ISEs)7,8 combinado con el parche de sistema de sujeción ha permitido recientemente la medición de electroneutral transportador actividad3,4 , 5. ISEs están basado en el hecho de que actividad transportista crea un gradiente de iones en proximidad cercana a la membrana celular. Un ISE mover para arriba y lejos de la membrana de la célula en un repetitivo, manera oscilatoria registra una diferencia de voltaje (MV). Diferencias de voltaje se pueden convertir en valores del flujo de iones utilizando un método de calibración que se aplica la primera ley de Fick de la difusión2,9. Mientras que ISEs se utilizan detectar el flujo de iones hacia fuera de las células, el método de la abrazadera de parche en ambos celulares o configuraciones de adentro hacia afuera se utiliza para controlar la composición de iones intracelulares y potencial de membrana. Por otra parte, la aplicación de la técnica de abrazadera del remiendo gigante permite la modificación de la composición intracelular de iones, sino también los lípidos y las proteínas3,5.
En Resumen, la versatilidad del método de la abrazadera de parche en comparación con que otros métodos para el estudio de actividad transportador ha hecho parche de sujeción adecuado para superar las limitaciones comunes de estos métodos. La combinación de auto referencia ISEs y técnicas de patch clamp ofrece la posibilidad única para medir la actividad de transportadores electroneutral en un entorno experimental bien controlado y a descubrir la novela biofísico y molecular propiedades de la membrana celular de transporte3,4,5. Este enfoque se ha utilizado con éxito para estudiar la actividad de la NHE. La familia de proteínas de mamíferos NHE cataliza el intercambio neto de electroneutral de sodio extracelular (Na+) para protón intracelular (H+)10,11 utilizando un gradiente de Na+ hacia adentro. En los mamíferos, la familia de proteínas NHE incluye 11 relacionados con proteínas (NHE1-9 NHA1-2) y un espermatozoide específico NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a familia) se encuentran ubicuo en los organismos vivos más de simples procariotas a eucariotas superiores y están implicados en una variedad de células vitales funciones10,11, incluyendo control de la defensa de la salinidad de la célula en procariotas, mantener volumen de célula y homeostasis acido-base y regulación de la absorción de sal y agua en diversos epitelios especializados10,12,14,15. Las funciones biológicas clave de NHEs y la importancia de sus funciones han sido determinadas a través de varios estudios; sin embargo, pocos estudios han investigado las propiedades biofísicas y moleculares de mamíferos NHEs debido a limitaciones metodológicas4. Recientemente, la aplicación de la auto referencia ISEs en parche de célula entera sujeción ha revelado nuevos mecanismos moleculares de las isoformas NHE regulada por cambios en las concentraciones intracelulares de iones, proteínas y fosfolípidos3, 4.
Específicamente, el protocolo en este manuscrito describe los métodos y enfoques para el estudio de la actividad y la regulación de las isoformas NHE 3 (NHE3), un jugador importante en la absorción de Na+, Cl–, HCO3– y líquido en el membrana de frontera de cepillo del epitelio intestinal y renal14,16. Nueva visión sobre las diferencias en la sensibilidad de la actividad de NHE3 a fosfoinosítidos intracelular (phosphatidylinositide 4, 5-bifosfato [PI (4,5) P2] y phosphatidylinositide 3,4,5-trifosfato [PI(3,4,5]P3]) se divulga. Proteínas de transporte de la célula, tales como canales y transportadores, están reguladas por phosphoinositides17y NHE3 enlaza directamente PI (4,5) P2 y PI (3,4,5) P318. Basado en la literatura actual, ya sea Fosfoinositol podría ser relevante para la regulación fisiológica o fisiopatológica del NHE35,18,19. Nuestros resultados apoyan funciones separadas para PI (4,5) P2 y P3 de PI (3,4,5) en la regulación de la actividad de NHE3. Esta distinción fue posible debido a la aplicación de técnicas ISE en combinación con la grabación de abrazadera de parche de células completas. Esta técnica también permite el control del contenido celular de Fosfoinositol mediante la perfusión intracelular de fosfoinosítidos diferentes durante la medición de la actividad de NHE3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: Los dos amplificadores son necesarios para registrar la actividad de transportadores electroneutral de una auto referencia ISE junto con el parche de fijación, un amplificador de abrazadera de parche para mantener la célula en una configuración de células enteras y un (amplificador de alta impedancia electrómetro) para grabar la actividad de transportista por el ISE (véase tabla de materiales). El amplificador de abrazadera del remiendo está conectado directamente a la tarjeta de adquisición de terminal. El electrómetro está conectado al amplificador diferencial utilizado para filtrar y amplificar la señal. El amplificador diferencial se conecta a la tarjeta de adquisición de terminal. Capmeter, software de abrazadera del remiendo que monitorea la capacidad de la célula, se ha utilizado en estudios anteriores20 (véase tabla de materiales). Las soluciones de grabación de cámara y de la perfusión se mantienen a 37 ° C.
