Summary
Este protocolo describe un método novedoso para la investigación de una forma de neuroestimulación química de wholemount rat retinas en vitro con el neurotransmisor glutamato. Química neuroestimulación es una alternativa prometedora a la neuroestimulación eléctrica convencional de retinales neuronas para tratar ceguera irreversible causada por enfermedades degenerativas fotorreceptor.
Abstract
Enfermedades degenerativas fotorreceptor causan ceguera irreparable por la pérdida progresiva de células fotorreceptoras en la retina. Prótesis retinianas son un tratamiento emergente para enfermedades degenerativas fotorreceptor que buscan restaurar la visión estimulando artificialmente las neuronas retinianas sobrevivientes con la esperanza de suscitar comprensible percepción visual en los pacientes. Prótesis retinianas actuales han demostrado éxito en la restauración de la visión limitada a los pacientes mediante una matriz de electrodos para estimular la retina eléctricamente pero enfrentan importantes barreras físicas en la restauración de alta agudeza, visión natural a los pacientes. Neuroestimulación química utilizando neurotransmisores nativos es una estimulación alternativa eléctrica biomiméticos y podría eludir las limitaciones fundamentales asociadas con prótesis retinianas mediante neuroestimulación eléctrica. Específicamente, neuroestimulación química tiene el potencial para restaurar la visión más natural con agudezas visuales comparables o mejores a los pacientes mediante la inyección de cantidades muy pequeñas de los neurotransmisores, los mismos agentes naturales de comunicación utilizado por la retina sinapsis química, en una resolución mucho más fina que prótesis eléctricas actuales. Sin embargo, como un paradigma de estimulación relativamente inexplorada, hay ningún protocolo establecido para lograr la estimulación química de la retina en vitro. El propósito de este trabajo es proporcionar un marco detallado para lograr estimulación química de la retina para investigadores que deseen estudiar el potencial de la neuromodulación química de la retina o similar los tejidos neuronales in vitro. En este trabajo, describimos el montaje experimental y metodología para la obtención de ganglionares de la retina células (RGC) spike respuestas similares a visual luz respuestas de tipo salvaje y degenerado fotorreceptor wholemount retinas de rata mediante la inyección controlada volúmenes de el neurotransmisor glutamato en el espacio subretinal utilizando Micropipetas de vidrio y un dispositivo de microfluidos multipuerto personalizado. Esta metodología y protocolo son lo bastante generales como para ser adaptado para neuromodulación mediante otros neurotransmisores o incluso otros tejidos neuronales.
Introduction
Fotorreceptor enfermedades degenerativas, tales como retinitis pigmentosa y degeneración macular relacionada con la edad, son principales a causas hereditarias de pérdida de la visión y son actualmente incurables1,2. Aunque estas enfermedades surgen de una variedad de mutaciones genéticas específicas, enfermedades degenerativas del fotorreceptor se caracterizan como un grupo por la pérdida progresiva de las células fotorreceptoras en la retina, que finalmente causa la ceguera. La pérdida de disparadores de fotorreceptores extensa remodelación a lo largo de la retina, pero sobrevivir a las neuronas retinianas, incluyendo las células bipolares y RGCs, permanece intacto y relativamente funcional incluso en etapas avanzadas de la degeneración de fotorreceptores3 ,4,5,6,7.
Los mecanismos y patologías de estas enfermedades han sido bien caracterizado3,4,5,6,7 pero un tratamiento eficaz sigue siendo elusivo. En las últimas tres décadas, los investigadores en todo el mundo han estudiado una variedad de tratamientos terapéuticos para restaurar la visión a las personas afectadas con enfermedades degenerativas del fotorreceptor incluyendo gene terapia8, células madre tratamiento9, trasplante de retina10y estimulación artificial11,12 de las neuronas retinianas sobrevivientes. De éstos, el más clínicamente disponible es prótesis retinianas, que son dispositivos de neuroestimulación artificiales que tradicionalmente han utilizado una gran variedad de electrodos para estimular eléctricamente las células bipolares o RGCs en patrones específicos con el objetivo de la creación de percepciones visuales artificiales en pacientes11. Prótesis eléctrica de generación actual, como el Argus II13 y alfa-IMS14 dispositivos, han logrado la aprobación clínica y estudios preliminares han indicado que puede mejorar la calidad de vida para los pacientes mediante la restauración de un medida de la visión usando epiretinal (frente de la retina) y subretinal (parte posterior de la retina) implantados dispositivos15,16. Grupos de investigación alrededor del mundo están trabajando en el avance de las prótesis retinianas más allá de los éxitos de estos dispositivos de primera generación17,18,19,20 pero se han enfrentado a dificultades de diseñar una prótesis eléctrica capaz de restaurar la visión de alta acuidad por debajo del nivel de ceguera legal a los pacientes. Estudios recientes han demostrado que lograr mayor resolución espacial que el permitido por la actual generación eléctrica basado en prótesis es difícil debido al límite de inyección de carga, que hace necesario el uso de grandes electrodos para estimular de forma segura neuronas retinianas a costa de resolución espacial, es decir, la agudeza visual de11,21. Por otra parte, la estimulación eléctrica es más limitado ya que normalmente estimula todas las células cercanas y por lo tanto provoca percepciones confusas y antinaturales en pacientes, en gran parte debido a que es un paradigma de estimulación intrínsecamente antinatural21. Sin embargo, los primeros éxitos de la estimulación eléctrica han demostrado que eso neuroestimulación artificial puede ser un tratamiento eficaz para enfermedades degenerativas fotorreceptor. Esto nos lleva a la hipótesis de que un tratamiento aún más eficaz podría ser realizable mediante la estimulación de la retina con los químicos neurotransmisores, los agentes naturales de la comunicación en las sinapsis químicas. El propósito del método presentado en este trabajo es explorar la viabilidad terapéutica de la estimulación química, que trata de imitar el sistema natural de la comunicación sináptica entre neuronas retinianas, como un estímulo alternativo a eléctrica biomiméticos para una prótesis de retina.
