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Biology

Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro

doi: 10.3791/56630 Published: February 3, 2018

Summary

Este manuscrito descreve as aplicações dos eletrodos seletivos-próton e patch aperto métodos para medir a atividade dos sistemas de transporte de prótons. Esses métodos de superar algumas limitações das técnicas comumente utilizadas para estudar a actividade de transporte de prótons, como sensibilidade moderada, resolução de tempo e controle do meio intracelular insuficiente.

Abstract

O transporte de íons através das membranas celulares garante o controle fino de ião dentro e fora da célula que é indispensável para a sobrevivência da pilha. Estes mecanismos de transporte são mediados pela actividade de proteínas de transporte especializado. Especificamente, dinâmica de pH é finamente controlada por sistemas de extrusão de prótons (H+) de membrana plasmática, tais como o at+/h+ família de proteínas de cambista (NHE). Apesar de extensos esforços para estudar os mecanismos subjacentes Regulamento NHE, nossa compreensão atual das propriedades biofísicas e moleculares da família NHE é inadequada, devido à limitada disponibilidade de métodos para medir efetivamente a atividade NHE . Neste manuscrito, usamos H+-eletrodos seletivos durante a célula inteira remendo gravação aperto para medir o fluxo induzido por NHE H+ . Propusemos que esta abordagem para superar algumas limitações do normalmente usado métodos para medir atividade NHE, como absorção radioativa e fluorescente membrana permeants. Medição de atividade NHE, usando o método descrito permite alta sensibilidade e resolução de tempo e controle mais eficiente das concentrações intracelulares de H+ . H+-eletrodos seletivos são baseado no fato de que a atividade de transporte cria um gradiente de íon nas proximidades da membrana celular. H+-elétrodo seletivo do movimento até e fora da membrana celular, de forma repetitiva, oscilatória registra uma diferença de tensão que é dependente do fluxo de H+ . Enquanto H+-eletrodos seletivos são usados para detectar o fluxo de H+ , movendo-se fora da célula, o método de braçadeira do remendo na configuração da célula inteira é utilizado para controlar a composição iônica intracelular. Além disso, aplicação da técnica da pinça gigante patch permite a modificação da composição intracelular de íons, não só mas também lípidos. A atividade de transportador de NHE isoform 3 (NHE3) foi medida usando esta abordagem técnica para estudar a base molecular do Regulamento NHE3 pelo remodelamento.

Introduction

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Transporte de íons e solutos através da membrana de plasma é essencial para a sobrevivência das células e, portanto, de organismos1. Transporte seletivo de íons e solutos é alcançado por uma matriz de canal especializado e proteínas de transporte. Mutações nestas proteínas geralmente resultam em uma variedade de condições clínicas, canal e transportador proteínas alvos em potencial para o tratamento farmacológico1de renderização. Infelizmente, compreender os mecanismos subjacentes a função canal e transportador e regulamento é muitas vezes limitada pelas abordagens disponíveis para estudar sua atividade2,3,4.

Especificamente, os transportadores podem ser mais ou menos sub divididos em dois grandes grupos, dependendo se eles alterar o potencial transmembrana da célula durante o transporte de solutos: os transportadores de íons electrogenic alterando [por exemplo, fosfato de sódio- co-transportador 2a (NaPi2a), trocador de sódio-cálcio (NCX), etc.] ou os transportadores não alteram de íon electroneutral [por exemplo, o trocador de sódio-próton (NHE), co transportador de cloreto de sódio, NaPi2c, etc.]. As atividades de ambas as classes de transportadores têm sido estudadas extensivamente usando captação de isótopos radioativos e membrana-permeant fluorescente tinja2. Ambas as abordagens estimam a atividade dos transportadores medindo mudanças na concentração de íons citoplasmáticos específicos em massa, e os dois métodos têm limitações, como moderada sensibilidade e resolução de tempo e controle inadequado do intracelular Milieu. Com efeito, a atividade de muitos transportadores é dependente da concentração citoplasmática dos íons realizadas (por exemplo, NHE3, NCX), e alterações nas concentrações desses íons são esperadas para desempenhar um papel significativo na regulação da atividade de transporte2 , 3 , 5. medição precisa destes mecanismos regulador é limitada usando métodos clássicos.

