Summary
Denne protokol beskriver en roman metode for at undersøge en form for kemisk neurostimulation wholemount rotte nethinder i vitro med neurotransmitteren glutamat. Kemiske neurostimulation er en lovende alternativ til den konventionelle elektrisk neurostimulation retinal neuroner til behandling af uoprettelige blindhed forårsaget af fotoreceptor degenerative sygdomme.
Abstract
Fotoreceptor degenerative sygdomme medføre uoprettelige blindhed gennem den gradvise tab af fotoreceptor celler i nethinden. Retinal proteser er en spirende behandling af fotoreceptor degenerative sygdomme, der søger at genoprette vision af kunstigt stimulere de overlevende retinal neuroner i håb om at fremkalde forståelige visuel perception i patienter. Nuværende retinal proteser har demonstreret succes med at genoprette begrænset vision til patienter, som anvender en vifte af elektroder til elektrisk stimulere nethinden, men står over for betydelige fysiske barrierer i genoprette høj skarphed, naturlige vision til patienter. Kemiske neurostimulation ved hjælp af indfødte neurotransmittere er en biomimetiske alternativ til elektrisk stimulation og kunne omgå de grundlæggende begrænsninger i forbindelse med retinal proteser ved hjælp af elektrisk neurostimulation. Specifikt, har kemiske neurostimulation potentiale til at gendanne mere naturlige vision med sammenlignelige eller bedre visual acuities til patienter ved at indsprøjte meget små mængder af neurotransmittere, de samme naturlige agenter for kommunikation anvendes af retinal kemiske synapser på meget finere opløsning end nuværende elektriske proteser. Men som en relativt uudforskede stimulation paradigme, der er ikke etableret protokol for at opnå kemisk stimulation af nethinden i vitro. Formålet med dette arbejde er at give en detaljeret ramme for varetagelse af kemiske stimulation af nethinden for efterforskere, der ønsker at studere den potentielle af kemiske Neuromodulationsbehandling af nethinden eller lignende neurale væv in vitro. I dette arbejde, vi beskriver eksperimentel opsætning og metodologi for fremkalde retinal ganglion celler (RGC) spike svar ligner visual lys svar i wild-type og fotoreceptor-degenereret wholemount rotte nethinder ved at indsprøjte kontrollerede mængder neurotransmitteren glutamat i subretinal plads ved hjælp af glas Mikropipetter og en brugerdefineret multiport mikrofluid enhed. Denne metode og protokol er generelle nok til at være tilpasset til Neuromodulationsbehandling ved hjælp af andre neurotransmittere eller endog andre neurale væv.
Introduction
Fotoreceptor degenerative sygdomme, som retinitis pigmentosa og aldersrelateret makuladegeneration, er førende arvelige årsager til tab af synet og er i øjeblikket uhelbredelig1,2. Selv om disse sygdomme opstår fra en række specifikke genetiske mutationer, er fotoreceptor degenerative sygdomme karakteriseret som en gruppe af progressive tab af fotoreceptor celler i nethinden, som i sidste ende forårsager blindhed. Tab af fotoreceptorer udløser udbredt remodeling hele nethinden men overlevende retinal neuroner, herunder bipolar celler og RGCs, forblive intakt og relativt funktionelle selv i fremskredne stadier af fotoreceptor degeneration3 ,4,5,6,7.
De mekanismer og patologier af disse sygdomme er blevet godt præget3,4,5,6,7 , men en effektiv behandling er fortsat undvigende. I de seneste tre årtier, har forskere fra hele verden undersøgt en række terapeutiske behandlinger for at genoprette vision til de berørte med fotoreceptor degenerative sygdomme herunder gen terapi8, stamcelle behandling9, retinal transplantation10, og kunstig stimulation11,12 af de overlevende retinal neuroner. Af disse er den mest klinisk tilgængelige retinal proteser, som er kunstige neurostimulation enheder, der traditionelt har udnyttet en række elektroder til elektrisk stimulere enten bipolar celler eller RGCs i bestemte mønstre med mål at at skabe kunstige visuelle opfattelser i patienter11. Nuværende generation elektriske proteser, som Argus II13 og Alpha-IMS14 enheder, har opnået kliniske godkendelse og indledende undersøgelser har vist, at de kan forbedre livskvaliteten for patienter ved at genskabe en foranstaltning af vision ved hjælp af både epiretinal (forsiden af nethinden) og subretinal (bagsiden af nethinden) implanterede enheder15,16. Forskergrupper verden over arbejder på fremrykning retinal proteser ud over de gode resultater af disse førstegenerations enheder17,18,19,20 , men har stået over for vanskeligheder designe en elektrisk protese i stand til at genskabe høj skarphed vision under niveauet, juridiske blindhed til patienter. Nylige undersøgelser har vist, at opnå højere rumlige opløsning end der er aktiveret ved den nuværende generation elektrisk-baserede proteser er udfordrende afgift injektion begrænsning, som nødvendiggør brug af store elektroder til sikkert stimulere retinal neuroner på bekostning af rumlige opløsning, dvs synsstyrke11,21. Øvrigt elektrisk stimulation er yderligere begrænset, fordi det typisk stimulerer alle nærliggende celler og derfor fremkalder unaturlige og forvirrende opfattelser hos patienter, hovedsagelig fordi det er en ifølge sagens natur unaturligt stimulation paradigme21. Ikke desto mindre, de tidlige succeser af elektrisk stimulation har vist, at kunstige neurostimulation kan være en effektiv behandling for fotoreceptor degenerative sygdomme. Dette fører til at hypotesen om, at en endnu mere effektiv behandling kan opnås ved at stimulere nethinden med neurotransmitter kemikalier, naturlige agenter for kommunikation på kemiske synapser. Formålet med metoden præsenteret i dette papir er at udforske de terapeutiske gennemførligheden af kemiske stimulation, som sigter mod at efterligne den naturlige system af synaptic kommunikation mellem retinal neuroner, som en biomimetiske alternativ til elektrisk stimulation for en retinal protese.
Oversættelse af begrebet terapeutisk kemiske stimulation til en kemisk retinal protesen er baseret på kemisk aktivering target retinal neuroner med små mængder af indfødte neurotransmittere, såsom glutamat, udgivet gennem en mikrofluid enhed bestående af en bred vifte af microports som svar på visuel stimulation. På denne måde, ville en kemisk retinal protesen hovedsagelig være en biomimetiske kunstige fotoreceptor laget, der oversætter fotoner naturligvis at nå frem til nethinden til kemiske signaler. Da disse kemiske signaler bruger de samme neurotransmittere udnyttes i almindelige retinale signalering og stimulere de overlevende retinal neuroner i en degenererede nethinden gennem den samme synaptic veje bruges af normale vision veje, den resulterende visuelle opfattelse opnås gennem en kemisk retinal protesen kunne være mere naturlig og forståelig i forhold til en fremkaldt gennem en elektrisk protesen. Desuden, da microports hvorigennem neurotransmittere er frigivet kan gøres meget små og klædt i høj tæthed, i modsætning til elektroderne, en potentiel kemiske proteser kan være stand til at opnå mere fokal stimulation og højere rumlige opløsning end en elektrisk protesen. Således tilbyder baseret på disse potentielle fordele, en kemisk retinal protesen en meget lovende alternativ til elektriske proteser.
