Summary
Detta manuskript beskriver en enkel och snabb experimentell metod för att bestämma protein-protein interaktioner baserat på mätning av luciferas aktivitet.
Abstract
Protein-protein interaktioner är grundläggande mekanismer för återutläggning signaltransduktion i mest cellulära processer; identifiering av romanen protein-protein interaktioner par och övervakning protein interaktion dynamics är därför av särskilt intresse för att avslöja hur växter bemöta miljöfaktorer eller utvecklingsmässiga signaler. En uppsjö av metoder har utvecklats för att undersöka protein-protein interaktioner, antingen in vitro eller in-vivo. Bland dem är nyligen inrättade luciferas komplettering imaging (LCI) analys den enklaste och snabbaste metoden för att demonstrera i vivo protein-protein interaktioner. I denna analys, är protein A eller protein B fixerade med amino-terminal eller karboxylgrupp-terminal halvåret luciferas, respektive. När protein A interagerar med protein B, kommer de två halvorna av luciferas beredas för att bilda en fungerande och aktiv luciferas enzym. Luciferas aktivitet kan registreras med en luminometer eller CCD-kamera. Jämfört med andra tillvägagångssätt, visar LCI analysen protein-protein interaktioner både kvalitativt och kvantitativt. Agrobacterium infiltration i Nicotiana benthamiana blad är en allmänt använd system för övergående proteinuttryck. Med kombinationen av LCI och övergående uttryck visar dessa metoder att det fysiska samspelet mellan COP1 och SPA1 minskade gradvis efter jasmonate behandling.
Introduction
För att samordna tillväxt med dess miljö, utvecklats växter eleganta signalvägar för att känna, transduce, och reagera på signalering ledtrådar. Som löpare i ett stafettlopp är proteiner nödvändiga spelare i växten signaltransduktion. Det har varit allmänt kända att protein-protein interaktioner (PPI) spelar en viktig roll för mobil kommunikation. Protein fosforylering, acetylering och nedbrytning är alla beroende av fysisk interaktion mellan ett målprotein och dess modifiera enzymer. Exempelvis Jasmonate ZIM-domän protein (JAZ) familj proteiner interagerar med transkriptionsfaktor MYC2 och undertrycka sin transkriptionell aktivitet1,2. Med tanke på betydelsen av PPI utforskat storskaliga protein interactomes i växter har nyligen3,4,5. Dessa interactome-resultat ytterligare avslöja det komplexa regulatoriska nätverk som samordnar olika cellulära funktioner.
Det finns vissa etablerade metoder för övervakning av PPI. Den jäst två hybrid (Y2H)-analysen är den mest använda metoden för PPI upptäckt. Y2H är lätt att utföra, och lämpar sig för en snabb test att undersöka proteininteraktioner. Y2H är också allmänt används för screening okänd interaktion partners för den specifika protein-of-intressen. Dock eftersom Y2H utförs helt i jäst, kan inte det återspeglar det verkliga scenariot i växten celler och ger hög falska positiva priser. En annan liknande strategi är den pull-down-analysen. I allmänhet två proteiner uttrycks och renas från Escherichia coli celler och sedan blandas och orörlig för att upptäcka proteininteraktioner. Även om denna metod inte är tidskrävande, erhålla inte i vivo interaktion resultat heller. För i vivo interaktion ändamål är co-immunoprecipitation (co-IP) den mest populära assay, som kräver hög kvalitet antikroppar mot immunoprecipitate den protein-of-intressen och kan inte utesluta möjligheten av indirekta protonpumpshämmare. Dessutom, på grund av de komplicerade experimentella rutiner i co-IP, resultaten varierar oftast med individuellt expertis.
Reporter baserad beredning analyser avancerar kraftigt detektion av i vivo PPI. Dessa metoder inkluderar fluorescens resonans energi överföring (bandet)6, bimolecular fluorescens komplettering (BiFC)7och firefly luciferas komplettering imaging (LCI) assay8. Även om dessa tre metoder är bättre än co-IP spegla den direkt i vivo PPI, bandet och BiFC behöver särskilda Mikroskop till upptäcka fluorescens signaler och kan inte enkelt kvantifiera interaktion intensiteten. Däremot tar LCI fördel av firefly luciferas, som kommer att lysa efter reagerar med dess substrat luciferin. Viktigare, kan PPI intensitet bestämmas från värdet av luciferas aktivitet. LCI visar således inte bara om två proteiner interagerar eller inte, men också ger information om interaktionen dynamiken vid behandling. Även om det finns några etablerade metoder för övervakning av interaktion dynamics (baserat på ytan plasmon resonans eller thermo-stabilitet skift)9,10, kräver dessa metoder känsliga instrument eller särskilda märkning. LCI är däremot lättare att utföra och upptäcka.