Traducción del concepto de estimulación química terapéutica a una prótesis de retina química se basa en activar químicamente las neuronas retinianas blanco con pequeñas cantidades de neurotransmisores nativas, como el glutamato, a través de un microfluídicos dispositivo que comprende una gran variedad de funciones en respuesta a la estimulación visual. De esta manera, una prótesis de retina química sería esencialmente una capa de fotorreceptores artificiales biomiméticos que traduce fotones llegar naturalmente a la retina a señales químicas. Ya que estas señales químicas utilizan los mismos neurotransmisores utilizados en la señalización normal de la retina y estimulan las neuronas retinianas sobrevivientes de una retina degenerado a través de las vías sinápticas mismo utilizado por vías de la visión normal, el resultado visual percepción mediante una prótesis retiniana química podría ser más natural y comprensible en comparación con uno evocado a través de una prótesis eléctrica. Por otra parte, puesto que las funciones a través del cual se liberan neurotransmisores pueden hacerse extremadamente pequeño y vestida en alta densidad, a diferencia de los electrodos un potencial químico prótesis podría ser capaz de lograr más estímulo focal y mayor espacial resolución que una prótesis eléctrica. Así, partiendo de estas ventajas potenciales, una prótesis de retina química ofrece una alternativa altamente prometedora para prótesis eléctricas.
Estimulación química de la retina, sin embargo, ha sido relativamente poco explorada hasta hace poco. Mientras que la estimulación eléctrica de la retina ha sido bien caracterizada en décadas de trabajo a través de vitro en22,23, en vivo23,24estudios clínicos13 ,14, estudios sobre estimulación química se han limitado exclusivamente a unos pocos en vitro obras25,26,27,28. Iezzi y Finlayson26 y Inayat et al. 27 demostró epiretinal estimulación química de la retina en vitro usando un solo electrodo y una matriz micropozo-microcanal (MEA), respectivamente, para registrar las respuestas de glutamato evocado de las neuronas retinianas. Más recientemente, Rountree et al. 28 demostró la estimulación diferencial de los caminos y retinales usando glutamato desde el lado del subretinal y un MEA para registrar las respuestas neuronales desde múltiples sitios en la retina.Aunque estos trabajos han establecido preliminarmente la viabilidad de la estimulación química, más estudios son esenciales para investigar muchos aspectos de este enfoque más allá de las dirigidas hasta ahora25,26,27 , 28y ajustar los parámetros de estimulación terapéutica en modelos animales tanto in vitro e in vivo antes de traducir este concepto a una prótesis de retina química según lo discutido arriba. Sin embargo, actualmente no hay ninguna metodología establecida para lograr la estimulación química de la retina en la literatura y los métodos utilizados en los trabajos anteriores no se han descrito tan detalladamente como sería esencial para estudios replicativos. Por lo tanto, la justificación de este trabajo de métodos es proporcionar un marco bien definido para llevar a cabo en vitro la estimulación química de la retina para aquellos investigadores interesados en la replicación de los estudios anteriores27, 28 o avanzar aún más este concepto naciente de neuroestimulación química.
Aquí se demuestra un método para llevar a cabo en vitro la estimulación química de neuronas retinianas en wholemount retinas de ratas de tipo salvaje y un modelo de ratas degeneradas de fotorreceptor que imita muy de cerca la progresión del fotorreceptor degenerativa enfermedades en los seres humanos. Es el fundamento de desarrollo de este método de estimulación en vitro modelos para evaluar los rangos terapéuticos de varios parámetros de estimulación y estudiar las características de la respuesta neural que serían imposibles o difíciles de observar en en vivo modelos, especialmente durante los estudios iniciales se centraron en evaluar la factibilidad de este enfoque. En este procedimiento, se muestran solo sitio y simultáneamente múltiples sitios estímulos químicos de retinas entregando cantidades pequeñas de 1 mM de glutamato cerca neuronas retinianas blanco mediante Micropipetas de vidrio un puerto disponible en el mercado y una costumbre dispositivo de microfluidos puertos múltiples micro, respectivamente. Mientras solo sitio y de sitios múltiples estímulos logran el objetivo fundamental de investigar la viabilidad terapéutica de la neuromodulación química, cada una sirve a un propósito distinto con una ventaja única. La estimulación del solo sitio, que puede ser lograda con Micropipetas de vidrio tirado previamente disponibles en el mercado, se puede utilizar para inyectar productos químicos directamente en la superficie de la retina en un solo lugar y sirve para investigar si grave observable spike tasa respuestas que son similares a las respuestas ligeras visualmente evocadas pueden sacadas focal en el sitio de inyección. Por otro lado, estimulación multisitio, que requiere un dispositivo de microfluidos multipuerto fabricado especialmente, puede ser utilizada para inyectar productos químicos espacial en varios sitios sobre la superficie de la retina y sirve para investigar cómo bien evocados por el glutamato RCG patrones de respuesta corresponden a los patrones de inyección de glutamato en los estudios de estimulación de patrón.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron según las pautas descritas por guía del National Research Council para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Protocolos de manejo y eutanasia animal fueron revisados y aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Illinois en Chicago.
1. animales modelos
- Ratas Long-Evans de tipo salvaje
- Procurar una rata Evans larga con capucha de tipo salvaje de 24-32 días de ambos sexos con un ritmo día/noche de estándar 12 h.
- Oscuro se adaptan la rata colocando en una habitación completamente a oscuras durante 1 h antes de iniciar el experimento.
- S334ter-3 ratas
- Cruzar la albino transgénica homocigótica S334ter-3 rata línea (ambos sexos), expresando dos copias del gen de la rodopsina mutante, con una rata de Long-Evans de tipo salvaje pigmentada para producir pigmentadas heterozigótico S334ter-3 las ratas que presentan degeneración de fotorreceptores similar en la progresión de la retinosis pigmentaria humana29,30.
- Levantar descendencia heterocigoto con ritmo de estándar 12 h día/noche y usar ratas de ambos sexos para los experimentos de las edades siguientes correspondientes a las siguientes etapas de la degeneración de fotorreceptores: degeneración de etapa temprana: 14-20 días de edad; Medio de la degeneración de la etapa: 21-27 días de edad; Degeneración de etapa tardía: 28-35 días de edad; Ciegos: > 50 días de edad.