1. preparación de las pipetas de ISEs
- Tire de las pipetas de Capillares de vidrio de borosilicato para un diámetro exterior de 1,2 mm (véase Tabla de materiales) con la pipeta extractor2 .
- Polaco la pipeta usando la microforge. El diámetro de la punta de la pipeta debe ser 2-3 μm.
- Colocar las pipetas en un soporte de vaso para pipetas con la punta hacia arriba (véase Tabla de materiales).
PRECAUCIÓN: Realice los pasos 1.4-1.6 en una campana de humos químicos bien ventilada. - Mezclar la mezcla de siliconization que se compone de 1 gota (~ 150 μL) del bis (dimetilamino) dimetil silano y 10 gotas de tetracloruro de carbono (véase Tabla de materiales).
- Vierta la mezcla de siliconization en el frasco y cierre firmemente la tapa.
- Incube el frasco con la mezcla siliconization durante 24-48 h en una campana de humos químicos a temperatura ambiente hasta que la mezcla se evapora totalmente.
- Rellene la pipeta con la resina de ion-selectivo apropiada para crear una columna de aproximadamente 2-4 mm.
Nota: Ionóforo de hidrógeno I B coctel puede ser usedfor grabación NHE actividad (véase Tabla de materiales). - Toque la punta de la pipeta para distribuir la resina selectiva de iones a la punta y coloque la pipeta verticalmente en el soporte de vaso con punta de la pipeta hacia abajo.
- Checkunder el microscopio de disección que el cóctel de resina ha llegado al final de la punta. Si es necesario, aplique presión positiva para empujar la resina al final.
- Rellenar la mitad-pipeta con la solución adecuada (~ 100 μL). Aquí, 100 mM KCl 10 mM HEPES pH 7.0 si usa use e ionóforo cóctel B.
- Conecte el ISE al Electrómetro y coloque la punta de la SIE en la solución de baño utilizada para la grabación. Cero el electrómetro.
- Prueba de la H+-selectiva respuesta ISE cambiando el pH de la solución del baño. El medio H+-selectiva respuesta ISE es ~ 58 mV por unidad de pH.
- Evaluar periódicamente la respuesta ISE a la calibración.
2. preparación de Patch Clamp Pipetas para grabación
Nota: Se recomienda el método descrito por Donald Hilgemann en su artículo en la grabación de un canal21 .
- Tire de las pipetas para parche gigante de Capillares de vidrio de borosilicato (mmOD 2.0 / 1.5 mm ID) en la pipeta tirador2,22,23.
- Uso un microforge montado en el escenario de un microscopio invertido para hacer una pipeta ancho punta (10-22 μm)23. Fundir una gota (~ 0, 5 mL) de vidrio suave sobre el grueso del alambre de platino de la microforge.
Nota: Se requiere que un alambre de platino relativamente grueso (~0.5 mm) para la fabricación de pipetas parche gigante. - Coloque la pipeta parche cerca del grano de cristal suave y aplicar calor completo hasta la punta comienza a ceder. El alambre de platino se moverá ligeramente hacia la centerduring de la calefacción.
- Apagar el fuego y empuje la punta de la pipeta en el grano de vidrio ablandada. El cable de enfriamiento se retraiga y romper la punta de la pipeta.