Para superar essas limitações, métodos de braçadeira do remendo são utilizados para estudar a atividade de transportador2,6. Especificamente, a auto-referência eletrodos íon-seletivos (ISEs)7,8 combinada com o sistema de fixação de patch foi recentemente autorizado a medição da actividade de transporte de electroneutral3,4 , 5. ISEs são baseada no fato de que a atividade de transporte cria um gradiente de íon nas proximidades da membrana celular. Um ISE movendo-se para e longe da membrana celular em um repetitivo, moda oscilatória registra uma diferença de tensão (MV). Diferenças de voltagem podem ser convertidas em valores de fluxo de iões utilizando um método de calibração que se aplica a primeira lei de Fick da difusão2,9. Enquanto ISEs são usados detectar o fluxo de íons em movimento de células, o método de braçadeira do remendo em ambas as células inteiras ou configurações de dentro para fora é usado para controlar a composição iônica intracelular e potenciais de membrana. Além disso, a aplicação da técnica da pinça gigante patch permite a modificação da composição intracelular de íons, não só mas também lipídios e proteínas de3,5.

Em resumo, a versatilidade do método braçadeira remendo comparado com que outros métodos para estudar atividade de transporte fez remendo aperto apropriado para superar as limitações comuns destes outros métodos. A combinação de auto-referência ISEs e técnicas de braçadeira do remendo oferece a possibilidade única para medir a atividade dos transportadores de electroneutral em um ambiente experimental rigidamente controlado e descobrir romance biofísico e molecular Propriedades da membrana celular de transporte3,4,5. Esta abordagem tem sido usada com sucesso para estudar a atividade do NHE. A família de proteínas mamífera NHE catalisa o intercâmbio líquido de electroneutral de sódio extracelular (Na+) para intracelular próton (H+)10,11 , utilizando um gradiente at+ para dentro. Nos mamíferos, a família de proteínas NHE inclui 11 proteínas relacionadas (NHE1-9 e NHA1-2) e um esperma específico NHE10,12,13.

Laiane (família SLC9a) é encontrados ubiquitously na maioria dos organismos vivos de simples procariontes para eucariontes superiores e está envolvidos em uma variedade de células vitais funções10,11, inclusive controlando a defesa de salinidade de célula em procariontes, mantendo o volume de homeostase e célula de ácido-base e regula a absorção de água e sal em vários epitélios especializados10,12,14,15. As funções biológicas chaves de laiane e a importância das suas funções foram determinados através de vários estudos; no entanto, alguns estudos têm investigado as propriedades biofísicas e moleculares de mamíferos laiane devido a limitações metodológicas4. Recentemente, a aplicação de auto-referência ISEs durante o aperto de células inteiras remendo revelou novos mecanismos moleculares de isoformas NHE regulamentadas por alterações nas concentrações intracelulares de íons, proteínas e fosfolipídios3, 4.

Especificamente, o protocolo fornecido neste manuscrito descreve os métodos e abordagens para estudar a atividade e o Regulamento de NHE isoform 3 (NHE3), um jogador importante na absorção de Na+, Cl, HCO3 e fluido na membrana de fronteira escova do epitélio intestinal e renal14,16. Nova visão nas diferenças de sensibilidade do NHE3 atividade de remodelamento intracelular (phosphatidylinositide 4,5-bisfosfato [PI (4,5) P2] e phosphatidylinositide 3, 4,5-trifosfato [PI(3,4,5]P3]) é relatado. Proteínas de transporte celular, tais como canais e transportadores, são regulamentadas pelo remodelamento17e NHE3 vincula diretamente tanto PI (4,5) P2 e P3 PI (3, 4,5)18. Com base na literatura atual, qualquer phosphoinositide pode ser relevante para a regulação fisiológica ou fisiopatológico da NHE35,18,19. Nossos resultados suportam funções separadas para PI (4,5) P2 e P3 de PI (3, 4,5) na regulação da atividade NHE3. Esta distinção foi possível graças à aplicação de técnicas ISE em combinação com gravação de braçadeira do remendo de células inteiras. Esta técnica também permite o controle do phosphoinositide conteúdo celular através da perfusão intracelular de remodelamento diferentes durante a medição da actividade NHE3.