- Oscuro se adaptan la rata colocando en una habitación completamente a oscuras durante 1 h antes de iniciar el experimento.
2. preparación de solución media de Ames y el sistema de perfusión
Figura 1: esquema de montaje experimental. Esquema de la instalación experimental de estimulación química usando una micropipeta de vidrio (A) y un dispositivo de microfluidos multipuerto personalizado (B). La retina es a un pMEA y continuamente inundada con fresca, oxigenada solución media de Ames de arriba y abajo a través de las perforaciones del pMEA. Señales de respuesta neural recogidas por los electrodos de la pMEA son alimentadas por el amplificador MEA en un equipo de adquisición de datos. Estimulación visual y química se logra usando un LED verde y un inyector de presión de 8 canales, respectivamente, y ambos estímulos son accionados por un equipo dedicado de estímulo, que también se utiliza para colocar la pipeta a través de una precisión de 3 ejes instrumental quirúrgico. Un microscopio invertido se utiliza para observar la retina durante un experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: montaje Experimental. (A) fotografía de la instalación experimental completa que muestra las posiciones relativas de todos los componentes. El sistema de amplificador MEA se coloca sobre un microscopio invertido, que se utiliza para inspeccionar visualmente la retina y de la imagen digital la interfaz de dispositivo-retina por medio de la cámara de alta velocidad conectada durante el experimento. Perfusión superior e inferior se controla de manera independiente utilizando un sistema de perfusión controlada por solenoide. Inyección, control de posición y las mediciones de impedancia se logran usando un inyector de presión, instrumental quirúrgico y amplificador de la abrazadera del remiendo (cuadro naranja; se muestra con más detalle en B), respectivamente. La micropipeta o el dispositivo se inserta en un parche pinza headstage para mediciones de impedancia y montada en un pórtico (indicado por la caja verde, se muestra con más detalle en C) para facilitar el posicionamiento utilizando un micromanipulador. (B) un primer plano de los instrumentos de medición y control utilizados en el experimento: el inyector de presión de 8 canales, sistema de control de instrumental quirúrgico, parche pinza amplificador para medición de impedancia y el vaso de aspiración para la eliminación de la perfusión. (C) un primer plano del pórtico de sistema de inyección, mostrando un dispositivo multipuerto interconectado con el titular de la pipeta patch clamp headstage y amalgamas dentales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: configuración de perfusión. (A) fotografía de la parte superior del amplificador MEA mostrando la ubicación de la perfusión superior y aspiración así como el LED verde que se utiliza para la estimulación visual de luz. (B) un primer plano de la cámara de perfusión pMEA ilustrando la ubicación precisa de la perfusión superior y succión, el pMEA y el electrodo de referencia utilizado para la medición de impedancia. (C) una microfotografía de la placa inferior de perfusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Nota: Ver figura 1, figura 2y figura 3
- Mida 900 mL de agua desionizada a temperatura ambiente (~ 21 ° C) y colocar en envase de 1 L.
- Inundar el agua con 100% de CO2 utilizando un mecanismo de propagación.
- Añadir 8,8 g de medio en polvo Ames al agua en envase de 1 L.
- Enjuagar de Ames medio con unos pocos mL de agua desionizado para eliminar todos los rastros del medio en polvo Ames y agregar al recipiente de 1 L.
- Agregar 25,3 mL de solución de bicarbonato de sodio (7,5% w/v31) al recipiente de 1 L.
- Agregue más agua para llevar la solución a un volumen final de 1 L.
- Continuar perfundiendo el agua con CO2 durante aproximadamente 5 minutos.
- Parar perfusión de CO2 y comenzar perfundiendo la solución con una mezcla de gas grado médico de 95% O2 y 5% CO2 para por lo menos 30 min o hasta que se estabilice el pH a 7.4.
Nota: Para los efectos del presente Protocolo, el medio de Ames se mantiene a temperatura ambiente (~ 21 ° C) durante todo el experimento para evitar CO2 o O2 de emisión de gases, que pueden obstruir las líneas de perfusión con burbujas de aire. - Limpiar los tubos superior e inferior de la perfusión por llenar con etanol al 70% y luego lavar ambas líneas 3 veces con agua desionizada. Llene la línea de fondo con la línea superior con aire y agua desionizada.
3. Wholemount retiniana preparación
Figura 4: preparación de retina disección y wholemount. (A) fotografía de un ocular intacta de un animal degenerado fotorreceptor. (B) microfotografía de la retina con cortes longitudinales para aplanar hacia fuera. (C) después de aplanar la retina, que se coloca sobre una rejilla de malla con el lado de fotorreceptores en contacto con la malla y no aplanado en el aire (fuera del medio de perfusión) para asegurarse de que está pliegues o bordes rizados. (D) la malla y la retina son rápidamente transferidos al pMEA con el lado de la célula del ganglio en contacto con los electrodos y perfusión inmediatamente con oxigenada medio de Ames. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: matriz micropozo-microcanal perforado. (A) fotografía de matriz micropozo-microcanal perforada utilizada en el protocolo. La retina se coloca en la matriz de electrodos (indicada por el rectángulo rojo, que se muestra en mayor detalle en B) dentro de la cámara del pMEA para permitir la perfusión continua con oxigenada medio de Ames. (B) una microfotografía de la matriz de electrodos se ilustra la disposición de las perforaciones entre electrodos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Nota: Ver figura 4 y figura 5
- Usando una linterna de LED rojo portátil para proporcionar iluminación de rojo tenue, eutanasia animal por asfixia de dióxido de carbono, seguido por dislocación cervical o cualquier otro método elegido, según protocolos IACUC.
- Enuclear ambos ojos con unas pinzas de #5 de una joyería y ojos enucleated en un plato de petri de 60 mm de diámetro con aproximadamente 3-4 mL de solución media de Ames fresca, oxigenada.