- Vuelva a aplicar el calor para alisar la punta de la pipeta y crear una punta de pipeta del diámetro deseado. El diámetro de la punta depende del tamaño de la célula a ser parcheado (8-10 μm en este estudio).
3. preparación de las células
- Calentamiento de la solución salina buffer fosfato (PBS) sin Ca2 + y Mg2 +, solución de tripsina-EDTA y el medio de cultivo a 37 ° c.
- Lavar las células dos veces con PBS. Use 1 mL de la solución para la placa de cultivo de 35 mm diámetro de la célula.
- Añadir 0,5 mL de tripsina a las células de la placa de cultivo de 35 mm diámetro de la célula.
Nota: Cuando las células comienzan a round-up, agitar la placa para sujetar de las células. - Detener la acción de la tripsina mediante la adición de 5 mL (cantidad de placa de cultivo de células de diámetro de 35 mm) de medio de cultivo completo suplementado con suero bovino fetal 10%.
Nota: El tiempo de reacción en tripsina es tipo de la célula dependiente. - Colocar las células en un agitador con mecedora para evitar formación de grumos.
- Utilizan células de hasta 2 h después de la tripsinización.
Nota: El tiempo puede variar dependiendo de la línea celular.
4. elaboración de un sistema de perfusión Intra-pipeta
- Cortar un tamaño apropiado de tubo de cuarzo (150 μm OD / 75 μm ID) para preparar la línea de perfusión intra-pipeta.
- Inserte un lado del tubo de cuarzo de una punta de pipeta de 200 μl. Pegue el tubo de cuarzo en la punta y corte el extremo de la punta con una cuchilla de afeitar.
- Conecte la línea de perfusión (tubo de cuarzo pegado a la punta) a un pequeño trozo de tubo de silicona que serviría como depósito para la solución de perfusión intra-pipeta.
- Conecte el tubo de silicona a una jeringa para crear presión positiva.
- Inserte el extremo libre del tubo de cuarzo a través del tubo de polietileno de la titular de la pipeta de la perfusión de puerto (véase Tabla de materiales).
- Evaluar la línea de perfusión con la solución de la pipeta.
5. preparación de soluciones
- Preparar una solución de pipeta fuertemente tamponada para grabar NHE (aspartato de potasio 115 mM (KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM de MgCl2, 10 m m Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, tubos de 12,5 mM, fregonas de 12,5 mM y 12,5 mM MES, pH 6.0 ajustado con ácido aspártico).
Nota: Preparar la solución stock de la pipeta y el filtro. Añadir Mg-ATP antes de grabar. - Preparar una solución de baño fresco cada vez (140 mM NaCl, CaCl 2 mM2, 2 mM de MgCl2y 0,1 mM Tris-HCl pH 8.2).
6. registro de la actividad del transportador
- Mantener la sala de grabación y todas las soluciones a 37 ° C, porque la actividad de transportista es dependiente de la temperatura.
- Coloque las células en la cámara de grabación. Espera hasta que baje a la parte inferior de la cámara pero no dejan que se conecte a la cámara.
- Elija una celda adecuada. Mida el diámetro de la célula con el micrómetro ocular. Elegir las células con un diámetro similar.
Nota: Generalmente, un grande de la célula tendrá superficie más celular y posiblemente más transportadores expresados en su membrana plasmática, así también tener más actividad de transportista. Sin embargo, esto no es necesariamente correcto, como actividad del transportador depende del transportador específico y el tipo de célula en estudio. - Montar la pipeta de microelectrodos selectivos para las amalgamas dentales, relleno la pipeta de sujeción parche con la solución intracelular, asegúrese de que la solución alcanza la punta de la pipeta2.
Nota: Pueden requerir varios golpecitos suaves para eliminar burbujas en la punta de la pipeta. - Monte la pipeta de sujeción de parche a la etapa principal de la electrofisiología creado2,22,23.