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Protocol

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Nota: Dois amplificadores são necessárias para gravar a atividade dos transportadores de electroneutral por uma auto-referência ISE em conjunto com o patch de aperto, um amplificador de braçadeira do remendo para manter a célula em uma configuração de células inteiras e um (amplificador de alta impedância eletrômetro) para registrar a atividade de transporte através do ISE (ver tabela de materiais). O amplificador de braçadeira do remendo está directamente ligado ao terminal da placa de aquisição. O eletrômetro é ligado ao amplificador diferencial utilizado para filtrar e amplificar o sinal. O amplificador diferencial é conectado ao terminal da placa de aquisição. Capmeter, software de braçadeira do remendo que monitora a capacidade da pilha, tem sido utilizado em anteriores estudos20 (consulte a tabela de materiais). As soluções de câmara e perfusão de gravação são mantidas a 37 ° C.

1. preparação de pipetas para ISEs

  1. Puxe as pipetas de vidro de borosilicato capilares para um diâmetro exterior de 1,2 mm (ver Tabela de materiais) usando a pipeta extrator2 .
  2. Polir a pipeta usando o microforge. O diâmetro da ponta da pipeta deve ser 2-3 µm.
  3. Coloque as pipetas em um suporte de frasco para pipetas com a ponta da pipeta virada para cima (veja a Tabela de materiais).
    Atenção: Execute etapas 1.4-1.6 em uma coifa química bem ventilada.
  4. Misture a mistura de siliconização que é composta de 1 gota (~ 150 µ l) de bis (dimetilamino) dimetil silano e 10 gotas de tetracloreto de carbono (ver Tabela de materiais).
  5. Despeje a mistura de siliconização dentro do frasco e feche a tampa firmemente.
  6. Incube o frasco com a mistura de siliconização por 24-48 h em uma coifa química à temperatura ambiente até que a mistura é completamente evaporada.
  7. Aterramento a pipeta com a resina de íon seletivo apropriada para criar uma coluna de aproximadamente 2-4 mm.
    Nota: Ionóforo de hidrogênio eu cocktail B pode ser atividade de gravação usedfor NHE (ver Tabela de materiais).
  8. Toque a ponta da pipeta para distribuir a resina íon-seletivo para a ponta e coloque a pipeta verticalmente no suporte do frasco com a ponta da pipeta para baixo.
  9. Pronto o dissecação microscópio que o coquetel de resina atingiu o fim da ponta. Se necessário, aplica uma pressão positiva para empurrar a resina para o efeito.
  10. Aterramento da metade-pipeta com a solução apropriada (~ 100 μL). Aqui, use 100 mM KCl e 10 mM HEPES pH 7.0 se usando ionóforo eu b cocktail.
  11. Conectem o ISE no eletrômetro e colocar a ponta do ISE na solução de banho usada para gravação. O eletrômetro de zero.
  12. Testar o H+-resposta seletiva de ISE, alterando o pH da solução de banho. O médio H+-seletivo ISE resposta é ~ 58 mV por unidade de pH.
  13. Avalie periodicamente a resposta ISE para calibração.

2. preparação de Patch Clamp pipetas para gravação

Nota: Recomenda-se o método descrito por Donald Hilgemann, em seu artigo na gravação do Single-Channel21 .

  1. Puxe as pipetas para patch gigante de capilares de vidro de borosilicato (mmOD 2.0 / 1.5 mm ID) em pipeta extrator2,22,23.
  2. Use uma microforge montada no palco de um microscópio invertido para fazer uma ampla pipeta ponta (22-10 μm)23. Derreter um grânulo (~ 0,5 mL) de vidro macio sobre o arame grosso de platina do microforge.
    Nota: Um fio de platina relativamente grosso é necessário (~0.5 mm), para fabricar pipetas remendo gigante.
  3. Posicione a pipeta de remendo perto do grânulo de vidro macio e aplique calor cheio até a ponta começa a diminuir. O fio de platina se moverá ligeiramente em direção a centerduring de aquecimento.
  4. Desligue o fogo e empurre a ponta da pipeta dentro do grânulo de vidro amolecida. O fio de refrigeração vai retrair e quebrar a ponta da pipeta.
  5. Reaplica o calor para suavizar a ponta da pipeta e criar uma ponta de pipeta do diâmetro desejado. O diâmetro da ponta é dependente do tamanho da célula para ser remendado (8-10 μm neste estudo).

