Summary
Este protocolo descreve um método novo para investigar uma forma de neuroestimulação química do wholemount rato as retinas em vitro com o neurotransmissor glutamato. Neuroestimulação química é uma alternativa promissora para a neuroestimulação elétrica convencional de neurônios da retina no tratamento de cegueira irreversível, causada por doenças degenerativas fotoreceptor.
Abstract
Doenças degenerativas fotorreceptoras causam cegueira irreparável através da perda progressiva de células fotorreceptoras na retina. Próteses da retina são um tratamento emergente para fotorreceptoras doenças degenerativas que visam restaurar a visão, artificialmente estimulando os neurônios da retina sobreviventes na esperança de suscitar compreensível percepção visual em pacientes. Atual da retina próteses têm demonstrado sucesso em restaurar a visão limitada aos pacientes usando uma matriz de eletrodos para eletricamente estimular a retina, mas enfrentam barreiras físicas substanciais na restauração de alta acuidade, visão natural aos pacientes. Neuroestimulação química usando neurotransmissores nativos é uma estimulação alternativa elétrica biomimetic e poderia contornar as limitações fundamentais associadas com as próteses da retina usando neuroestimulação elétrica. Especificamente, neuroestimulação química tem o potencial de restaurar a visão mais natural com comparáveis ou melhores acuidades visual aos pacientes através da injeção de quantidades muito pequenas de neurotransmissores, os mesmos agentes naturais de comunicação utilizados pela retina sinapses químicas, a resolução muito melhor do que a corrente elétricas próteses. No entanto, como um paradigma de estimulação relativamente inexplorada, não há nenhum protocolo estabelecido para alcançar a estimulação química da retina em vitro. O objetivo deste trabalho é fornecer um quadro pormenorizado para realizar estimulação química da retina para os investigadores que desejem estudar o potencial de neuromodulação química da retina ou similar de tecidos neurais em vitro. Neste trabalho, descrevemos a instalação experimental e metodologia para suscitar ganglionares da retina célula (RGC) pico respostas para visual luz respostas semelhantes no tipo selvagem e wholemount fotorreceptoras-degenerou as retinas de rato pela injeção controlada de volumes de o glutamato neurotransmissor no espaço subretinal utilizando Micropipetas de vidro e um dispositivo microfluidic multiport personalizado. Esta metodologia e protocolo são gerais o suficiente para ser adaptado para neuromodulação usando outros neurotransmissores ou até mesmo outros tecidos neurais.
Introduction
Fotoreceptor doenças degenerativas, como retinite pigmentosa e degeneração macular relacionada à idade, são principais causas herdáveis da perda da visão e são atualmente incurável1,2. Embora essas doenças surgem de uma variedade de mutações genéticas específicas, doenças degenerativas fotorreceptoras caracterizam-se como um grupo pela perda progressiva das células fotoreceptoras na retina, que eventualmente causa cegueira. A perda de gatilhos de fotorreceptores generalizadas de remodelação em toda a retina, mas sobrevivendo os neurônios da retina, incluindo as células bipolares e RGCs, permanecem intactas e relativamente funcional mesmo em estágios avançados de degeneração de fotorreceptoras3 ,4,5,6,7.