Kemiske stimulation af nethinden, dog har været relativt lidt udforsket indtil for nylig. Mens elektrisk stimulation af nethinden har været godt præget over årtiers arbejde gennem in vitro22,23, i vivo23,24, og kliniske undersøgelser13 ,14, undersøgelser af kemiske stimulation har været begrænset udelukkende til et par in vitro- værker25,26,27,28. Iezzi og Finlayson26 og Jens Jørgen et al. 27 viste epiretinal kemiske stimulation af nethinden i vitro ved hjælp af en enkelt elektrode og en multielectrode array (MEA), henholdsvis at registrere glutamat fremkaldte svar af retinale neuroner. Mere nylig, Rountree et al. 28 demonstreret differential stimulering af den og slukkes retinal veje ved hjælp af glutamat fra den subretinal side og en MEA for at optage de neuronale reaktioner fra flere steder på nethinden.Selv om disse værker har foreløbigt fastslået muligheden for kemiske stimulation, yderligere undersøgelser er nødvendige for at undersøge mange aspekter af denne tilgang ud over dem, adresseret hidtil25,26,27 , 28, og finjustere parametrene terapeutiske stimulering i både in vitro- og i vivo dyremodeller før oversætte dette koncept til en kemisk retinal protese, som beskrevet ovenfor. Men i øjeblikket er der ingen etableret metode for varetagelse af kemiske stimulation af nethinden i litteraturen og de metoder, der anvendes i de foregående værker ikke er beskrevet så detaljeret som vil være afgørende for replicative undersøgelser. Begrundelsen for denne metoder papir er derfor at give en velafgrænset ramme for udførelse af in vitro- kemiske stimulation af nethinden for dem interesseret i enten gentager vores tidligere undersøgelser27, efterforskere 28 eller yderligere fremme denne spirende begrebet kemiske neurostimulation.
Her viser vi en metode til at foretage in vitro- kemiske stimulation af retinale neuroner i wholemount nethinder vildtype rotter og en fotoreceptor degenererede rotte model, der nøje efterligner progression af fotoreceptor degenerative sygdomme hos mennesker. Rationalet bag udvikle denne stimulation-metoden i in vitro- modeller er at evaluere de terapeutiske områder af forskellige parametre, stimulation og studere neurale reaktion karakteristika, det ville være umuligt eller svært at observere i i vivo modeller, især under de indledende undersøgelser fokuseret på evaluere gennemførligheden af denne fremgangsmåde. I denne procedure vise vi både single-site og samtidige multi-site kemiske stimulering af nethinder ved at levere små mængder af 1 mM glutamat nær målet retinal neuroner via kommercielt tilgængelige single-port glas Mikropipetter og en brugerdefineret micromachined multi-port mikrofluid enhed, henholdsvis. Mens både single-site og multi-site stimulering udrette det grundlæggende formål at undersøge den terapeutiske gennemførligheden af kemiske Neuromodulationsbehandling, tjener hver et særskilt formål med en unik fordel. Single-site stimulation, som kan opnås med kommercielt tilgængelige pre trak glas Mikropipetter, kan bruges til at injicere kemikalier direkte i undergrunden af nethinden på et enkelt websted og tjener til at undersøge hvis observerbare RGC spike sats svar, der svarer til visuelt evoked lys svar kan være fremkaldt focally under injektionsstedet. På den anden side multi-site stimulation, som kræver et specielt fabrikerede multiport mikrofluid enhed, kan bruges til at injicere kemikalier rumligt på flere websteder over overfladen af nethinden og tjener til at undersøge hvor godt glutamat-fremkaldte Risikokapital respons mønstre svarer til glutamat injektion mønstre i mønster stimulation undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne skitseret af National Research Council's Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Animalske håndtering og aktiv dødshjælp protokoller blev gennemgået og godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af University of Illinois i Chicago.
1. animalske modeller
- Wild-type Long-Evans rotter
- Skaffe en 24-32 daggamle vildtype lang Evans hætteklædte rotte af begge køn, der er rejst med en standard 12 h dag/nat rytme.
- Mørke tilpasse rotter ved at placere det i en helt mørkt værelse i 1 time forud for begyndelsen eksperiment.
- S334ter-3 rotter
- Krydse den transgene albino homozygote S334ter-3 rotte linje (begge køn), udtrykker to kopier af mutant rhodopsin-genet med pigmenteret vildtype Long-Evans rotte at producere pigmenteret heterozygous S334ter-3 rotter, der udviser fotoreceptor degeneration svarer i progression til menneskelige retinitis pigmentosa29,30.
- Hæve heterozygous afkom med standard 12 h dag/nat rytme og bruge rotter af begge køn for eksperimenter i de følgende aldre svarende til de følgende fotoreceptor degeneration faser: tidlig fase degeneration: 14-20 dage gammel; Middle fase degeneration: 21-27 dage gamle; Sen fase degeneration: 28-35 dage gamle; Helt blind: > 50 dage gammel.
- Mørke tilpasse rotter ved at placere det i en helt mørkt værelse i 1 time forud for begyndelsen eksperiment.