3. preparação de células

  1. Aquecer a solução salina de tampão de fosfato (PBS) sem Ca2 + e Mg2 +, solução de tripsina-EDTA e meio de crescimento para a 37 ° C.
  2. Células lave duas vezes com PBS. Use 1 mL de tampão de para placa de cultura de células de diâmetro de 35 mm.
  3. Adicione 0,5 mL de tripsina às células para placa de cultura de células de diâmetro de 35 mm.
    Nota: Quando as células começam a reunir, agitar a placa para de anexar as células.
  4. Pare a ação da tripsina pela adição de 5 mL (quantidade para placa de cultura de células de diâmetro de 35 mm) de meio de cultura completo suplementado com 10% de soro fetal bovino.
    Nota: O tempo de reação em tripsina é o tipo de célula dependente.
  5. Coloca as células em um shaker com rock para evitar a formação de aglomerados.
  6. Use as células para até 2 h após tripsinização.
    Nota: O tempo pode variar conforme a linha celular.

4. preparação de um sistema de perfusão Intrapipeta

  1. Cortar um tamanho apropriado do tubo de quartzo (150 µm OD / 75 µm ID) para preparar a linha de perfusão intrapipeta.
  2. Inserir um lado do tubo de quartzo em uma ponta da pipeta 200 µ l. Cole o tubo de quartzo para a ponta e corte a extremidade da ponta com uma lâmina afiada.
  3. Conecte a linha de perfusão (tubo de quartzo colado à ponta) para um pequeno pedaço de tubo de silicone que serviria como um reservatório para a solução de perfusão intrapipeta.
  4. Conecte o tubo de silicone com uma seringa para criar pressão positiva.
  5. Inserir a extremidade livre do tubo de quartzo através do tubo de polietileno do titular da pipeta da perfusão de porta (ver Tabela de materiais).
  6. Avalie a linha de perfusão com a solução da pipeta.

5. preparação de soluções

  1. Prepare uma solução fortemente a tamponada pipeta para gravação NHE (aspartato de potássio 115 mM (KAsp), 1mm EGTA, 0.5 mM MgCl2, 10mm Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, tubos de 12,5 mM, 12,5 mM MOPS e 12,5 mM MES, pH 6.0 ajustado com ácido aspártico).
    Nota: Prepare a solução de estoque pipeta e filtro. Adicione Mg-ATP antes da gravação.
  2. Prepare uma solução de banho fresco cada vez (140 mM de NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2e 0,1 mM Tris-HCl pH 8,2).

6. gravação da actividade de transportador

  1. Manter a câmara de gravação e todas as soluções a 37 ° C, porque a atividade de transporte é dependente da temperatura.
  2. Coloque as pilhas dentro da câmara de gravação. Espere até cair para o fundo da câmara, mas não deixe que eles anexar à câmara.
  3. Escolha uma célula apropriada. Medir o diâmetro da célula com o micrômetro ocular. Escolha células com diâmetros semelhantes.
    Nota: Geralmente, terá uma grande célula superfície mais celular e possivelmente mais transportadores expressos em sua membrana plasmática, assim também com mais actividade de transportador. No entanto, isto não é necessariamente correto, como atividade de transporte depende do transportador específico e o tipo de célula em estudo.
  4. Montar a pipeta de microeletrodos íon-seletivo para o micromanipulador, aterre a remendo-aperto pipeta com a solução intracelular, certifique-se de que a solução atinja a ponta da pipeta2.
    Nota: Ele pode requerer várias torneiras suaves para eliminar bolhas na ponta da pipeta.
  5. Monte a pipeta remendo-aperto para a fase principal da eletrofisiologia configurar2,22,23.
    Nota: É importante manter o palco principal no sobre um ângulo de 45 graus para o eixo horizontal, como isso garante um ângulo de entrada para a pipeta que é adequado para a formação de um selo altamente resistente.
  6. Aplicar uma pequena pressão positiva (~ 5 cm H2O) para a pipeta de remendo para reduzir a possibilidade de bloquear a ponta e colocá-lo na solução de banho.
  7. Pare de mexer a pipeta de braçadeira do remendo, uma vez que a ponta está perto da célula.
  8. Aliviar a pressão positiva enquanto pipeta toca o celular e aplique uma ligeira pressão negativa (~ 5 cm H2O) para obter um > 1000 pipeta de selo MΩ (um Giga-ohm) na membrana celular, com o patch23.
  9. Coloque a pipeta de remendo com a célula no mesmo plano focal como o ISE, e desloque a pipeta de remendo com a célula em proximidade com o ISE (~ 5-10 µm)2,5 evitar mas permitindo que a célula para entrar em contato com o ISE (figura 1A).
  10. Assegurar-se de que o potencial de exploração seja 0 mV.
  11. Rompa o selo com uma série de condutas curtas para obter a configuração de células inteiras.
  12. Mova o ISE (ou pipeta de braçadeira do remendo) lentamente, esquerda-direita ou acima-abaixo para registrar a atividade do transportador (figura 1B).
  13. Registrar picos de pelo menos 5-8 (Figura 1, de A para B).
  14. Aplicam-se as perturbações da onda quadrada durante a gravação para monitorar a qualidade do selo e a capacitância de membrana celular (Figura 1).
  15. Estimar o fluxo de H+ (Equation 1) da diferença na concentração de H+ livre entre a superfície da pilha e a solução em massa (ΔH+)
    Equation 2
    Equation 3
    Nota: Equation 4 e Equation 5 h+ e coeficientes de difusão de buffer, respectivamente, BT é a concentração total do amortecedor, KD é a constante de dissociação do buffer, r é a célula raio, e Equation 6 determina a mudança de estado estacionário da concentração de limite H+ para uma pequena mudança na enciclopédia H+. H+ indica um próton livre na solução. Para ser consistente com estudos anteriores, H+ fluxos são convertidos em unidades de fluxo eletrofisiológicos calculando os equivalentes atuais dos fluxos luminosos (Equation 1/faraday) em pA3,5].
  16. Normalize o fluxo de prótons à superfície da célula que pode ser calculada a partir do tamanho da célula ou para a capacitância de membrana.