- Mientras que observa el ojo a través de un estereomicroscopio de disección con iluminadores superior e inferior con filtro rojo, hacer una pequeña incisión en la cara córnea con un bisturí o un par de tijeras afiladas.
- Corte de esta pequeña incisión al borde de la córnea luego ampliar el corte en una sección circunferencial alrededor de todo el filo de la córnea. Quitar la córnea ahora separada junto con la lente, humores acuosos y vítreos translúcidos.
- Mientras sostiene suavemente la ojera con un par de pinzas, cuidadosamente hacer dos pequeñas incisiones en los lados opuestos de la ojera. Utilice dos pares de pinzas para separar el cilindro en cada una de las incisiones y separar la retina de la esclera. Levante lentamente la retina entera de la esclera y ocular. Cortar el nervio óptico, si aún está conectado.
- Hacer cortes longitudinales en la retina para obtener la mitad o secciones del cuarto usando las tijeras y luego suavemente una sección de retina en una malla de nylon (100 μm diámetro de rosca con 350 μm de abertura) con el ganglio las células (lado cóncavo de la retina) de revestimiento de la malla.
- Colocar la malla y la retina sobre una matriz perforada micropozo-microcanal (pMEA) con las células del ganglio en contacto con la superficie del pMEA. Luego Coloque suavemente una red ponderada rebanada encima de la malla para sostener la retina en su lugar.
4. MEA y configuración de adquisición de datos
Figura 6: ruido niveles de pMEA. (A) representante de grabación de un subconjunto de electrodos pMEA exhibe alto nivel de ruido persistente. Este ruido es generalmente debido a la falta de contacto apropiado entre las almohadillas de contacto del pMEA y los pines del amplificador MEA como resultado de desgaste normal de la capa de poliimida perforada fina sobre el pMEA, especialmente en las almohadillas de contacto. La otra posible fuente de ruido suele ser solución se filtró en las almohadillas de contacto del pMEA amplificador. Ruido persistente debido a la pobre pin de contacto o se filtró la solución en el contacto de las almohadillas normalmente puede corregirse cambiando la posición del pMEA dentro del amplificador para obtener el mejor contacto y lavado y secado de las pastillas, respectivamente. Si el ruido no puede eliminarse limpiando o cambiando la posición del pMEA, el pMEA deba ser sustituido totalmente. (B) grabación representativo de niveles de ruido de un subconjunto de electrodos pMEA de un pMEA limpio con buen contacto entre el pMEA y amplificador. Por lo general, el nivel de ruido promedio es en ±16 μV. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Nota: Consulte la figura 6
- Tenue iluminación roja, coloque pMEA en amplificador MEA y cerrar pestillos de amplificador.
- Si las marcas de referencia no están ya presentes en el anillo de cámara del pMEA, grabe dos 'X'-en forma de marcas espacian aproximadamente 5 mm. en un área visible desde arriba con el microscopio montado soporte del auge.
- Posición de la salida de perfusión superior dentro del compartimiento del pMEA y encienda la válvula superior de la perfusión para lograr una tasa de perfusión de aproximadamente 3 mL por minuto. Posición de la boca de aspiración superior nivel de la solución deseada (~ 5 m m profundo) y asegúrese de que está trabajando.
- Abra el software de adquisición de datos en el equipo de adquisición de datos y haga clic en el botón de 'play' para empezar a recibir datos. Asegurar que todos los canales pMEA sin ruido y grabación de señales neuronales.
- Mirando una imagen digital directo del campo de visión de microscopio invertido en un monitor, observar la superficie inferior del pMEA evidencia que solución fluye a través de la placa inferior de la perfusión.
5. glutamato estímulo preparación
Figura 7: vidrio micropipeta y dispositivo de microfluidos multipuerto. (A) un soporte de la pipeta antes de insertar un dispositivo o una micropipeta. El electrodo de plata/cloruro de plata (50 μm de diámetro) está eléctricamente acoplado al adaptador en el extremo para interfaz con el patch clamp headstage. (B) una fotografía de la micropipeta de vidrio interconectado con el soporte de pipeta, mostrando la ubicación del puerto de presión utilizado para iniciar las inyecciones de neumático. (C) un dispositivo de microfluidos multipuerto personalizado (cm 1 cm 1 cm 0,134) unido a un elemento impreso en 3D y conectado con el titular de la pipeta a través de un tubo de acero inoxidable. El dispositivo, que fue fabricado en dos capas, tiene ocho funciones (diámetro 14 μm) en la capa inferior (340 μm de espesor) y ocho depósitos de la en-viruta (diámetro 1,6 mm) para el almacenamiento de glutamato en la capa superior (1 mm de espesor). Independientemente cada una de las ocho funciones en la capa inferior del dispositivo esté conectada a un reservorio de la en-viruta de la capa superior a través de un MCP en el plano, y cada depósito de la en-viruta a su vez está conectado a un puerto de presión del inyector de presión de 8 canales a través de un tubo flexible para permitir la actuación independiente de las funciones para inyecciones múltiples sitios con dibujos. (D) un primer plano del dispositivo multipuerto sostenido por pinzas antes de colocar el accesorio de interfaz de tubería mostrando la disposición de los ocho embalses direccionables en forma independiente de la en-viruta y entradas de tubería. (E) una microfotografía de la superficie inferior del dispositivo que muestra las funciones de ocho 14 μm de diámetro dispuestos en una configuración de 3 x 3 con 200 μm espaciado para alinear con los electrodos de la pMEA. Los ocho fuera de funciones se utilizan para sitios múltiples inyecciones, mientras que el puerto central fue utilizado estrictamente para la alineación durante la fabricación del dispositivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Nota: Consulte la figura 7.
- Preparar solución de glutamato mediante la mezcla de acciones de la glutamato solutionwith oxigenada Ames medio solución para obtener una muestra de 0,5 mL a una concentración de trabajo de 1 mM de glutamato.
- Introduzca con cuidado una micropipeta previamente tirado 10 μm de diámetro o la varilla de acero inoxidable conectados al dispositivo de microfluidos selectoras en un soporte de pipeta estándar que contiene un electrodo de alambre de plata/cloruro de plata de 50 μm de diámetro.