Nota: Es importante mantener el escenario principal sobre un ángulo de 45 grados en el eje horizontal, como este asegura un ángulo de entrada de la pipeta que es conveniente para la formación de un sello de alta resistencia. - Aplicar una presión positiva pequeña (~ 5 cm H2O) a la pipeta de parche para reducir la posibilidad de bloqueo de la punta y lo coloca en la solución del baño.
- Se detiene la pipeta de sujeción parche una vez que la punta está cerca de la célula.
- Aliviar la presión positiva mientras que la pipeta toque la celda y aplique una ligera presión negativa (~ 5 cm H2O) para obtener una > 1000 sello MΩ (un Giga ohmios) en la membrana de la célula con el parche pipeta23.
- Coloque la pipeta patch con el celular en el mismo plano focal como el ISE, y pasar la pipeta de parche con el celular cerca de la SIE (~ 5-10 μm)2,5 pero evitar que la célula en contacto con la SIE (figura 1A).
- Asegurar que la explotación potencial es de 0 mV.
- Romper el sello con serie de succiones cortas para obtener la configuración de célula entera.
- Mover el ISE (o pipeta de patch clamp) lentamente de izquierda a derecha o arriba-abajo para registrar la actividad del transportador (figura 1B).
- Registrar picos de al menos 5-8 (1 de figura, de A B).
- Las perturbaciones de la onda cuadrada se aplican durante la grabación para monitorear la calidad del sello y la capacitancia de la membrana de la célula (figura 1).
- Estimar el flujo de H+ (
) de la diferencia de concentración de H+ libre entre la superficie de la célula y la solución a granel (ΔH+)
Nota:
y 
son H+ y coeficientes de difusión del almacenador intermediario respectivamente, BT es la concentración total del tampón, KD es la constante de disociación del búfer, r es la célula radio, y 
determina el cambio de estado estacionario en la concentración de H enlazado+ para un pequeño cambio en H gratis+. H+ indica un protón libre en solución. Para ser consistente con estudios previos, flujos de H+ se convierten en unidades de flujo electrofisiológica mediante el cálculo de los equivalentes actuales de los flujos (/faraday) en pA3,5]. - Normalizar el flujo de protones a la superficie de la célula que puede calcularse a partir del tamaño de la célula o a la capacitancia de la membrana.
) de la diferencia de concentración de H+ libre entre la superficie de la célula y la solución a granel (ΔH+)
y 
son H+ y coeficientes de difusión del almacenador intermediario respectivamente, BT es la concentración total del tampón, KD es la constante de disociación del búfer, r es la célula radio, y 
determina el cambio de estado estacionario en la concentración de H enlazado+ para un pequeño cambio en H gratis+. H+ indica un protón libre en solución. Para ser consistente con estudios previos, flujos de H+ se convierten en unidades de flujo electrofisiológica mediante el cálculo de los equivalentes actuales de los flujos (Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un auto hace referencia a ISE durante la grabación de abrazadera de celulares parche se aplicó para estudiar la regulación de la actividad de NHE3 por fosfoinosítidos. PS120 fibroblasto-como las células24, que carecen de la expresión de la membrana plasmática endógena NHEs, fueron utilizados. NHE3 de tipo salvaje (NHE3-wt) o NHE3 mutantes que no phosphoinositides del lazo [tirosina 501, 503 de arginina y lisina 505 fueron sustituidos con alanina, Y501A/R503A/K505A (NHE3 YRK)] estable se expresaron en PS120 fibroblasto-como las células18.
