لوسيفراس "التكامل بالتصوير الإنزيم" في أوراق نيكوتيانا بينثاميانا "تحديد عابر ديناميات التفاعل" البروتين-بروتين
Summary
ويصف هذه المخطوطة إجراء تجريبي السهل والسريع لتحديد تفاعلات البروتين البروتين استناداً إلى قياس النشاط لوسيفراس.
Abstract
تفاعلات البروتين البروتين هي الآليات الأساسية لترحيل توصيل الإشارة في العمليات الخلوية الأكثر؛ ولذلك يتم تحديد التفاعل البروتين البروتين رواية أزواج ورصد ديناميات التفاعل البروتين ذات أهمية خاصة للكشف عن كيفية استجابة النباتات للعوامل البيئية و/أو إشارات التنموية. وقد وضعت مجموعة كبيرة نهوج لدراسة تفاعلات البروتين البروتين، أما في المختبر أو في الجسم الحي. فيما بينها، التكامل لوسيفراس أنشئت مؤخرا التصوير (نادي لايونز الدولي) المقايسة هو أسلوب أبسط وأسرع مما يدل في فيفو تفاعلات البروتين البروتين. في هذا التحليل، البروتين A أو بروتين ب هو تنصهر بالنصف الأمينية الطرفية أو الكربوكسيل الطرفية من لوسيفراس، على التوالي. عندما البروتين A يتفاعل مع البروتين ب، سيعاد نصفي لوسيفراس إنزيم لوسيفراس الوظيفية ونشطة شكل. يمكن تسجيل النشاط لوسيفراس مع luminometer أو كاميرا CCD. بالمقارنة مع النهج الأخرى، مقايسة نادي لايونز الدولي يظهر تفاعلات البروتين البروتين كمياً ونوعيا. تسلل المتبعة في أوراق نيكوتيانا بينثاميانا نظام مستخدمة على نطاق واسع للتعبير البروتين عابرة. مع المزيج من نادي لايونز الدولي والتعبير عابرة، تظهر هذه النهج أن التفاعل الفعلي بين COP1 و SPA1 انخفض تدريجيا بعد العلاج جاسموناتي.
Introduction
بغية تنسيق النمو مع بيئتها، تطورت نباتات أنيقة مسارات إشارات الشعور، ترانسدوسي، وتستجيب لمنبهات إرسال الإشارات. مثل العدائين في سباق التتابع، هي البروتينات اللاعبين اللازمة في توصيل الإشارة النبات. وقد اعترف على نطاق واسع أن التفاعل البروتين-بروتين (PPI) يلعب دوراً رئيسيا للاتصالات الخلوية. الفسفرة البروتين، أسيتيليشن، والتدهور كلها تعتمد على التفاعل بين بروتين المستهدف والأنزيمات في تعديل البدنية. على سبيل المثال، جاسموناتي زيم-المجال البروتين (JAZ) البروتينات الأسرة تتفاعل مع عامل النسخ MYC2 وقمع النشاط الترانسكربتي1،2. ونظرا لأهمية PPI، استكشاف البروتين على نطاق واسع وقد تم إينتيراكتوميس في النباتات مؤخرا3،،من45. وتكشف هذه النتائج إينتيراكتومي كذلك الشبكة التنظيمية المعقدة التي تنسق الوظائف الخلوية المتنوعة.
وهناك بعض النهج المتبعة لرصد PPI. والرزن هجين (Y2H) الخميرة اثنين هو الأسلوب الأكثر استخداماً للكشف عن نقطة في البوصة. Y2H سهل لأداء، ومناسبة لاختبار سريع لدراسة تفاعلات البروتين. Y2H يستخدم أيضا على نطاق واسع لفحص الشركاء التفاعل غير معروف للبروتين محددة من الفائدة. ومع ذلك، لأنه يتم Y2H تماما في الخميرة، أنه لا يمكن أن تعكس السيناريو الحقيقي في مصنع الخلايا ويصل ارتفاع معدلات إيجابية كاذبة. استراتيجية مماثلة أخرى هي المقايسة المنسدلة. وبصفة عامة، اثنين من البروتينات هي أعرب وتنقيته من خلايا الإشريكيّة القولونية ثم مختلطة ومعطلة للكشف عن تفاعلات البروتين. على الرغم من أن هذا الأسلوب لا تستغرق وقتاً طويلاً، فإنه لا يمكن الحصول على في فيفو نتائج التفاعل أما. الأغراض في فيفو التفاعل، co-إيمونوبريسيبيتيشن (شركة للملكية الفكرية) هو التحليل الأكثر شعبية، مما يتطلب جسم عالية الجودة إلى إيمونوبريسيبيتاتي البروتين من الفائدة، ولا يمكن استبعاد إمكانية القياسية غير المباشرة. وعلاوة على ذلك، بسبب الإجراءات المعقدة التجريبية في شركة للملكية الفكرية، عادة ما تختلف النتائج مع الخبرة الفردية.