Nota: Si no hay detección de impedancia, puede omitirse el electrodo de alambre de plata/cloruro de plata. - El titular de la pipeta con la abrazadera del remiendo headstage de interfaz y conectar la conexión de luer del puerto de presión del soporte en el canal 1 el presión del sistema de inyección, si utilizando una micropipeta de vidrio pipeta o Conecte las conexiones de luer del puerto de presión de cada uno de los puertos de 8 inyección canales 1-8 el presión del sistema de inyección, si utiliza el dispositivo multipuerto.
- Manualmente encienda el sistema de inyección de presión y gire en canal 1 (o los canales 1-8, según sea el caso). Asegúrese de que el sistema se ventila a la atmósfera y la presión de inyección a 0,1 psi.
- Encienda el micromanipulador y calibrar presionando el botón de 'Calibrar' en el controlador manipulador. Coloque el instrumental quirúrgico para que la punta de la micropipeta (o la parte inferior del dispositivo, según sea el caso) es de aproximadamente 30 mm por encima del amplificador MEA.
- Llena un pequeño plato de petri con solución de glutamato (glutamato de 1 mM en el estándar medio de Ames) y colóquela debajo de las amalgamas dentales. Bajar la punta de micropipeta (o el dispositivo) en la solución y el relleno presionando el botón de 'Relleno' en el sistema de inyección de presión (presión de succión de -13 en H2O) hasta que haya unos 20 mm de solución visible en la micropipeta de vidrio o el tubo de dispositivo multipuerto.
- Si utiliza el dispositivo multipuerto, gire el canal 1 del inyector de presión fuera y repita el protocolo para los canales 2-8. Levantar la punta de la micropipeta o dispositivo de la solución, retire la placa de Petri y colocar el instrumental quirúrgico por encima de la cámara del pMEA.
- Usando un estereomicroscopio boom pedestal, alinee la punta de la micropipeta o las esquinas del dispositivo con las marcas de referencia grabadas en el anillo de cámara del pMEA. Almacenar la posición del manipulador en el software de control utilizando los botones 'Tienda referencia A' y 'Almacén de referencia B' (o simplemente tenga en cuenta las coordenadas de manipulador manualmente) para asignar el sistema de coordenadas del manipulador con los electrodos del pMEA.
- Mediante el software de control de manipulador, seleccione un electrodo del pMEA blanco con robusta actividad espontánea y haga clic en el botón 'Mover al canal' para alinear la micropipettewith de vidrio del electrodo de la blanco.
6. interfaz con Retina
- Si la medición de impedancia está disponible, encienda el amplificador de la abrazadera del remiendo e iniciar el software de visualización de la impedancia haciendo clic en el botón 'Start' para visualizar la impedancia del electrodo de plata/cloruro de plata en el soporte de pipeta. Observando las señales de impedancia en tiempo real, baje lentamente la micropipeta o dispositivo hasta que toque la superficie retiniana según lo indicado por un rápido aumento de la impedancia de la señal (ver figura 8). Guardar o tome nota de la posición de la superficie retiniana.
- Si medición de impedancia está disponible, detectar el contacto con la superficie retiniana mediante la observación visual, aunque esto será menos preciso. Baje la pipeta o el dispositivo hasta que visiblemente se entra en contacto con la superficie de la solución media de Ames en la cámara MEA.
- Entonces, mientras observa la parte superior de la retina con un microscopio invertido, baje lentamente la pipeta o el dispositivo hasta que la superficie de la retina se distorsiona visiblemente, que indica que se ha hecho contacto con la superficie retiniana. Guardar o tome nota de la posición de la superficie retiniana.
- Para la estimulación del subsuelo, baje la pipeta más 40 μm (para retinas S334ter-3) o 70 μm (para retinas de tipo salvaje).
- Realizar unas inyecciones de corta duración (10-30 ms) usando el sistema de inyección (0,1 psi) de presión para determinar si las células cerca de la punta de la micropipeta o funciones de dispositivo son receptivos a la estimulación de glutamato mediante la observación las señales neuronales con adquisición de datos software.
Nota: Las inyecciones de éxito elicite una inhibición punto visible tipo burst o espiga (véase figura 9). Si no se observa ninguna respuesta, vuelva a colocar la micropipeta o el dispositivo en un electrodo diferente.
Figura 8: medición de impedancia. (A) un esquema de la técnica de medición de impedancia. Usando el amplificador de abrazadera del remiendo, la impedancia de la micropipeta es supervisada continuamente como se baja lentamente hacia la superficie retiniana. Cuando la micropipeta está sobre la retina, la relativamente alta conductividad iónica del medio de Ames se traduce en una lectura de baja impedancia. Como la micropipeta hace contacto con la superficie retiniana, la conductividad iónica a través del alambre de plata/cloruro de plata se reduce, causando un rápido incremento en la impedancia medida. (B) un diagrama mostrando el cambio de impedancia registrado justo antes y después del contacto de la punta de la pipeta con la superficie retiniana. La impedancia medida es relativamente baja cuando la punta de la micropipeta se encuentra en solución justo antes del contacto (indicado por la región naranja de la izquierda). Una vez que se hace contacto (indicado por la flecha roja y la verde región de derecha), la impedancia aumenta rápidamente debido a la reducida conductividad iónica al entrar en contacto con el tejido retiniano. En la práctica, la superficie retiniana está registrada como la altura correspondiente al inicio de la subida escarpada de la impedancia medida (la ubicación de la punta de flecha roja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: grabaciones de electrodo de actividad neural durante visual, espontánea y glutamato inyección grabaciones. Grabaciones representativas (A) de nueve electrodos pMEA mostrando el paso de alto filtran datos del electrodo durante la estimulación visual de luz con un LED verde donde cada rectángulo muestra los datos neuronales de un único electrodo. Cada grabación electrodo muestra los datos recogidos en el primer segundo después de encender el LED verde (con puntas de flecha naranja en cada parcela de sincronización) con una escala común de voltaje que se muestra en los ejes de la izquierda. Picos se identificaron usando un voltaje de umbral de-18 μV (línea roja horizontal en cada parcela de electrodo) y están representados por trazos negros sobre los datos del electrodo verde. Estimulación visual causó una explosión de espigas (excitación) en todos los electrodos excepto la parte superior central uno, que poseyó una respuesta inhibitoria a la luz. (B) una parcela similar para los mismos electrodos que muestra la actividad neural espontánea sin estimulación visual o inyección. Aunque explosiones más pequeñas estaban presentes, los patrones de picos eran muy diferentes a las registradas en respuesta a la estimulación visual. (C) grabaciones representativas del mismo subconjunto de electrodos registran inmediatamente después de una inyección de glutamato en el electrodo central (tiempo indicado por las puntas de flecha naranja en cada parcela). El inyectado glutamato produce una ráfaga de espigas en el electrodo central que era muy similar a las explosiones de spike visualmente evocados. Todos los otros electrodos no fueron afectados por la inyección de glutamato, lo que demuestra la excelente resolución espacial de la técnica de estimulación química. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
7. iniciar grabación retiniana y el programa de estímulo
- Oriente la luz verde hacia la superficie de la retina. Comenzar a grabar con el software de adquisición de datos en el equipo de grabación dedicado escribiendo el nombre de archivo y haga clic en el botón "grabar".