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Representative Results

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Uma auto-referência ISE durante a gravação de braçadeira do remendo de célula inteira foi aplicado para estudar a regulamentação da atividade de NHE3 pelo remodelamento. PS120 células de fibroblastos,24, que falta a expressão da membrana plasmática endógena laiane, foram usados. NHE3 selvagem-tipo (NHE3-wt) ou NHE3 mutantes que não vincular remodelamento [tirosina 501, 503 de arginina e lisina 505 foram substituídos com alanina, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] estàvel foram expressos em PS120 células fibroblasto18.

Os traços são apresentados na Figura 2. A célula foi mantido em uma configuração de células inteiras por uma pipeta para patch de aperto, e o ISE foi colocado na frente da célula. Nesta posição, o ISE gravou a concentração de H livre+ perto da membrana celular (figura 1A); em seguida, o ISE (ou pipeta de braçadeira do remendo) foi movido manualmente lateralmente 50 µm e gravou a concentração de H livre+ na solução (figura 1B). As diferenças de tensão gravado, correspondente as duas posições da pipeta com a célula em frente ou longe do ISE, remendo são representativas da atividade NHE3 (Figura 1). A perfusão intrapipeta de Apirase (ATP-diphosphatase) diminui a concentração intracelular de ATP, diminuindo posteriormente o conteúdo do phosphoinositide5. De acordo com estudos anteriormente relatados5,18,19, o teor de diminuição phosphoinositide mediado por tratamento Apirase reduzido NHE3 atividade (~ 50%), que foi gravada como um decréscimo na tensão amplitude de oscilação (Figura 2). O efeito de Apirase (dado em 5 unidades/ml) na atividade de NHE3 foi completamente revertido pela perfusão intrapipeta de Apirase em combinação com 2 µM P3 PI (3, 4,5) (Figura 2 e 3A). Estas conclusões foram apoiadas pela atividade NHE3 gravada nas células PS120 estàvel expressando NHE3 mutantes (NHE3-YRK) que foram incapazes de ligar phosphatidylinositides18. A perfusão de Apirase sozinho ou em combinação com PIP3 não afetou a atividade de NHE3 em mutantes NHE3-YRK (Figura 3B). A atividade de NHE3 endógenos também foi inibida por tratamento Apirase no gambá de células de rim (Okey)3. A perfusão intrapipeta de PI (3, 4,5) P3 inverteu a inibição da atividade NHE3 induzida por Apirase nas células Okey (Figura 3). Estes achados sugerem que o efeito de PI (3, 4,5) P3 na atividade NHE3 não é específico do tipo de célula.