Principen för LCI är att de amino-terminal och karboxylgrupp-terminal halvorna av luciferas (namnet N-Luc eller C-Luc, respektive) fixerades med protein A och B, och dessa två fusion proteiner uttrycktes samtidigt i växtceller. Om protein A interagerar med protein B, kommer att då de två halvorna av luciferas beredas för att vara en aktiv luciferas enzym. Luciferas aktivitet kan upptäckas med en luminometer eller CCD-kamera. Det är inte nödvändigt att erhålla stabil transformants för LCI; övergående uttryck är tillräckligt för att få en hög kvalitet interaktion resultatet.
RING-typ E3 ubiquitin ligase konstituerande photomorphogenic 1 (COP1) samverkar med en myriad av transkriptionsfaktorer och främjar deras nedbrytning genom 26S proteasom11. Några av dessa COP1-riktade transkriptionsfaktorer är positiva regleringsmyndigheter för photomorphogenesis. I mörker interagerar COP1 med suppressor av phytochrome A-105 1 (SPA1), vilket förbättrar COP1 E3 aktivitet8. Efter föreställningen av ljus, kommer fotoreceptorer upphäva COP1-SPA1 interaktionen för att hämma COP1 aktivitet och sedan stabilisera COP1 substrat12,13,14. Detta exempel illustrerar den biologiska betydelsen av studera PPI och bestämma PPI dynamics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av växter (8 veckor)
- Lägg 50 Nicotiana benthamiana frön i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör innehållande 1 mL 5% NaClO och 0,1% Triton x-100 (V/V) lösning och låt verka i 5 min att sterilisera frön.
- Skölj fröna med sterilt vatten 5 gånger och dra in frön i 200 µL sterilt vatten.
- Noggrant plats enskilda frön på ytan av MS-agarsubstrat (1 L: 1 x Murashige & Skoog salter, 10 g sackaros, pH 5.8 (KOH), 1% agar) med fina tips och store medellång plattor i 4 ° C i 3 dagar för att synkronisera grobarhet.
Obs: För att undvika mikrob kontaminering, utföra detta steg på en ren bänk. Det är inte nödvändigt att skaka röret under sterilisering. - Placera medellång plattor under normala odlingsbetingelser (22 ° C, 80-90 µmolm-2s-1 vit ljusintensiteten) i 10 dagar, och sedan överföra de grodda plantorna i marken.
Obs: Se till att sätta plantan rötter i marken och inte skadar rötterna. Täcka facket med en transparent plasthölje som över natten för att bibehålla fuktigheten. - Odla växter i en kontrollerad tillväxt rum på en 16 h/8 h ljus/mörk cykel och 70% luftfuktighet. 7 veckor gamla N. benthamiana växter är redo för Agrobacteriumtumefaciens infiltration (figur 1A).
Obs: Vattenväxter och bekämpa skadedjur som behövs för att hålla växterna friska.
2. övergående uttryck i N. Benthamiana blad (7-10 dagar)
- Leverera 150 ng av plasmider (kontrollplasmid-pEGAD-HA-LUC, tom vektor och konstruerade plasmid för LCI assay, i detta fall vi använde pCAMBIA1300-Nluc och pCAMBIA1300-Cluc för plasmid konstruktion) i A. tumefaciens behöriga cell stam GV3101 med en standard elektroporation metod.
- Kultur A. tumefaciens på Luria-Bertani (LB) agar medium (1 L: 10 g NaCl, 5 g jästextrakt, 10 g trypton, 1,5% agar) innehållande 50 µg/mL kanamycin och 50 µg/mL av rifampicin vid 28 ° C i 4 dagar.
Obs: Valet av antibiotika beror på vektorn och A. tumefaciens stammen används. - Inokulera en enda A. tumefaciens koloni från varje platta i 3 mL LB flytande medium innehållande 50 µg/mL kanamycin och 50 µg/mL av rifampicin och skaka på 220 rpm vid 28 ° C under 24 h att propagera för cellodling.
- Över 75 µL av bakteriekulturen i 15 mL färsk LB flytande medium innehållande 50 µg/mL kanamycin och 50 µg/mL rifampicin, späda ut den med en faktor 200. Kultur bakterierna vid 220 rpm vid 30 ° C i ca 8 h, tills OD600 är mellan 0,5 till 1,0.