إلى حد كبير دفع مراسل على أساس إعادة تشكيل فحوصات الكشف عن في فيفو PPI. وتشمل هذه الأساليب fluorescence الرنين الطاقة نقل (بكى)6و bimolecular fluorescence التكامل (بيفك)7والتكامل لوسيفراس اليراع التصوير المقايسة (نادي لايونز الدولي)8. على الرغم من أن هذه النهوج الثلاثة أفضل من شركة للملكية الفكرية لكي تعكس المباشرة في فيفو PPI والحنق وبيفك مجاهر محددة للكشف عن إشارات الأسفار بحاجة إلى ولا يمكن بسهولة قياس كثافة التفاعل. وفي المقابل، نادي لايونز الدولي يستفيد من لوسيفراس اليراع، الذي سوف توهج بعد التفاعل مع ما لوسيفرين الركيزة. الأهم من ذلك، يمكن تحديد كثافة PPI من قيمة النشاط لوسيفراس. وهكذا، يشير نادي لايونز الدولي ليس فقط عما إذا كانت البروتينات هما التفاعل أو لا، ولكن يقدم أيضا معلومات عن ديناميات التفاعل على المعاملة. على الرغم من أن هناك بعض الأساليب المتبعة لرصد التفاعل القوى المحركة (استناداً إلى التحولات الرنين أو الاستقرار الحرارية السطحية مأكل مثل الطحين)9،10، تتطلب هذه النهج الصكوك الحساسة أو وضع العلامات المحددة. على النقيض من ذلك، أسهل لتنفيذ والكشف عن نادي لايونز الدولي.
المبدأ لنادي لايونز الدولي هو أن نصفي الأمينية الطرفية ومحطة الكربوكسيل من لوسيفراس (اسمه لوك ن أو ج-لوك، على التوالي) كانت تنصهر مع البروتين أ وب، وهذه الانصهار اثنين في نفس الوقت أعرب البروتينات في الخلايا النباتية. إذا كان A البروتين يتفاعل مع البروتين ب، ثم سيعاد نصفي لوسيفراس أن إنزيم لوسيفراس نشطة. ويمكن الكشف عن نشاط لوسيفراس مع luminometer أو كاميرا CCD. ليس من الضروري الحصول على ترانسفورمانتس مستقرة لنادي لايونز الدولي؛ التعبير عابرة ما يكفي للحصول على نتيجة تفاعل عالية الجودة.
عصابة من نوع E3 ubiquitin ليجاسى التأسيسي فوتومورفوجينيك 1 (COP1) تتفاعل مع عدد ضخم عوامل النسخ ويعزز تدهورها من خلال بروتوزوم 26S11. بعض هذه العوامل COP1 التي تستهدف النسخ هي إيجابية المنظمين فوتومورفوجينيسيس. في الظلام، يتفاعل COP1 مع القامع phytochrome A-105 1 (SPA1)، الذي يعزز النشاط COP1 E38. بعد تصور الضوء، سوف تلغي فوتوريسيبتورس التفاعل COP1-SPA1 تكبح النشاط COP1 واستقرار ثم COP1 ركائز12،،من1314. يوضح هذا المثال الأهمية البيولوجية لدراسة نقطة في البوصة وتحديد الديناميات PPI.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الموصوفة هنا استنساخه لدراسة تفاعلات البروتين البروتين في فيفو ، بسيطة وملائمة بصفة خاصة للكشف عن ديناميات التفاعل البروتين تحت العلاج الخارجية. خطوة رئيسية في هذا التحليل تسلل بينثاميانا أ . لضمان نجاح عمليات التسلل، يجب أن تكون النباتات صحية جداً. عامل حاسم آخر عند…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يؤيد هذا العمل بمؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة جيانغسو (BK20140919) ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (31470375)، وأولوية برنامج التنمية من جيانغسو التعليم العالي المؤسسات الأكاديمية والمشروع Lan تشينغ.
Materials
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature. 448, 666-671 (2007).
- Jones, A. M., et al. Border control–a membrane-linked interactome of Arabidopsis. Science. 344, 711-716 (2014).
- Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40, 428-438 (2004).
- Chen, H., et al. Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis. Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).
- Schuck, P. Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors. Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).
- Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling. Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).
- Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light. Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).
- Lian, H. L., et al. Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism. Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).
- Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis. Curr Biol. 21, 841-847 (2011).