Los rastros se presentan en la figura 2. La célula fue heldin una configuración de células enteras por una pipeta para parche de sujeción y el ISE se colocó delante de la célula. En esta posición, el ISE registró la concentración de H libre+ cerca de la membrana de la célula (figura 1A); entonces, el ISE (o pipeta de patch clamp) era manualmente movido lateralmente 50 μm y registra la concentración de H libre+ en la solución (figura 1B). Las diferencias de voltaje registrados, correspondientes a las dos posiciones de la pipeta de parche con el celular en frente de o lejos de la SIE, son representativos de la actividad de NHE3 (figura 1). La perfusión intra-pipeta de apyrase (ATP-difosfatasa) disminuye la concentración intracelular de ATP, posteriormente disminuyendo el contenido de fosfatidilinositol5. De acuerdo con los estudios previamente informados5,18,19, el contenido de fosfatidilinositol disminución mediado por tratamiento apyrase reducido NHE3 actividad (~ 50%), que se registró una disminución de la tensión de amplitud de oscilación (figura 2). El efecto de apyrase (da 5 unidades/ml) en actividad NHE3 fue invertido completamente por la perfusión intra-pipeta de apyrase en combinación con el μm 2 PI (3,4,5) P3 (figura 2 y 3A). Estos resultados fueron apoyados por la actividad de NHE3 en PS120 células expresando estable NHE3 mutantes (NHE3 YRK) que fueron incapaces de enlazar phosphatidylinositides18. La perfusión de apyrase solo o en combinación con PIP3 no afectó la actividad de NHE3 en mutantes NHE3 YRK (figura 3B). La actividad de NHE3 endógeno también fue inhibida por tratamiento apyrase en oposum de células de riñón (OK)3. La perfusión intra-pipeta de PI (3,4,5) P3 revirtió la inhibición de la actividad de NHE3 inducida por apyrase en células OK (figura 3). Estos resultados sugieren que el efecto de PI (3,4,5) P3 NHE3 actividad no es tipo-específica de la célula.
A continuación, se intentó probar la especificidad de PIP3 en apyrase mediado cambios de regulación en actividad NHE3. Hicimos esto analizando el efecto sobre la reducción dependiente de apyrase NHE3 actividad después de la perfusión de otros phosphoinositides, como PI (4,5) P2. PI (4,5) P2 (en 10 μm) no afectó la actividad disminuida de NHE3 mediada por apyrase (Figura 4A). Finalmente, la perfusión de AMP-PNP, un análogo no hidrolizable de la ATP, bloquear no dependiente de theapyrase inhibición de la actividad de NHE3 (Figura 4B). Estos resultados sugieren un papel de PI (3,4,5) P3, pero no de PI (4,5) P2, en la regulación de NHE3 después del agotamiento de ATP. La identificación de roles separados para PI (4,5) P2 y el PI (3,4,5) P3 en NHE3 Reglamento fue posible sólo debido a la perfusión intercelular de fosfoinosítidos durante las mediciones ISE combinado con abrazadera del remiendo de celulares grabación5. Una acción específica de PI (3,4,5) P3 en lugar de PI (4,5) P2 en la regulación de la actividad de NHE3 es valiosa para determinar si diferentes fosfoinosítidos intracelulares regulan la función del NHE3 diferentemente.
Figura 1 . Representación esquemática de H+ flujo de medición y la correlación entre la actividad NHE y diferencias de potencial registradas por el microelectrodo de pH.
Representación esquemática de la configuración de grabación. A. diagrama de la configuración experimental inicial. La célula se celebra en la configuración de célula entera por la pipeta de sujeción parche y colocada frente a la SIE. En esta posición, el ISE registra la concentración de H libre+ cerca de la membrana celular. B. la ISE (o pipeta de patch clamp) manualmente movido lateralmente ~ 50 μm y registra la concentración de H libre+ en la solución en esta posición. C. representación gráfica de las diferencias de voltaje registrados usando el ISE. Las oscilaciones de posición (célula frente a la SIE) a B (célula de la SIE) son representativos de la actividad NHE. El software utilizado registrada el voltaje diferencias registran por la SIE y generaron perturbaciones de la onda cuadrada (20 mV, 0,2 kHz) para controlar la capacitancia de la membrana de la célula y la calidad del sello patch clamp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Ejemplo de un registro establecido para la actividad de transportador de NHE3 en una sola celda PS120 expresando estable NHE3 peso antes y después de la perfusión con apyrase y PI (3,4,5) P3 (PIP3).
Después del registro inicial, la célula fue agotado de ATP por la perfusión intra-pipeta de apyrase. Actividad NHE3 gradualmente disminuyó y fue restaurada por la perfusión intra-pipeta de PIP3. Además apyrase está indicado por la barra roja, y además de PIP3 es indicado por la barra verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Efecto de la depleción de ATP y PIP3 perfusión sobre la actividad de transportador de NHE3 en células PS120 y OK.