- Överföra A. tumefaciens flytande kulturen i 15 mL centrifugrör och centrifugera vid 4000 x g och 4 ° C i 15 min. Kassera supernatanten och centrifugerade i 15 mL transformation lösning att tvätta pelleten.
- Snurra röret vid 4000 x g och 4 ° C under 15 minuter och kasta bort supernatanten. Upprepa tvätt igen.
- Återsuspendera pelleten i 5 mL transformation lösning och hålla för 2 h i rumstemperatur. Justera tätheten på A. tumefaciens pellet celler med omvandling lösning tills den slutliga koncentrationen av OD600 är 0,5 eller blanda två prover med lika volym för testning Parade proteininteraktioner.
- Infiltrera suspenderade celler i den 4: e till 7th blad med en 1 mL nålfri spruta (figur 1B-C). Efter infiltration, täcka växter omedelbart med ett svart plasthölje och placera brickan i mörker för 12 h. Efter det, odla växter som vanligt för 2 till 4 dagar före LUC aktiviteter.
Obs: Välj friska blad av liknande storlek. Infiltrationen av fyra olika zoner i ett blad är bra.
3. upptäcka luciferas aktivitet (en dag)
Obs: Det finns två sätt att övervaka luciferas aktivitet. En är baserad på imaging, och den andra är att kvantitativt mäta luciferas aktivitet.
-
Imaging metod
- Lossa en infiltrerade blad och sätta hela broschyren på MS-agarsubstrat.
- Spray luciferin arbetande buffert på leaf adaxial ytan med en 50 mL sprayflaska. Hålla material i mörkret för 5 min att släcka den klorofyll auto-fluorescensen.
- Använd en låg-ljus kylda CCD imaging apparater (kyls till-30 ° C) för att fånga bilder (figur 2). Ljus-arkiverat exponeringstiden är 50 ms och luminiscens upptäckten tid är 1 min.
Obs: Justera parametrar enligt maskin handboken. Lägre temperaturer kommer att förbättra signal-brusförhållandet för att förbättra bildkvaliteten.
- Alternativt Mät luminiscens direkt med en kommersiell luminometern.
- Noggrant skära ut blad fragment (om 0,25 cm2) från området infiltration av N. benthamiana bladen och fördjupa leaf disken i 100 µL avjoniserat vatten i en 96-väl vit platta (figur 3).
- Tillsätt 10 µL av luciferin arbetande buffert och lämna i 5 min. Sedan utföra specifika behandlingar för att studera protein interaktion dynamiken.
Obs: Upptäcka luminescence med en luminometer vid olika tidpunkter att erhålla luciferas aktivitet dynamiken, som representerar kineticsen av protein-protein interaktioner under viss behandling. Denna metod har fördelar för att testa ett stort antal protein par samtidigt. För dem utan en kommersiell luminometer, undersöka luciferas protein sammansättning genom western blot, därför hänvisa till den LUC verksamhet kvantitativt. Om ljuset inte nödvändigtvis krävs, bara hålla plattan i luminometern och mäta luminiscens vid olika tidpunkter. Annars flytta plattan till en tillväxt kammare under upptäckt klyftan. För att få statistiskt signifikanta resultat, Använd minst tre biologiska replikat. Även om LUC aktiviteter från olika infiltration zoner kommer att variera, överensstämmer deras föränderliga mönster efter normalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre viktiga steg kan pekas ut i detta luciferas komplettering protokoll för att studera protein-protein interaktioner i vivo, inklusive växternas tillväxt, tobak infiltration och luciferas analysen. Det mest avgörande steget i detta protokoll är infiltrera flytande A. tumefaciens i N. benthamiana blad (figur 1).
Här är ett exempel på nyttan av denna teknik som bekräftar jasmonate att minska COP1-SPA1 interaktioner. De amino-terminal och karboxylgrupp-terminal halvorna av luciferas fixerades med COP1 (COP1-NLuc) eller SPA1 (CLuc-SPA1), respektive. COP1-SPA1 interaktioner resultera i komplettering av funktionella luciferas. Aktiviteten luciferas fotograferades av CCD-kamera (figur 2) och den enzymatiska aktiviteten kan upptäckas med en luminometer (figur 3). Att utesluta möjligheten att luciferas själv påverkas av behandling, fullängds luciferas (LUC) genen var också övergående uttryckt i N. benthamiana blad att fungera som en kontroll. Aktiviteten luciferas innan jasmonate behandling (tid 0) angavs som 1, och sedan varje luciferas aktivitet värde erhålls under jasmonate behandling var normaliserade med tiden 0 att få aktiviteten relativa luciferas (figur 4). Resultaten visade att COP1-SPA1 interaktioner (reflekteras av luciferas aktivitet) gradvis minskat i mörker och att JA behandling ytterligare minskat deras interaktioner.