Em seguida, tivemos como objetivo testar a especificidade do PIP3 na regulação mediada por Apirase alterações na atividade NHE3. Fizemos isso por análise do efeito na redução de Apirase-dependente na atividade NHE3 após a perfusão de outros remodelamento, tais como PI (4,5) P2. PI (4,5) P2 (a 10 µM) não afetou a diminuição da atividade NHE3 mediada por Apirase (Figura 4A). Finalmente, a perfusão de AMP-PNP, um análogo de ATP não hidrolisável, não bloco theapyrase-dependente da inibição da atividade NHE3 (Figura 4B). Estes achados sugerem um papel de PI (3, 4,5) P3, mas não de PI (4,5) P2, no Regulamento de NHE3 após a depleção de ATP. A identificação das funções separadas para PI (4,5) P2 e P3 de PI (3, 4,5) em NHE3 regulamento foi possível somente graças a perfusão intercelular de remodelamento durante as medições de ISE combinado com braçadeira do remendo de células inteiras gravação5. Uma ação específica de PI (3, 4,5) P3, ao invés de PI (4,5) P2 na regulação da atividade NHE3 é valiosa para determinar se diferentes remodelamento intracelular regula a função de NHE3 diferente.

Figure 1
Figura 1 . Representação esquemática de H+ fluxo de medição e a correlação entre atividade NHE e diferenças de potencial gravadas pelo microeléctrodo pH.
Representação esquemática da configuração da gravação. R. diagrama da configuração experimental inicial. A célula é realizada na configuração da célula inteira com uma pipeta de braçadeira do remendo e colocada na frente do ISE. Nesta posição, o ISE registra a concentração de H livre+ perto da membrana celular. B. O ISE (ou pipeta de braçadeira do remendo) é movido manualmente lateralmente ~ 50 µm e registra a concentração de H livre+ na solução nesta posição. C. representação gráfica das diferenças de tensão gravado usando o ISE. As oscilações de posição uma (célula em frente o ISE) para B (célula longe o ISE) são representativos da actividade NHE. O software utilizado registrado a tensão diferenças gravada pelo ISE e gerado perturbações da onda quadrada (20 mV, 0,2 kHz) para monitorar a capacitância de membrana celular e a qualidade do selo de braçadeira do remendo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Exemplo de uma gravação definido para a atividade de transportador NHE3 em uma única célula PS120 estàvel expressando NHE3-wt, antes e após a perfusão com Apirase e PI (3, 4,5) P3 (PIP3).
Depois do registro inicial, a célula foi esgotada de ATP pela perfusão intrapipeta de Apirase. NHE3 atividade gradualmente diminuiu e foi restaurada por perfusão intrapipeta de PIP3. Adição de Apirase é indicada pela barra vermelha, e adição de PIP3 é indicada pela barra verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Efeito da depleção de ATP e perfusão PIP3 na atividade de transporte NHE3 nas células PS120 e Okey.
Efeito de depleção de ATP mediada por Apirase NHE3 atividade e reservando-se o efeito de Apirase NHE3 atividade induzida pela perfusão intrapipeta de PIP3: r. PS120 células expressando NHE3-wt ou B. PS120 células expressando NHE3-YRK, NHE3 mutantes incapazes de ligar o remodelamento. C. Okey células expressando NHE3 endógena. Os círculos sólidos mostram dados médios de experimentos individuais (quatro experimentos realizados em condições idênticas). Barras de erro representam os meios ± erros-padrão (SE). * P < 0.05 vs controle, ANOVA. $ P < 0.5, Apirase de < 0,01 $$P vs Apirase + PIP3, ANOVA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Efeito de PI (4,5) P2 (PIP2) e perfusão PNP ANP na atividade de NHE3 após a depleção de ATP.
Efeito de r. PIP2 ou B. Perfusão de PNP ANP intrapipeta na redução Apirase-dependente da atividade NHE3 em células PS120 expressando NHE3-peso círculos sólidos mostram dados médios de experimentos individuais (quatro experimentos realizados em condições idênticas). Barras de erro representam os meios ± SE. * P < 0.05, * * P < 0,01 vs controle, ANOVA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Apesar das funções cruciais de transportadores, os métodos disponíveis para estudar sua atividade são inadequado e ineficaz. Uma limitação é que os métodos disponíveis medem o movimento de iões mediado pela atividade de transporte, sem considerar as flutuações na composição iônica intracelular durante o experimento4. O método apresentado garante um controle preciso de composições de íon extracelular e intracelular e oferece uma poderosa ferramenta para modificar intracelular de iões, proteínas e lipídios composições3,4,5.