2. forberedelse af Ames' Medium løsning og Perfusion System
Figur 1: skematisk af eksperimentel opsætning. Skematisk af eksperimentel opsætning for kemiske stimulation ved hjælp af et glas mikropipette (A) og en brugerdefineret multiport mikrofluid enhed (B). Nethinden er placeret på en pMEA og løbende perfunderet med friske, iltet Ames medium løsning fra både toppen og bunden gennem pMEA perforeringer. Neurale reaktion signaler opfanges af elektroder af pMEA fodres gennem MEA forstærker i et data erhvervelse computer. Visuelle og kemiske stimulation er udført ved hjælp af en grøn LED og en 8-kanal pres injektor, henholdsvis, og begge stimuli er udløst af en dedikeret stimulus computer, som også bruges til at placere pipette via en præcision 3-akse micromanipulator. En inverteret mikroskop bruges til at iagttage nethinden under et eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: eksperimentel opsætning. (A) fotografi af komplet eksperimentel opsætning viser de relative placering af alle komponenter. MEA forstærker system er placeret på toppen af en inverteret mikroskop, der bruges til at visuelt inspicere nethinden og digitalt billede enhed-nethinden interface ved hjælp af den vedlagte højhastighedskamera under eksperimentet. Top og bund perfusion kontrolleres uafhængigt ved hjælp af en magnetventil-kontrollerede perfusion system. Injektion, position kontrol og impedans målinger er udført ved hjælp af et pres injector, micromanipulator og patch klemme forstærker (orange boks; vist mere detaljeret i B), henholdsvis. Mikropipette eller enheden er indsat i en patch klemme headstage impedans målinger og monteret på en gantry (angivet med grønne boks; vist mere detaljeret i C) at fremme positionering ved hjælp af en micromanipulator. (B) et nærbillede af målings- og instrumenterne i eksperimentet: 8-kanals pres injektor, micromanipulator kontrolsystem, patch klemme forstærker til impedans måling og suge fartøjet for perfusion afskaffelse. (C) et nærbillede af indsprøjtning system paafyldningsanordningen viser en multiport-enhed interface med pipette indehaveren, patch klemme headstage og micromanipulator. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Perfusion setup. (A) fotografi af toppen af MEA forstærker viser placeringen af den øverste perfusion og suge samt den grønne LED bruges til visuelle lys stimulation. (B) et nærbillede af pMEA perfusion mødesalen illustrerer de præcise steder i den øverste perfusion og suge, pMEA og referenceelektrode bruges til impedans måling. (C) en photomicrograph af perfusion bundplade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Bemærk: Se figur 1, figur 2og figur 3
- Afmåle 900 mL afioniseret vand ved stuetemperatur (~ 21 ° C) og placere i 1 L beholder.
- Perfuse vandet med 100% CO2 ved hjælp af en boblende mekanisme.
- Tilføje 8.8 g pulveriseret Ames medium til vand i 1 L beholder.
- Skyl Ames' medium beholder med et par mL afioniseret vand for at fjerne alle spor af pulveriseret Ames medium og tilføje til 1 L beholder.
- Tilføje 25.3 mL af natriumbikarbonat løsning (7.5% w/v31) til 1 L beholder.
- Tilsæt ekstra vand for at bringe løsningen til en endelige mængden af 1 L.
- Fortsætte perfusing vand med CO2 i ca 5 min.
- Stoppe CO2 perfusion og begynder perfusing løsning med en medicinsk-grade gasblanding af 95% O2 og 5% CO2 til mindst 30 min, eller indtil pH stabiliserer på 7,4.
Bemærk: Med henblik på denne protokol, Ames medium er opbevares ved stuetemperatur (~ 21 ° C) i hele eksperiment til at forhindre, at CO2 eller O2 udstrømning, som kan occlude perfusion linjer med luftbobler. - Rense bunden og toppen perfusion rør ved påfyldning med 70% ethanol og derefter vaske begge linjer 3 gange med afioniseret vand. Udfyld den nederste linje med afioniseret vand og den øverste linje med luft.
3. Wholemount Retinal forberedelse
Figur 4: dissektion og wholemount forberedelse af nethinden. (A) foto af et intakt øjestykket taget fra en fotoreceptor-degenereret dyr. (B) Photomicrograph af nethinden med langsgående snit til at flade ud. (C) efter udfladning nethinden, det er placeret på en maskegitteret med fotoreceptor side at kontakte trådnet og fladtrykt i luften (uden for perfusion medium) for at sikre, at der er ingen folder eller krøllede kanter. (D) den trådnet og nethinden er hurtigt overført til pMEA med ganglion celle side at kontakte elektroderne og straks perfunderet med iltet Ames medium. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: perforerede multielectrode array. (A) fotografi af den perforerede multielectrode array bruges i protokollen. Nethinden er placeret på elektrode-array (angivet med den røde rektangel, der vises i mere detaljeret i B) inden for pMEA kammer at tillade løbende perfusion med iltet Ames medium. (B) en photomicrograph af elektrode-array selv illustrerer arrangement af perforeringer mellem elektroderne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Bemærk: Se figur 4 og figur 5
- Ved hjælp af en håndholdt rød LED lommelygte til at levere dim rød belysning, aflive dyr via CO2-kvælning efterfulgt af cervikal dislokation eller en anden valgte metode, ifølge IACUC protokoller.
- Enucleate begge øjne ved hjælp af en guldsmed #5 pincet og placere kerneløse øjne i et 60 mm diameter petriskål med ca. 3-4 mL frisk, iltet Ames medium løsning.
- Mens observere øje gennem et dissektion stereomikroskop med top og bund lysgivere dækket med rødt filter skærmen, gør et lille snit i cornea ansigt ved hjælp af en skalpel eller et par skarpe saks.
- Skåret fra denne lille snit til kanten af hornhinden og derefter udvide cut i et omkredsen afsnit omkring hele kanten af hornhinden. Fjern nu fritliggende hornhinden sammen med objektivet, gennemskinnelige vandige og glaslegeme humør.
- Mens du forsigtigt holder øjestykket med et par pincet, omhyggeligt gøre to små snit på modsatte sider af øjestykket. Brug derefter to par pincet til forsigtigt at trække fra hinanden øjestykket på hver af indsnit og adskille nethinden fra sclera. Langsomt løfte hele nethinden fra sclera og øjestykket. Skære synsnerven, hvis det stadig er fastgjort.
- Langsgående skære i nethinden kan opnå halvdelen eller kvartal sektioner ved hjælp af saks, og derefter forsigtigt sprede én retinal sektion på en nylon mesh (100 µm gevinddiameter med 350 µm åbning) med ganglion celler (konkave side af nethinden) vender væk fra trådnet.
- Placer den trådnet og nethinden på en perforeret multielectrode array (pMEA) med ganglion celler i kontakt med pMEA overflade. Derefter forsigtigt placere et vægtet skive gitter oven på masken for at holde nethinden på plads.
4. MEA og Data erhvervelse Setup
Figur 6: støjniveauet af pMEA. (A) repræsentative optagelse af et undersæt af pMEA elektroder udstiller høj vedvarende støj. Denne støj er normalt på grund af en manglende ordentlig kontakt mellem pMEA kontakt puder og stifter af MEA forstærker som følge af normale slitage af tynde perforeret polyimid lag over pMEA, især på kontakt puder. Den anden mulig kilde til støj er typisk løsning lækket på pMEA forstærker kontakt puder. Vedvarende støj på grund af dårlig pin kontakt og/eller rende løsning på kontakt puder kan normalt korrigeres af skiftende placering af pMEA inden for forstærker til at opnå bedre kontakt og rengøring og tørring puder, henholdsvis. Hvis støj ikke kan fjernes ved rengøring eller skiftende pMEA placering, muligvis pMEA erstattes helt. (B) repræsentative optagelse af støjniveauer fra et undersæt af pMEA elektroder fra en ren pMEA med god kontakt mellem pMEA og forstærker. Det gennemsnitlige støjniveau er typisk inden for ±16 µV. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Bemærk: Se figur 6
- Under svagt rød belysning, placere pMEA i MEA forstærker og lukke forstærker låsene.