Figur 1 . Processen för N. benthamiana infiltration.
(A) Abaxial och adaxial syn på växter innan infiltration. (B) representativ bild att visa protokollet infiltration. (C) Abaxial och adaxial syn på växter efter infiltration. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Imaging luciferas aktivitet under CCD-kamera.
(A) representativ bild av ett subst. benthamiana blad under en normal ljus fält. (B) upptäcka luminiscens signaler under CCD-kamera att Visa luciferas aktiviteter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativ bild att visa hur man mäter luminiscens från skär blad diskar.
Infiltrerade leaf diskar skars och sätta i en 96-väl vit platta för att mäta luminiscens signaler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Representativa resultat från en övergående luciferas komplettering assay.
(A) behandlingen varaktighet (tid) och ursprungliga resultaten av luminiscens värdet (LUC aktivitet) noterades. Det finns tre oberoende replikat för varje prov. För att förbereda detta diagram, var LUC aktivitet vid olika tidpunkter normaliserade med tiden 0 som den relativa LUC-aktiviteten.
(B) kvantifiering av relativa LUC aktiviteter, visar COP1-SPA1 interaktioner i mörker gradvis minskat, vilket kan minskas genom ytterligare JA behandling. Felstapel anger standardavvikelsen (sd). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs här är enkel och reproducerbara för att studera i vivo protein-protein interaktioner, och särskilt lämplig för att upptäcka protein interaktion dynamics under exogena behandling. Det viktigaste steget i denna analys är N. benthamiana infiltration. För att säkerställa infiltration framgång, måste växter vara mycket hälsosam. En annan kritisk faktor är när du ska kontrollera luciferas aktivitet efter infiltration. Det finns inget rätt svar för den här frågan. Forskare uppmuntras att övervaka luciferas-aktivitet på olika dagar efter infiltration att döma när luciferas uttrycks på högsta nivå, eftersom vi observerade protein uttrycksnivåerna fluktuerar med tiden8.
Det är möjligt att ingen luminiscens kan detekteras i vissa experiment. Falska negativa kunde inte uteslutas utan lämpliga kontroller. En fullängds luciferas kontroll är skyldig att påvisa infiltration och luciferas identifiering fungerar. Sedan om det finns fortfarande ingen luminiscens förmodad protein interaktion parvis, skulle en immunoblot krävas att upptäcka proteinuttryck, ifall en eller två proteiner inte uttrycks framgångsrikt. Den sista möjligheten är att proteininteraktioner kan hindra luciferas komplettering av protein konfirmerande orsaker. Om detta händer, använder trunkerat protein eller byta protein fusionen med N-Luc eller C-Luc kommer att vara till hjälp att lösa detta problem.
Även om protoplasts är även populära för övergående uttryck, isolering av protoplasts och plasmid leverans till protoplast celler behöver särskild sakkunskap och kräver skadliga CsCl2 för storskaliga plasmid extraktion. Dessutom under protoplast isolering, är växter kraftigt sårade, som kan påverka PPI analyser.
Det finns ingen gyllene standard assay. Till vår kunskap, kan denna enkelt utförda luciferas komplettering analys ge användbar protein interaktion kinetik information. Naturligtvis, alternativa metoder för att studera protein interaktioner i vivo bekräftar dessa resultat och förbättra förståelsen av biokemiska händelser i celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av naturvetenskap Foundation i Jiangsuprovinsen (BK20140919), den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (31470375), prioritet akademiska Program utveckling av Jiangsu institutioner för högre utbildning och Qing Lan projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature. 448, 666-671 (2007).
- Jones, A. M., et al. Border control--a membrane-linked interactome of Arabidopsis. Science. 344, 711-716 (2014).
- Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40, 428-438 (2004).
- Chen, H., et al. Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis. Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).
- Schuck, P. Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors. Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).
- Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling. Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).
- Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light. Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).
- Lian, H. L., et al. Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism. Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).
- Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis. Curr Biol. 21, 841-847 (2011).