Neste protocolo, o passo mais importante é a preparação de um ISE é estável por um longo período,25. Em nossa experiência, um ISE instável não é bem siliconizado (por exemplo, a resina de íon seletivo é redistribuída nas laterais ISE pipeta), que pode ser detectado por uma tração constante e incontrolável no sinal de ISE. Além disso, a distribuição de resina no ISE deve ser monitorada de perto durante o experimento. A solução de banho pode empurrar a resina íon-seletivo para dentro da pipeta ISE, criando uma coluna de solução de banho antes da resina25. Neste caso, o ISE irá gravar a concentração do íon desta coluna e se tornar não responde às mudanças nos gradientes de íons durante o experimento. Ajustando a geometria do ISE é chave para obter uma resposta ISE no intervalo de 100 ms9 e superar possíveis atrasos no tempo ISE-respostas em comparação com alterações em gradientes de íons.

A principal limitação do método apresentado é herdada o patch apertando a medição da actividade de transportador em células epiteliais. Quando retirado o apoio e mantidos em suspensão, células epiteliais polarizadas podem perder a localização polarizada de transportadores na membrana apical ou basolateral.

Um patch modificado, medição de aperto deve ser usado quando estudando canais e transportadores em epitélios polarizados. Considerando que células podem aproximar em um cilindro, ao invés de uma esfera é importante quando transformar o gradiente de H+ em fluxo através da fórmula fornecida. Neste caso, a fórmula deve ser alterada para Equation 7 onde λ é o comprimento do cilindro, r é o raio do cilindro, anúncio x é a distância radial do ponto médio do cilindro no qual o gradiente é medido5. Futuro desenvolvimento desta poderosa técnica para estudar electroneutral transportadores deve centrar-se sobre como modificar o método para otimizar a gravação de células cultivadas em uma monocamada.

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Disclosures

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostaria de agradecer Eric Fishback (Universidade de Des Moines, Des Moines, Iowa, EUA) pela ajuda com gravação e edição de vídeo. As células de fibroblastos, como PS120 estàvel expressando NHE3-wt ou NHE3-YRK foram gentilmente cedidas pelo Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, EUA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Patch clamp Amplifier Molecular Devices
Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) Warner Instruments 64-1650
Differential Amplifier (DP-301) Warner Instruments 64-0044
Patch Clamp Software Based on MatLab MatLab with acquisition toolbox The capmeter software is recommended
ThermoClamp-1 Temperature Control System  AutoMate Scientific 03-11-LL In-line heater
Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) Warner Instruments 64-2400
Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing World Precision Instruments 1B120F-3   Used for ion selective electrodes
Micropipette Storage Jar World Precision Instruments E212
Bis(dimethylamino)dimethylsilane Sigma-Aldrich 14755-100ML
Carbon tetrachloride Sigma-Aldrich 319961-500ML
Hydrogen ionophore I - cocktail B Sigma-Aldrich 95293
Thin Wall Borosilicate Tubing  Sutter Instrument B200-156-15 Used for patch clamp pipette 
Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) Warner Instruments 64-0815
Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) Molex (Polymicro Technologies) 106815-0018 Used for intra-pipette perfusion system
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium aspartate  Sigma-Aldrich A6558
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M4880
Mg-ATP Sigma-Aldrich A9187
HEPES Sigma-Aldrich H3375
PIPES Sigma-Aldrich P6757
MOPS Sigma-Aldrich M1254
MES Sigma-Aldrich M3671
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670
Tris Sigma-Aldrich T1503
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich H1758
Apyrase Sigma-Aldrich A6535
Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 Echelon Biosciences P-4508
Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 Echelon Biosciences P-3908

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro
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Babich, V., Henry, M. K., Di Sole, F. Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters. J. Vis. Exp. (132), e56630, doi:10.3791/56630 (2018).More

Babich, V., Henry, M. K., Di Sole, F. Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters. J. Vis. Exp. (132), e56630, doi:10.3791/56630 (2018).

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