- Hvis referencemærker ikke allerede findes på pMEA kammer ring, etch to 'X'-formet mærker fordelt ca 5 mm fra hinanden i et område, der er synligt fra oven med boom-stativ monteret mikroskop.
- Placer øverste perfusion outlet inde pMEA kammer og tænder på den øverste perfusion ventil til at opnå en perfusion ca 3 mL pr. minut. Placer den øverste suge fjorden på det ønskede perfusate niveau (~ 5 mm dyb) og sikre, at det fungerer.
- Åbne data erhvervelse software på data erhvervelse computer og klikke på 'play' for at begynde at modtage data. Sikre, at alle pMEA kanaler er støjfri og optagelse neurale signaler.
- Ved at kigge på en live digital billede af inverteret mikroskop ager i se på en skærm, observere bunden overfladen af pMEA for beviser at løsning strømmer gennem perfusion bundplade.
5. glutamat Stimulation forberedelse
Figur 7: glas mikropipette og multiport mikrofluid enheden. (A) en pipette indehaveren før du isætter en mikropipette eller enhed. Sølv/sølvchloridelektrode elektrode (50 µm diameter) er elektrisk koblet til netværkskortet interface-end med patch klemme headstage. (B) et fotografi af glas mikropipette grænseflademodellen med pipette indehaveren viser placeringen af pres port bruges til at indlede pneumatisk injektioner. (C) en brugerdefineret multiport mikrofluid enhed (1 cm 1 cm 0.134 cm) knyttet til en brugerdefineret 3D-trykt armatur og grænseflademodellen med pipette indehaveren gennem et rustfrit stål rør. Enheden, som blev fabrikeret i to lag, har otte microports (diameter 14 µm) i det nederste lag (340 µm tykt) og otte på chip reservoirer (diameter 1,6 mm) til lagring af glutamat i det øverste lag (1 mm tyk). Hver af de otte microports i det nederste lag af enheden er uafhængigt tilsluttet en på chip reservoir i det øverste lag via en i-fly microchannel, og hver på chip reservoiret igen er tilsluttet en pres havn i 8-kanals pres injektoren via en fleksible rør til at tillade uafhængige aktivering af microports for mønstret flere lokationer injektioner. (D) et nærbillede af multiport enheden afholdt af pincet før montering slange interface armaturet viser arrangement af otte uafhængigt adresserbare på chip reservoirer og slangen ventiler. (E) en photomicrograph af bunden overfladen af enheden viser de otte 14 µm-diameter microports arrangeret i en 3 x 3 konfiguration med 200 µm afstand til justere med elektroder af pMEA. Otte udenfor microports er udnyttet til flere lokationer injektioner, mens den centrale havn blev anvendt strengt for justering under fabrikation af enheden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Bemærk: Se figur 7.
- Forberede glutamat løsning ved at blande stock glutamat solutionwith iltet Ames medium løsning for at opnå en 0,5 mL prøve på en arbejdende koncentration af 1 mM glutamat.
- Omhyggeligt indsætte en pre trak 10 µm-diameter mikropipette eller rustfrit stål stang tilsluttet enhedens multiport mikrofluid ind i en standard pipetteres indehaveren indeholdende en 50 µm diameter sølv/sølvchloridelektrode wire elektrode.
Bemærk: Hvis impedans påvisning ikke er tilgængelig, sølv/sølvchloridelektrode wire elektrode kan udelades. - Interface pipette indehaveren med patch-klemme headstage og tilslutte pres port luer forbindelse af indehaveren pipette til kanal 1 af indsprøjtningssystem pres, hvis udnytter et glas mikropipette eller forbinde pres port luer forbindelser af hver af 8 injektion havne med kanaler 1-8 i pres-indsprøjtningssystem, hvis bruger multiport-enhed.
- Manuelt Tænd pres indsprøjtningssystem og drej på kanal 1 (eller kanaler 1-8, hvor det er relevant). Sikre, at systemet er udluftes til det fri og indstille indsprøjtning pres til 0,1 psi.
- Tænd micromanipulator og kalibrere det ved at trykke på knappen 'Kalibrere' på manipulator controller. Placer micromanipulator, så mikropipette tip (eller nederst på enheden, som der gælder) er ca 30 mm over MEA forstærker.
- Fylde en lille petriskål med glutamat løsning (1 mM glutamat i standard Ames medium) og placere den under micromanipulator. Sænke mikropipette tip (eller enheden) til løsning og fylde ved at trykke på knappen "Fylde" på tryk indsprøjtningssystem (sugetryk for -13 i H2O) indtil der er ca 20 mm opløsning synlig i glas mikropipette eller den multiport enhed slanger.
- Hvis bruger multiport-enhed, dreje kanal 1 af pres injektor ud og Gentag protokollen for kanaler 2-8. Lift mikropipette tip eller enhed ud af løsning, fjerne petriskålen, og Placer micromanipulator ovenfor pMEA kammer.
- Ved hjælp af et boom-stand-monteret stereomikroskop, justere mikropipette tip eller hjørner af enheden med referencemærker ætset ind i pMEA kammer ringen. Gemme manipulator holdninger ind i kontrol software ved hjælp af knapperne 'Butik henvisning A' og 'Store Reference B' (eller blot Bemærk manipulator koordinaterne manuelt) at kortlægge koordinatsystemet for manipulator med pMEA elektroder.
- Bruge manipulator kontrol software, skal du vælge en target pMEA elektrode med robust spontane aktivitet og klik på 'Flyt til kanal' knappen for at justere glas micropipettewith target elektrode.
6. interface med nethinden
- Tænd patch klemme forstærker, hvis impedans målinger er tilgængelige, og indlede impedans visualisering software ved at klikke på knappen 'Start' for at visualisere impedans af sølv/sølvchloridelektrode elektrode inde pipette indehaveren. Under iagttagelse af real-time impedans signaler, langsomt sænke mikropipette eller enheden indtil det kontakter den retinale overflade som angivet ved en hurtig stigning i impedans signal (Se figur 8). Gemme eller læg mærke til placeringen af den retinale overflade.
- Hvis impedans måling ikke er tilgængelig, registrere kontakt med den retinale overflade ved visuel observation, selv om dette vil være mindre præcis. Lavere pipette eller enheden indtil det synligt kontakter oversiden af Ames medium løsning i MEA kammer.