- Una vez que ha comenzado la grabación, abrir el programa de control de estímulos y cargar el archivo de estímulos por defecto haciendo clic en el botón "Leer archivo de estímulo". A continuación, haga clic en el botón "Ejecutar archivo de estímulo" para iniciar el archivo estímulo consistente en el protocolo de adquisición de datos y estímulos que se describe en la nota de abajo.
Nota: los ensayos (i) 30 2 s ON y 2 s OFF campo completo flash (5 lm/m2 intensidad) utilizando el LED verde. (ii) 120 s de datos sin utilizar el LED verde para registrar la actividad espontánea de la retina por un plazo similar. (iii) 1 o más sistemas de inyecciones de glutamato que consta de 30 ensayos de inyecciones de glutamato a 0,1 psi con inyección de ms de 10-30 veces (aproximadamente 100-300 pL por inyección) y 3 s interpulse duraciones. En el caso de las inyecciones de múltiples sitios, seleccionar 2 o más puertos para inyectar al mismo tiempo.
Figura 10: histogramas de Peristimulus visual, espontánea, y glutamato respuestas. (A) representante peristimulus histogramas (binwidth de 30 ms) de los datos de punto de subconjunto de electrodos en la Figura 9A, promediado a través de 20 ensayos de estimulación visual de luz. Una escala común de tasa de aumento fue aplicada a todos los electrodos y se muestra en los ejes izquierdos. La línea negra en cada parcela de electrodo representa la tasa punto medio para los picos registrados durante el primer segundo después de encender el LED verde. Como puede verse, estimulación visual causó una respuesta transitoria spike excitatorio en todos los electrodos excepto el electrodo central superior, que tenía una respuesta inhibidora transitoria a la luz. (B) las respuestas de tasa medio punto espontáneo registran en los mismos electrodos sin ningún estímulo visual o químico. Sin estimulación, las tarifas de spike para cada electrodo son relativamente constantes. (C) las respuestas de tipo espiga promedio registran en los mismos electrodos en respuesta a una inyección de glutamato en una ubicación sobre el electrodo central. La respuesta sólo transitoria evidente es la respuesta excitatoria en el electrodo directamente en el sitio de inyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Este protocolo se puede utilizar para estimular químicamente la retina normal, tipo salvaje así como fotorreceptor degenerado retinas, a pesar de la importante remodelación celular causada por la pérdida de los fotorreceptores. Antes de comenzar los experimentos con cualquiera de los dos fotorreceptores degenerados o retinas de tipo salvaje, la necesidad de equipos (figura 1 y figura 2) de grabación y estimulación para ser preparado y pMEA (figura 5) deben ser limpiados para minimizar la ruido en cada canal de electrodo (figura 6). Aunque fotorreceptores degeneraron retinas son más delgados y por lo tanto más delicado que el tipo salvaje retinas, el mismo procedimiento de la disección (figura 4) se utiliza para ambos. Siguiente la disección, la retina se coloca cuidadosamente sobre el pMEA con la célula del ganglio hacia los electrodos y el pMEA asegurado dentro del amplificador MEA (Figura 3A), donde puede perfunde continuamente con medio fresco, oxigenada de Ames de tanto la parte superior (figura 3B) y lados inferiores (figura 3). Después de asegurarse de que la retina se ha estabilizado de trauma quirúrgico, una micropipeta de vidrio o un dispositivo multipuerto es montado en un soporte de pipeta (Figura 7A-E) y conectado con un headstage de la abrazadera del remiendo cuya posición es controlada por un eje de 3 instrumental quirúrgico de precisión. La microport(s) de la pipeta o el dispositivo debe entonces alineado con un electrodo de la blanco y cuidadosamente baja hasta que el contacto puede ser detectado mediante el método de impedancia se muestra en la figura 8 o visualmente confirmó a través de la microscopia. Una vez que los puertos de entrega de inyección se coloca en el lugar correcto en la superficie o subsuperficie de la retina, se puede iniciar el programa de estimulación.
Un conjunto representativo de las grabaciones de la actividad de los nervios en un subconjunto de los electrodos del pMEA se muestra en la figura 9 para visual (Figura 9A), espontáneo (figura 9B) y estímulos de forma exógena inyectado glutamato (figura 9). Exitosas estimulaciones visuales y químicos son generalmente observables como ráfagas de espigas leve o el cese temporal de clavar actividad, como puede verse en los ejemplos en la figura 9. Si las células cercanas son insensibles a la estimulación química, los datos resultantes de la espiga se ven similares a la conducta espontánea spiking. Después de extraer puntos RGC y organizándolos en los ensayos, las respuestas neuronales en cada electrodo pueden ser ilustradas mediante un histograma de tiempo de media peristimulus (PSTH) de la tasa de spiking, tales como se muestra en la figura 10, que corresponden a la materia prima datos del electrodo en la figura 9.