Efecto de agotamiento de ATP mediada por apyrase en actividad NHE3 y reservando el efecto de apyrase en NHE3 actividad inducida por perfusión intra-pipeta de PIP3: A. PS120 células expresando NHE3 wt o B. PS120 células expresando NHE3-YRK, NHE3 mutantes incapaces de enlazar fosfoinosítidos. C. aceptar las células que expresan NHE3 endógena. Círculos sólidos muestran datos promedio de experimentos individuales (cuatro experimentos realizados en condiciones idénticas). Barras de error representan el error de estándar de ± medios (SE). * P < 0.05 vs control, ANOVA. $ P < 0,5, apyrase de $$P < 0.01 vs apyrase + PIP3, ANOVA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Efecto de PI (4,5) P2 (PIP2) y perfusión de ANP-PNP en actividad NHE3 después del agotamiento de ATP.
Efecto de A. PIP2 o B. Perfusión intra-pipeta ANP-PNP sobre la reducción de apyrase dependiente de actividad NHE3 en PS120 células expresando NHE3-peso círculos sólidos muestran datos promedio de experimentos individuales (cuatro experimentos realizados en condiciones idénticas). Barras de error representan los medios ± SE. * P < 0.05, ** P < 0.01 vs control, ANOVA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A pesar de las funciones cruciales de los transportadores, los métodos disponibles para el estudio de su actividad son ineficaces e inadecuados. Una limitación es que los métodos disponibles medir el movimiento de iones, mediada por la actividad de transportista sin tener en cuenta las fluctuaciones en la composición de iones intracelulares durante el experimento4. El método presentado garantiza un control preciso de las composiciones de ion extracelular e intracelular y ofrece una poderosa herramienta para modificar el ion intracelular, proteínas y lípidos composiciones3,4,5.
El paso más importante de este protocolo es la preparación de un SIE que es estable durante un largo periodo25. En nuestra experiencia, una inestable ISE no es bien siliconado (por ejemplo, la resina de ion selectivo se redistribuye en los lados de la pipeta ISE), que puede ser detectado por una deriva constante e incontrolable en la señal ISE. Además, la distribución de la resina en el ISE debe vigilarse estrechamente durante el experimento. La solución del baño puede empujar la resina selectiva de iones dentro de la pipeta ISE, creando una columna de solución del baño antes de la resina25. En este caso, la SIE registrará la concentración del ion de esta columna y se convierten en no responde a los cambios en los gradientes de iones durante el experimento. Ajuste de la geometría de la SIE es clave para obtener una respuesta ISE en el intervalo de 100 ms9 y superar posibles demoras en tiempo ISE-respuestas en comparación con cambios en gradientes de iones.
La principal limitación del método presentado es heredada del parche de fijación de medida de la actividad de transporte en las células epiteliales. Cuando desprende el apoyo y mantiene en suspensión, las células epiteliales polarizadas pueden perder la localización polarizada de transportadores en la membrana apical o basolateral.
Un parche modificado medida de sujeción debe utilizarse al estudiar los canales y transportadores en epitelios polarizados. Teniendo en cuenta que las células pueden aproximar en un cilindro en lugar de una esfera es importante transformar el gradiente de H+ de flujo a través de la fórmula proporcionada. En este caso, la fórmula se debe cambiar al 
que λ es la longitud del cilindro, r es el radio del cilindro, ad x es la distancia radial desde el punto de medio cilindro sobre el cual el gradiente es medido5. Desarrollo futuro de esta técnica de gran alcance para estudiar electroneutral transportadores debe centrarse en modificar el método para optimizar la grabación las células cultivadas en una monocapa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Eric Fishback (Universidad de Des Moines, Des Moines, Iowa, Estados Unidos) por su asistencia con rodaje y edición del video. PS120 fibroblasto-como las células expresando estable NHE3 wt o NHE3 YRK fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I - cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 |
References
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. Electrochemical Methods for Neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W. Single-Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A. Patch Clamp Techniques. Okada, Y. , Springer. 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Ogden, D. Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook. , The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).