- Derefter, mens observere toppen af nethinden med en inverteret mikroskop, langsomt sænke pipette eller enheden indtil oversiden af nethinden er synligt forvrænget, hvilket indikerer, at kontakt er sket med den retinale overflade. Gemme eller læg mærke til placeringen af den retinale overflade.
- Til undergrunden stimulation, sænke den yderligere pipette 40 µm (for S334ter-3 nethinder) eller 70 µm (for vildtype nethinder).
- Udføre et par korte varighed (10-30 ms) injektioner bruger pres injektion (0,1 psi) system til at afgøre, om cellerne nær mikropipette tip eller enhed microports er modtagelig for glutamat stimulation ved at observere de neurale signaler med dataopsamling software.
Bemærk: Vellykket injektioner vil fremkalde en klart synlig spike sats burst eller spike hæmning (Se figur 9). Hvis ingen svar er observeret, flytte mikropipette eller enhed på en anden elektrode.
Figur 8: impedans måling. (A) en skematisk af impedans måleteknik. Bruger patch klemme forstærker, er impedans af mikropipette løbende overvåges som det er langsomt sænkede mod den retinale overflade. Når mikropipette er over nethinden, resulterer den relativt høje ionisk ledningsevne af Ames medium i en lav impedans læsning. Som mikropipette gør kontakt med den retinale overflade, den ioniske ledningsevne gennem sølv/sølvchloridelektrode wire er reduceret, hvilket medfører en hurtig stigning i målte impedans. (B) et plot viser impedans ændringen registreret lige før og efter kontakt med pipette tip med den retinale overflade. Den målte impedans er relativt lavt når mikropipette tip i løsning lige før kontakt (angivet af den orange område til venstre). Når kontakten er foretaget (angivet ved den røde pilespids og det grønne område på højre), stiger impedansen hurtigt på grund af reduceret ionisk ledningsevne ved kontakt med den retinale væv. I praksis, er retinal overfladen registreret som højde svarende til starten af den stejle stigning af de målte impedans (placering af røde pilespidsen). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: elektrode optagelser af neurale aktivitet under visual, spontan, og glutamat injektion optagelser. (A) repræsentative optagelser fra ni pMEA elektroder viser high-pass filtreret elektrode data under visuel lys stimulation med en grøn LED hvor hvert rektangel viser de neurale data fra en unik elektrode. Hver elektrode optagelse illustrerer data indsamlet i det første sekund efter ombøjning oven på den grønne LED (timing vist med orange pilespidser i hver plot) med en fælles spænding skala vist i de venstre y-axes. Pigge blev identificeret ved hjælp af en tærskel spænding af – 18 µV (vandret rød linje i hver elektrode plot) og er repræsenteret af de sorte spor over grønne elektrode data. Visuel stimulation forårsaget en eksplosion af pigge (excitation) i alle elektroder undtagen øverst i midten en, som besad en hæmmende reaktion på lys. (B) en lignende plot for samme elektroderne viser spontan neurale aktivitet uden visuelle eller injektion stimulation. Selvom mindre byger var til stede, var mønstre af pigge meget forskellige fra dem, der registreres i svar til visuel stimulation. (C) repræsentative optagelser fra den samme delmængde af elektroder registreres umiddelbart efter en glutamat injektion på de centrale elektrode (timing angivet med orange pilespidser i hver plot). Den injicerede glutamat fremkaldte en byge af spidser i de centrale elektrode, der var meget lig visuelt fremkaldt spike brister. Alle andre elektroderne var upåvirket af glutamat indsprøjtning, som demonstrerer den fine rumlige opløsning af kemiske stimulation teknik. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
7. indlede Retinal optagelse og Stimulus-programmet
- Orientere den grønne LED mod oversiden af nethinden. Begynde optagelse ved hjælp af data erhvervelse software på den dedikerede optagelse computer ved at skrive filnavnet og klikke på "record"-knappen.
- Når optagelsen er startet, åbne programmet stimulus kontrol og indlæse standard stimulus fil ved at klikke på knappen "Læs Stimulus fil". Næste, klik på "Kør Stimulus fil" knappen for at indlede den standard stimulus fil bestående af stimuli og data erhvervelse protokollen beskrevet nedenfor.
Bemærk: a 30 forsøg 2 s ON og 2 s OFF fuld felt flash (5 lm/m2 intensitet) ved hjælp af den grønne lysdiode. (ii) 120 s data uden at bruge den grønne LED for at overspille en lignende tidsskala den spontane aktivitet af nethinden. (iii) 1 eller flere sæt af glutamat injektioner består af 30 forsøg med glutamat injektioner på 0,1 psi med 10-30 ms injektion gange (ca. 100-300 pL pr. injektion) og 3 s interpulse varigheder. I forbindelse med multi-site injektioner, Vælg 2 eller flere porte til at injicere samtidigt.
Figur 10: Peristimulus histogrammer af visual, spontan, og glutamat svar. (A) repræsentant peristimulus histogrammer (30 ms binwidth) af spike data fra delmængden af elektroder i figur 9A, gennemsnit over 20 forsøg med visuel lys stimulation. En fælles spike sats skala blev anvendt til alle elektroder og vises på de venstre y-axes. Den sorte linie i hver elektrode plot repræsenterer den gennemsnitlige spike sats for alle pigge registreret under det første sekund efter ombøjning den grønne lysdiode. Som det kan ses, forårsaget visuel stimulation en forbigående excitatoriske spike sats svar på alle elektroder undtagen top center elektrode, som havde en forbigående hæmmende reaktion på lys. (B) gennemsnitlige spontan spike sats svar registreres på de samme elektroder uden nogen synlig eller kemiske stimulation. Uden stimulation er spike satser for hver elektrode forholdsvis konstant. (C) de gennemsnitlige spike sats svar registreres på de samme elektroder som svar på en glutamat injektion på en placering over de centrale elektrode. Den kun forbigående reaktion indlysende er den excitatoriske svar på elektrode direkte under injektionsstedet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol kan bruges til kemisk stimulere både normale, wild-type nethinder samt fotoreceptor degenereret nethinder, trods den betydelige cellulære remodeling forårsaget af tabet af fotoreceptorer. Før begyndelsen eksperimenter med enten fotoreceptor degenereret eller vildtype nethinder, optagelse og stimulation udstyr (figur 1 og figur 2) skal være klar og pMEA (figur 5) skal rengøres for at minimere den støj på hver elektrode kanal (figur 6). Selvom fotoreceptor degenereret nethinder er tyndere og derfor mere sarte end vildtype nethinder, samme dissektion procedure (figur 4) bruges til begge dele. Følgende dissektion, nethinden er omhyggeligt placeret på pMEA med ganglion celle side vender elektroderne og pMEA sikret inde MEA forstærker (figur 3A), hvor det kan være konstant perfunderet med friske, iltet Ames medium fra både top (figur 3B) og bund (figur 3 c) sider. Efter at have sikret nethinden har stabiliseret fra Kirurgisk traume, er et glas mikropipette eller multiport-enhed monteret i en pipette indehaveren (figur 7A-E) og interface med en patch-klemme headstage hvis position er kontrolleret af en 3-akse præcision micromanipulator. Microport(s) pipette eller enheden bør derefter være justeret med en target elektrode og omhyggeligt sænkes indtil kontakt kan påvises ved hjælp af metoden impedans, vist i figur 8 eller visuelt bekræftet via mikroskopi. Når injektion levering porte er placeret på det rigtige sted på overfladen eller undergrunden af nethinden, kan programmet stimulation indledes.