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Discussion
El método presentado aquí muestra un paradigma único de estimulación neural, en donde las neuronas retinianas son estimuladas químicamente inyectando productos químicos neurotransmisor natural en la superficie de la retina in vitro. Esta técnica de estimulación química ofrece varias ventajas sobre la técnica de estimulación eléctrica convencional, incluyendo la selectividad y especificidad focal de neuronas de destino. El Protocolo sobre detalles como pequeñas inyecciones neumática volumen de neurotransmisor glutamato entregan cerca neuronas retinianas blanco utilizando una micropipeta de vidrio de un puerto o un dispositivo de microfluidos multipuerto micro medida provocan fisiológicamente importantes respuestas RGC. Aunque este protocolo ha demostrado con sólo el glutamato, el protocolo sigue siendo útil para el estudio de la estimulación química de la retina con otros tipos de neurotransmisores. Por otra parte, si bien es preferible utilizar un pMEA para una grabación electrofisiológica32 como se describe en este protocolo, otros diseños MEA, incluyendo el tipo no perforada, podría utilizarse para lograr resultados similares como el pMEA. En los párrafos siguientes, se discute los pasos más críticos de nuestro protocolo, métodos para solucionar problemas comunes y las limitaciones y futuras aplicaciones de esta técnica de estimulación.
Para obtener el estímulo químico seguro y confiable, deben realizarse varios pasos críticos de este protocolo. Uno de los pasos críticos es la obtención de una exitosa preparación retina cuidadosamente extrayendo la retina y reducir al mínimo la cantidad de tiempo que se mantiene fuera medio oxigenado de Ames, es decir, cuando aplana la retina recién disecada en la cuadrícula de la malla antes de transferir en el pMEA perfundidos con medio de Ames. Disección inicial de la retina requiere herramientas de disección aguda y práctica ya que el ojo de la rata es relativamente pequeño. Además, la extracción de fotorreceptor degenerado retinas puede ser particularmente difícil ya que son más frágiles que las retinas de los normales ya frágiles y por lo tanto propensos a desgarro. El proceso de disección todo, desde enucleation inicial para colocar la retina en el pMEA debe lograrse lo antes posible evitar la muerte prematura de la célula por falta de oxígeno o de otros nutrientes. Trauma mecánico impartida a los tejidos durante la disección debe minimizarse evitando un corte o daño al tejido, como esto también puede conducir a respuestas neuronales antinaturales y muerte celular.
Después de colocar la retina en el pMEA, debe tenerse cuidado al iniciar perfusión superior e inferior y las líneas de succión, ya que este es un punto común de error del experimento. Todas las líneas de perfusión y la succión deben comprobar espacio libre antes de comenzar el experimento y examinadas periódicamente durante todo el experimento para asegurarse de que las burbujas de aire no impiden el flujo a través de las líneas. En particular, la formación de burbujas de aire dentro de la línea de perfusión inferior puede impedir completamente el flujo de perfusión debido a su menor diámetro y así provocar un prematuro final para el experimento por privar a la retina de oxígeno y nutrientes. Debido al peligro de las burbujas de aire, el protocolo anterior se lleva a cabo a temperatura ambiente en lugar de a la temperatura fisiológica más ideal para evitar la emisión de gases de oxígeno disuelto o dióxido de carbono de la solución media de Ames. Si las burbujas de aire ocluyen una de las líneas de perfusión durante un experimento, puede generalmente dispersar en burbujas más pequeñas, no oclusión golpeándolo ligeramente sobre la línea de perfusión.
Otro problema común relacionado con el sistema de perfusión es ajuste fino de la presión de succión de fondo que sostiene la retina firmemente en contacto con los electrodos pero sin daño. Si la presión de aspiración es demasiado alta, puede chupar pequeños trozos de la retina a través de las perforaciones de la pMEA y eventualmente conducen a la cesación de todas las respuestas neuronales. Por otro lado, si la presión es demasiado baja, la retina flotador lejos de los electrodos y por lo tanto interrumpir la grabación neural. Ajuste la presión de aspiración entre estos dos niveles extremos requiere práctica y se hace más fácil si el pMEA es utilizado sobre un microscopio invertido, que permite la observación cercana de las perforaciones de la pMEA. Mediante la observación de estas perforaciones mientras ajusta la succión, se puede encontrar el equilibrio que mantiene el contacto sin dañar la retina. Para minimizar la posibilidad de fotoblanqueo los fotorreceptores al estimular la retina de tipo salvaje, el iluminador de microscopio invertido debe filtrarse para que emita luz roja sólo y observaciones visuales deben completarse lo antes posible.
Después de asegurar las condiciones de perfusión adecuada, el próximo paso crítico es hacer referencia al dispositivo o la pipeta con un visible fijo punto o marcador en el pMEA para que los puertos de inyección pueden ser precisamente alineados con los electrodos de la pMEA. Por lo general, esto se logra a través de la triangulación en donde dos marcas de referencia colocadas sobre el borde de la recámara del pMEA grueso están alineadas con la punta de una micropipeta de vidrio o hitos en el dispositivo multipuerto por observación visual desde arriba usando la soporte del auge microscopio montado. Una alineación más fina de los puertos de inyección con electrodos de destino se logra entonces por inspección visual a través del microscopio invertido. Una vez alineados correctamente, se debe tener cuidado al acercarse a la retina con una pipeta o un dispositivo de microfluidos, puesto que cualquier variación de manipulador o deriva podría aplastar a la retina o dañar el pMEA. La mejor manera de evitar que se dañe accidentalmente la retina debe monitorear continuamente la impedancia del electrodo pipeta para precisamente detectar contacto con la superficie retiniana. Medición de impedancia puede utilizarse también para comprobar rápidamente si la punta de la micropipeta insertada en subsuperficie de la retina está bloqueada, que se indica por una impedancia anormalmente alta (típicamente en la gama gigaohm). Si bloquea, la punta de la micropipeta puede eliminarse generalmente, iniciando un pulso de alta presión con la punta colocada lejos de la retina para evitar daños involuntarios. En casos raros, pipetas bloqueadas deba sustituirse enteramente si los pulsos de alta presión despejar la obstrucción. Un valor de impedancia alta o anormales también puede grabarse cuando el electrodo de referencia no correctamente la interfaz entre la solución en la cámara del pMEA y el amplificador de abrazadera del remiendo.
Una vez colocado en una ubicación de destino, el volumen de la inyección de glutamato debe estar bien controlado por restricción de la presión, tiempo de inyección y la concentración de neurotransmisores para evitar la sobreestimulación de las neuronas, que se ha demostrado para causar daños excitotóxicos.Detallan de los parámetros de la inyección de glutamato en este protocolo representa un régimen que está muy por debajo del umbral conocido para causar glutamato excitotoxicidad33 pero, al tratar de este protocolo con otros tipos de neurotransmisores, correspondiente niveles de umbral para los efectos de la excitotoxicidad deben considerarse para la estimulación del segura. También, la presión de inyección de 0,1 psi en el protocolo anterior fue derivada de la presión más baja posible ajuste disponible en el inyector de presión 8 canales utilizado en este estudio, pero ha producido consistentemente resultados exitosos. Por lo tanto, 0,1 psi para las inyecciones de neurotransmisor es sólo sugerente, pero no restrictivas, para lograr éxito estímulos químicos. Si presiones menores de actuación son posibles con un inyector de presión diferente, se pueden realizar inyecciones a presiones inferiores a 0,1 psi.
Una limitación de este protocolo que en vitro wholemount retiniana preparados es la ventana de experimental a corto plazo, que es limitada a duraciones de 8 h o menos, incluso con extremo cuidado a lo largo de todo el experimento. Esta ventana de tiempo experimental limitado no permite el examen de los efectos a largo plazo de la estimulación química como excitotoxicidad. Otra limitación de este protocolo específico es la opción para grabar a temperatura ambiente a diferencia de la temperatura fisiológica, que probablemente afecta tanto la visual y químicamente-evocados spike respuestas tasa, ya que estudios anteriores han demostrado que bajo registrar temperaturas puede alterar la tasa de spiking, latencia de respuesta y tasa de captación de glutamato entre varias otras propiedades34,35,36,37,38. Esta limitación puede evitarse usando un MEA no perforada con una placa de calefacción inferior, a diferencia del pMEA, que utiliza una placa de perfusión inferior diseñado especialmente sin una placa caliente o un debubbler térmico eficaz para la parte superior e inferior perfusión.
Por último, la preparación en vitro es limitada por la necesidad de activa perfusión de medio Ames oxigenada para mantener la salud de la retina. Las corrientes de líquido causadas por el sistema de perfusión son típicamente mucho más rápidas que los mecanismos naturales de la perfusión encontraron en el ojo en vivo39y podrían interferir con inyecciones químicas dibujando neurotransmisores inyectados de la retina. Las inyecciones de superficie, como las realizadas con el dispositivo multipuerto, probablemente sería más susceptibles a la interferencia actual de perfusión comparado con inyecciones de subsuelo aunque la presencia de perfusión de la parte inferior del pMEA podría causar un efecto similar a lo largo de la retina entera. Por este motivo, productos químicos de glutamato en el protocolo actual fueron entregados con presión neumática, pero la presión de inyección necesaria para lograr la estimulación exitosa en vivo puede ser substancialmente más baja que la utilizada para en vitro estudios.
Estimulación química, que trata de activar las neuronas con los estímulos de neurotransmisor más naturales, ofrece una alternativa efectiva a la estimulación eléctrica convencional pero aún no ha sido seriamente explorada. Como consecuencia, existe poca literatura que describe el protocolo o las mejores prácticas para alcanzar la estimulación química subretinal confiable de neuronas retinianas. Recientes estudios28 usando este protocolo han demostrado que subretinal estimulación química de las neuronas retinianas fiable puede provocar respuestas leve con resoluciones espaciales comparables o mejores que la estimulación eléctrica de la retina y hay pruebas que subretinally aplicación glutamato exógeno pueden estimular las células bipolares directamente, permitiendo que este método de tomar ventaja de los circuitos de procesamiento visual inherente de la retina y, presumiblemente, evocando las percepciones más similares a la luz natural estimulación.
Otros estudios son requeridos para validar estos resultados en modelo murino no sistemas e investigar cuestiones no abordadas en los estudios previos, incluyendo los efectos a largo plazo y aspectos prácticos relacionados con la ejecución en vivo de esta estrategia. Por lo tanto, las orientaciones futuras de este enfoque claramente mentira en la traducción de este concepto en vivo modelos animales mediante el desarrollo de tecnología adecuada para lograr la entrega de productos químicos a largo plazo y la estimulación con un microfluídicos implantable de luz alimentado dispositivo que sirve como un reemplazo para la capa de fotorreceptores degenerados. Como un paradigma de estimulación relativamente escasamente, las aplicaciones más amplio de estimulación química todavía tienen que descubrir, pero puesto que la retina es una parte del sistema nervioso central40, potencialmente podría aplicar esta estrategia de estimulación en otros contextos de estimulación neural, como el tratamiento de la médula espinal, cortical o trastornos neuromusculares con diferentes neurotransmisores. Además, el protocolo presentado podría adoptarse más generalmente para estudios que investigaron los efectos de la entrega vigilada de droga u otros productos químicos en los tejidos neuronales con fina resolución espaciotemporal en un entorno en vitro .
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo presentado en el documento fue apoyado por la National Science Foundation, nuevas fronteras en la investigación y el programa de innovación (NSF-EFRI) número 0938072 de la concesión. El contenido de este documento es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la NSF. Los autores también desean agradecer al Dr. Samsoon Inayat su trabajo diseñando y probando la configuración experimental inicial para la estimulación química y Sr. Ashwin Raghunathan por su trabajo de diseño, fabricación y evaluación del dispositivo de microfluidos multipuerto utilizado en Este estudio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| 8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| 60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
| Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
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