Et repræsentativt sæt af neurale aktivitet optagelser på en delmængde af pMEA elektroderne er vist i figur 9 for visual (figur 9A), spontane (figur 9B) og eksogent injiceres glutamat (figur 9 c) stimuli. Vellykket visuelle og kemiske stimulering er normalt observerbare som brister i RGC spikes eller midlertidigt ophør med spiking aktivitet, som kan ses i eksemplerne i figur 9. Hvis nærliggende celler ikke reagerer på kemiske stimulation, vil den resulterende spike data ligne den spontane spiking adfærd. Efter udpakning RGC pigge og organisere dem i forsøg, kan de neurale svar på hver elektrode illustreres ved hjælp af en gennemsnitlig peristimulus tid histogram (PSTH) af den spiking sats, som vist i figur 10, der svarer til den rå elektrode data i figur 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden præsenteres her viser en unik neurale stimulation paradigme, hvori retinal neuroner kemisk stimuleres ved at indsprøjte indfødte neurotransmitter kemikalier i undergrunden af nethinden in vitro. Denne kemiske stimulation teknik tilbyder flere fordele over den konventionelle elektriske stimulation teknik, herunder selektivitet og høj fokale specificitet af target neuroner. Protokol over detaljer hvordan lille volumen pneumatisk injektioner af neurotransmitteren glutamat leveret nær målet retinal neuroner ved hjælp af enten en enkelt port glas mikropipette eller en brugerdefineret micromachined multiport mikrofluid enhed fremkalde fysiologisk betydelige RGC svar. Selv om denne protokol er blevet påvist med kun glutamat, stadig protokollen nyttigt for at studere kemiske stimulation af nethinden med andre typer af neurotransmittere. Desuden, selv om det er at foretrække at bruge et pMEA for en elektrofysiologiske optagelse32 , som skitseret i denne protokol, andre MEA design, herunder typen uperforeret kunne bruges til at opnå tilsvarende resultater som pMEA. I de følgende afsnit diskuterer vi de mest kritiske trin i vores protokol, metoder til fejlfinding af almindelige problemer og begrænsninger og fremtidige anvendelser af denne stimulation teknik.
For at opnå sikker og pålidelig kemiske stimulation, skal flere kritiske trin udføres i denne protokol. Et af de vigtige skridt er at opnå en vellykket retinal forberedelse ved forsigtigt at udtrække nethinden og minimere mængden tid den holdes udenfor iltet Ames medium, dvs., når udfladning frisk dissekeret nethinden på maskegitteret før du overfører det til pMEA perfunderet med Ames medium. Indledende dissektion af nethinden kræver skarpe dissektion værktøjer og praksis da rotte øjet er relativt lille. Desuden, udvinding af fotoreceptor degenererede nethinder kan være særlig vanskeligt, da de er mere skrøbelige end de allerede skrøbelige normale retinae, og er derfor tilbøjelig til at rive. Hele dissektion processen, fra indledende enucleation til markedsføring nethinden pMEA, bør ske så hurtigt som muligt at forhindre for tidlig celledød mangel på ilt eller andre næringsstoffer. Mekanisk traume formidles til vævet under dissektion bør minimeres ved at undgå et snit gennem eller skader på væv, da dette kan også føre til unaturlige neurale svar og celledød.
Efter markedsføring nethinden pMEA, skal sørges når indlede top og bund perfusion og suge linjer, da dette er et fælles punkt for fiasko af eksperimentet. Alle perfusion og suge linjer skal kontrolleres for regnskabsafslutning forud for begyndelsen af eksperimentet og periodisk undersøgelse i hele eksperiment at sikre at luftbobler ikke hindrer flow gennem linjerne. Især kan dannelsen af luftbobler i perfusion bundlinje helt hindrer strømmen af perfusion på grund af dens mindre diameter, og dermed forårsage en for tidlig afslutning eksperimentet ved at fratage nethinden af ilt og næringsstoffer. På grund af faren for luftbobler, er den ovennævnte protokol gennemført ved stuetemperatur og ikke på den mere ideelle fysiologisk temperatur at undgå udstrømning af opløst ilt og kuldioxid fra Ames medium løsning. Hvis luftbobler occlude en af linjerne perfusion under et eksperiment, kan de normalt blive spredt i mindre, ikke-tilstoppe boblerne ved at trykke let på linjen perfusion.
Et andet fælles problem i relation til perfusion system er finjustering af sugetryk bunden, så det holder nethinden fast kontakt med elektroderne, men uden skader. Hvis den sugetryk for højt, kan det sutte små stykker af nethinden gennem perforeringer af pMEA og til sidst føre til ophør af alle neurale svar. På den anden side, hvis trykket er for lavt, vil nethinden flyde væk fra elektroderne og derfor forstyrre den neurale optagelse. Justere sugetryk mellem disse to ekstreme niveauer kræver praksis og er gjort lettere, hvis pMEA bruges over en inverteret mikroskop, som giver mulighed for tæt observation af perforeringer af pMEA. Ved at observere disse perforeringer mens du justerer suge, kan man finde den rette balance, der opretholder kontakt uden at beskadige nethinden. For at minimere muligheden for photobleaching af fotoreceptorer, når stimulere vildtype nethinder, inverteret mikroskop illuminator bør være filtreret for at udsende rødt lys kun og visuelle observationer skal afsluttes hurtigst muligt.
Efter at sikre ordentlig perfusion betingelser, er det næste vigtige skridt referencing enhed eller pipette med en synlig faste punkt eller markør på pMEA, så indsprøjtning porte kan justeres præcist med pMEA elektroder. Typisk, dette opnås via triangulering hvori to referencemærker placeret på kanten af pMEA kammer er groft justeret med enten glas mikropipette tip eller landmærker på multiport-enhed ved visuel observation fra oven ved hjælp af den Boom-stativ monteret mikroskop. En finere justering af injektion porte med target elektroder opnås derefter ved besigtigelse gennem inverted mikroskop. Når justeret korrekt, bør pleje tages, når du nærmer nethinden med enten en pipette eller en mikrofluid enhed, da enhver manipulator jitter eller drift kunne knuse nethinden eller skade pMEA. Den bedste måde at undgå ved et uheld beskadige nethinden er løbende overvåge impedans af pipette elektrode til netop afsløre kontakt med den øverste retinal overflade. Impedans måling kan også bruges til hurtigt at kontrollere hvis mikropipette tip indsat i undergrunden af nethinden er blokeret, som er angivet af impedans unormalt høje (typisk i rækken gigaohm). Hvis blokeret, kan mikropipette tip normalt ryddes ved at indlede et højtryk puls med spidsen placeret væk fra nethinden til at undgå utilsigtet skade. I sjældne tilfælde kan blokerede pipetter skal udskiftes helt, hvis højtryks pulser ikke fjerne blokeringen. En unormal eller høj impedans værdi kan også registreres, når referenceelektrode ikke korrekt grænseflade mellem løsning i pMEA kammer og patch klemme forstærker.
Når placeret på en destinationsplacering, bør Injektionsvolumen af glutamat styres stramt af begrænsende pres, injektion tid og neurotransmitter koncentration at undgå overstimulation af neuroner, som har vist sig at forårsage excitotoxic skader.Glutamat injektion parametre detaljeret i denne protokol repræsenterer et regime, der er langt under den kendte tærskel for forårsager glutamat excitotoxicity33 , men når du forsøger denne protokol med andre typer af neurotransmittere, svarende tærskelværdierne for excitotoxicity effekter skal anses for sikkert stimulation. Også, 0,1 psi indsprøjtning pres foreskrevet i ovennævnte protokol var afledt af den laveste mulige pres indstilling tilgængelig på 8-kanals pres injektoren anvendes i denne undersøgelse, men har produceret vellykkede resultater konsekvent. Derfor er 0,1 psi for neurotransmitter injektioner kun suggestivt, men ikke restriktive, at opnå en vellykket kemiske stimulering. Hvis lavere aktivering pres er muligt med en anderledes pres injektor, kan injektioner udføres på pres lavere end 0.1 psi.
En begrænsning af denne protokol, der involverer in vitro- wholemount retinal præparater er den korte eksperimentelle tidsvindue, som er begrænset til varigheden af 8 h eller mindre, selv med ekstrem omhu gennem hele eksperimentet. Dette begrænsede eksperimentelle tidsvindue tillader ikke undersøgelse af eventuelle langsigtede virkninger af kemiske stimulation som excitotoxicity. En anden begrænsning af denne specifikke protokol er valget mellem at optage ved stuetemperatur i modsætning til fysiologisk temperatur, som sandsynligvis påvirker både den visuelt - og kemisk-fremkaldte spike sats svar, da tidligere undersøgelser har vist, at lavere optagelse temperaturer kan ændre spiking sats, svar ventetid og glutamat optagelse sats blandt flere andre egenskaber34,35,36,37,38. Denne begrænsning kan undgås ved hjælp af en ikke-perforeret MEA med et opvarmet bundplade, i modsætning til pMEA, som udnytter en specialdesignet bundplade perfusion uden en opvarmet plade og/eller en effektiv termisk debubbler for både top og bund perfusion.
Endelig, in vitro- forberedelse er begrænset af nødvendigheden af aktiv perfusion af iltet Ames medium at holde nethinden sund. De flydende strømme forårsaget af perfusion system er typisk meget hurtigere end de naturlige perfusion mekanismer findes i øjet i vivo39, og kunne blande sig med kemiske indsprøjtninger af tegning injiceres neurotransmittere væk fra den nethinden. Overflade-baserede injektioner, såsom nogle lavet med multiport-enhed, vil sandsynligvis være mere modtagelige for perfusion aktuelle indblanding i forhold til undergrunden injektioner, selvom tilstedeværelsen af perfusion fra bunden af pMEA kunne forårsage en lignende effekt i hele den hele nethinden. Af denne grund, glutamat kemikalier i den nuværende protokol blev leveret med pneumatisk tryk, men den indsprøjtning pres der kræves for at opnå succesfulde stimulation in vivo kan være betydeligt lavere end den, der udnyttede in vitro- undersøgelser.
Kemiske stimulation, som søger at aktivere neuroner med mere naturlige neurotransmitter stimuli, tilbyder et effektivt alternativ til den konventionelle elektriske stimulation men ikke endnu blevet alvorligt udforsket. Som en konsekvens, findes der lidt litteratur beskriver protokol eller bedste praksis for at opnå pålidelige subretinal kemiske stimulation af retinale neuroner. Nylige undersøgelser28 ved hjælp af denne protokol har vist at subretinal kemiske stimulation af retinale neuroner kan pålideligt fremkalde RGC svar med rumlige resolutioner sammenlignelige eller bedre end elektrisk stimulation af nethinden, og der er bevis for, at subretinally anvendes eksogene glutamat kan stimulere bipolar celler direkte, giver denne metode til at drage fordel af den nethinden iboende visuelle forarbejdning kredsløb og formentlig, fremmane opfattelser mere ligner naturligt lys stimulation.
Yderligere undersøgelser er nødvendige for at validere disse resultater i ikke-murine modelsystemer og undersøge spørgsmål, der ikke behandles af de tidligere undersøgelser, herunder de langsigtede virkninger og praktiske aspekter i vivo gennemførelsen af dette strategi. Derfor, fremtidige retning for denne tilgang klart ligge i at oversætte dette begreb i vivo dyremodeller ved at udvikle passende teknologi for at opnå langsigtet kemiske levering og stimulation med en implantable lys-drevne mikrofluid enhed, der fungerer som en erstatning for det degenererede fotoreceptor laget. Som en relativt forsømt stimulation paradigme, den bredere anvendelse af kemiske stimulation har endnu at blive opdaget, men da nethinden er en del af centralnervesystemet40, denne stimulation strategi potentielt kunne anvendes i andre neurale stimulation sammenhænge, såsom behandling af kortikale, spinal cord eller neuromuskulære lidelser ved hjælp af forskellige neurotransmittere. Derudover kunne præsenteres protokollen vedtages mere generelt for studier undersøger virkningerne af kontrolleret levering af et lægemiddel eller andre kemikalier i neurale væv med fine spatiotemporelle opløsning i en in vitro- indstilling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Det arbejde fremlagt i papiret blev støttet af National Science Foundation, nye grænser inden for forskning og Innovation (NSF-EFRI) program giver nummer 0938072. Indholdet af dette dokument er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af NSF. Forfatterne ønsker også at takke Dr. Samsoon Inayat for hans arbejde, designe og afprøve den indledende eksperimentelle opsætning for kemiske stimulation og Mr. Ashwin Raghunathan for hans arbejde designe, opdigte og evaluere multiport mikrofluid enheden bruges i denne undersøgelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| 8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| 60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
| Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
References
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. , (2011).
- Fritsche, L. G., Fariss, R. N., Stambolian, D., Abecasis, G. R., Curcio, C. A., Swaroop, A. Age-Related Macular Degeneration: Genetics and Biology Coming Together. Annu Rev Genomics Hum Genet. 15, 151-171 (2014).
- Marc, R. E., et al. Neural reprogramming in retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 3364-3371 (2007).
- Jones, B. W., Kondo, M., Terasaki, H., Lin, Y., McCall, M., Marc, R. E. Retinal remodeling. Jpn J Ophthalmol. 56, 289-306 (2012).
- Soto, F., Kerschensteiner, D. Synaptic remodeling of neuronal circuits in early retinal degeneration. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Trenholm, S., Awatramani, G. B. Origins of spontaneous activity in the degenerating retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Euler, T., Schubert, T. Multiple Independent Oscillatory Networks in the Degenerating Retina. Front Cell Neurosci. 9, (2015).
- Boye, S. E., Boye, S. L., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. A Comprehensive Review of Retinal Gene Therapy. Mol Ther. 21, 509-519 (2013).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. The Lancet. 385, 509-516 (2015).
- Reh, T. A. Photoreceptor Transplantation in Late Stage Retinal Degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (2016).
- Zrenner, E.
- Humayun, M. S., de Juan, E. Jr, Dagnelie, G. The Bionic Eye: A Quarter Century of Retinal Prosthesis Research and Development. Ophthalmol. 123, S89-S97 (2016).
- Cruz, L., et al. The Argus II epiretinal prosthesis system allows letter and word reading and long-term function in patients with profound vision loss. Br J Ophthalmol. 97, 632-636 (2013).
- Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. P R Soc B. 278, 1489-1497 (2011).
- Stronks, H. C., Dagnelie, G. The functional performance of the Argus II retinal prosthesis. Expert Rev Med Devices. 11, 23-30 (2014).
- Stingl, K., et al. Artificial vision with wirelessly powered subretinal electronic implant alpha-IMS. P R Soc B. 280, (2013).
- Rizzo, J. F. Update on retinal prosthetic research: the Boston Retinal Implant Project. J Neuroophthalmol. 31, 160-168 (2011).
- Ayton, L. N., et al. First-in-Human Trial of a Novel Suprachoroidal Retinal Prosthesis. PLoS ONE. 9, e115239 (2014).
- Chuang, A. T., Margo, C. E., Greenberg, P. B. Retinal implants: a systematic review. Br J Ophthalmol. 98, 852-856 (2014).
- Cai, C., Twyford, P., Fried, S. The response of retinal neurons to high-frequency stimulation. J Neural Eng. 10, 036009 (2013).
- Eiber, C. D., Lovell, N. H., Suaning, G. J. Attaining higher resolution visual prosthetics: a review of the factors and limitations. J Neural Eng. 10, 011002 (2013).
- Humayun, M., Propst, R., de Juan, E., McCormick, K., Hickingbotham, D. Bipolar surface electrical stimulation of the vertebrate retina. Arch Ophthalmol. 112, 110-116 (1994).
- Zrenner, E., et al. Can subretinal microphotodiodes successfully replace degenerated photoreceptors? Vision Res. 39, 2555-2567 (1999).
- Majji, A. B., Humayun, M. S., Weiland, J. D., Suzuki, S., D'Anna, S. A., de Juan, E. Long-Term Histological and Electrophysiological Results of an Inactive Epiretinal Electrode Array Implantation in Dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Peterman, M. C., Noolandi, J., Blumenkranz, M. S., Fishman, H. A. Localized chemical release from an artificial synapse chip. PNAS. 101, 9951-9954 (2004).
- Finlayson, P. G., Iezzi, R. Glutamate stimulation of retinal ganglion cells in normal and s334ter-4 rat retinas: a candidate for a neurotransmitter-based retinal prosthesis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 3619-3628 (2010).
- Inayat, S., Rountree, C. M., Troy, J. B., Saggere, L. Chemical stimulation of rat retinal neurons: feasibility of an epiretinal neurotransmitter-based prosthesis. J Neural Eng. 12, 016010 (2015).
- Rountree, C. M., Inayat, S., Troy, J. B., Saggere, L. Differential stimulation of the retina with subretinally injected exogenous neurotransmitter: A biomimetic alternative to electrical stimulation. Sci Rep. 6, 38505 (2016).
- Ray, A., Sun, G. J., Chan, L., Grzywacz, N. M., Weiland, J., Lee, E. -J. Morphological alterations in retinal neurons in the S334ter-line3 transgenic rat. Cell Tissue Res. 339, 481-491 (2010).
- Martinez-Navarrete, G., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Fernandez-Sanchez, L., Pinilla, I., Cuenca, N. Retinal degeneration in two lines of transgenic S334ter rats. Exp Eye Res. 92, 227-237 (2011).
- Sigma Aldrich. Sigma Aldrich Ames Medium Product Information Sheet. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Product_Information_Sheet/1/a1420pis.pdf (2017).
- Reinhard, K., et al. Step-By-Step instructions for retina recordings with perforated multi electrode arrays. PLoS ONE. 9, e106148 (2014).
- Izumi, Y., Kirby, C. O., Benz, A. M., Olney, J. W., Zorumski, C. F. Müller cell swelling, glutamate uptake, and excitotoxic neurodegeneration in the isolated rat retina. Glia. 25, 379-389 (1999).
- Tunnicliff, G. Glutamate uptake by chick retina. Biochem J. 150, 297-299 (1975).
- Schwartz, E. A., Tachibana, M. Electrophysiology of glutamate and sodium co-transport in a glial cell of the salamander retina. J Physiol (Lond). 426, 43-80 (1990).
- Muller, A., Maurin, L., Bonne, C. Free radicals and glutamate uptake in the retina. Gen Pharmacol- Vasc S. 30, 315-318 (1998).
- Dhingra, N. K., Kao, Y. -H., Sterling, P., Smith, R. G. Contrast threshold of a brisk-transient ganglion cell in vitro. J of Neurophysiol. 89, 2360-2369 (2003).
- Ahlers, M. T., Ammermüller, J. A system for precise temperature control of isolated nervous tissue under optical access: Application to multi-electrode recordings. J of Neurosci Methods. 219, 83-91 (2013).
- Feke, G. T., Tagawa, H., Deupree, D. M., Goger, D. G., Sebag, J., Weiter, J. J. Blood flow in the normal human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30, 58-65 (1989).
- The Retina. Neuroscience. Purves, D., et al. , 2nd edition, Sinauer Associates. (2001).