Os mecanismos e patologias destas doenças foram bem caracterizadas3,4,5,6,7 , mas ainda não se alcançou um tratamento eficaz. Nas últimas três décadas, pesquisadores em todo o mundo têm investigado uma variedade de tratamentos terapêuticos para restaurar a visão para as pessoas afectadas com doenças degenerativas fotoreceptor, incluindo gene terapia8, tratamento de células-tronco9, transplante de retina10e estimulação artificial11,12 dos neurônios sobreviventes da retina. Destes, o mais clìnica disponível é próteses da retina, que são dispositivos de neuroestimulação artificial que tradicionalmente têm utilizado uma matriz de eletrodos para estimular eletricamente a células bipolares ou RGCs em padrões específicos, com o objetivo de Criando percepções visuais artificiais em pacientes11. Próteses elétrica da geração atual, como o Argus II13 e dispositivos de14 alfa-IMS, alcançaram aprovação clínica e estudos preliminares indicaram que pode melhorar a qualidade de vida para pacientes restaurando um medida da visão usando epiretinal (frente da retina) e apresentam (parte traseira do retina) implantados dispositivos15,16. Grupos de pesquisa ao redor do mundo estão trabalhando em próteses da retina, além dos sucessos desses dispositivos da primeira geração17,18,19,20 a avançar mas têm enfrentado dificuldades de projetar uma prótese elétrica capaz de restaurar a visão de alta acuidade, abaixo do nível de cegueira legal aos pacientes. Estudos recentes têm mostrado que alcançar maior resolução espacial que isso habilitado pela atual geração elétrica com base em próteses é um desafio por causa do limite de injeção de carga, que exige o uso de grandes eletrodos para estimular com segurança neurônios da retina ao custo de resolução espacial, ou seja, a acuidade visual11,21. Além disso, a estimulação elétrica é mais limitado porque normalmente estimula todas as células vizinhas e portanto provoca percepções antinaturais e confusas em pacientes, em grande parte porque é um paradigma de estimulação inerentemente antinatural21. No entanto, os sucessos iniciais de estimulação elétrica demonstraram que a neuroestimulação artificial pode ser um tratamento eficaz para doenças degenerativas fotoreceptor. Isto leva-na hipótese de que um tratamento mais eficaz pode ser viável, estimulando a retina com produtos químicos de neurotransmissor, os agentes naturais de comunicação em sinapses químicas. O objetivo do método apresentado neste artigo é explorar a viabilidade terapêutica de estimulação química, que procura imitar o sistema natural de comunicação sináptica entre os neurônios da retina, como uma estimulação alternativa elétrica biomimetic para uma prótese de retina.
Tradução do conceito de estimulação química terapêutica para uma prótese de retina química baseia-se quimicamente, ativando os neurônios da retina do alvo com pequenas quantidades de neurotransmissores nativos, como o glutamato, lançado através de um microfluídicos dispositivo composto por uma grande variedade de microports em resposta a estímulos visuais. Desta forma, uma prótese retiniana química seria essencialmente uma camada de fotorreceptoras artificial biomimético que traduz fótons naturalmente atingindo a retina para sinais químicos. Uma vez que estes sinais químicos usam os mesmos neurotransmissores utilizados na sinalização da retina normal e estimulam os neurônios da retina sobreviventes de um degenerado retina através da vias sinápticas mesmas usado por caminhos de visão normal, o visual resultante percepção conseguida através de uma prótese de retina química poderia ser mais natural e compreensível em relação a um evocado através de uma prótese elétrica. Além disso, desde que o microports através do qual os neurotransmissores são liberados podem ser feitas extremamente pequeno e matriz de alta densidade, ao contrário dos eléctrodos, um potencial químico protético pode ser capaz de atingir mais estímulo focal e maior espacial resolução de uma prótese elétrica. Assim, baseando-se estas vantagens potenciais, uma prótese de retina química oferece uma alternativa altamente promissora para próteses elétricas.
Estimulação química da retina, no entanto, tem sido relativamente pouco explorada até recentemente. Enquanto a estimulação elétrica da retina foi bem caracterizada ao longo de décadas de trabalho através de de22, em vitro23, na vivo23,24e estudos clínicos13 ,14, estudos sobre estimulação química têm sido limitados exclusivamente para alguns em vitro obras25,26,,27,28. Iezzi e Finlayson26 e Andre et al 27 demonstrou epiretinal estimulação química da retina em vitro usando um único eletrodo e uma matriz multielectrode (MEA), respectivamente, para gravar as respostas de glutamato evocado dos neurônios da retina. Mais recentemente, Rountree et al 28 demonstraram a estimulação diferencial das vias e desligar da retina usando glutamato de lado subretinal e um MEA para gravar as respostas neuronais de diversos sites na retina.Embora essas obras estabeleceram preliminarmente a viabilidade da estimulação química, mais estudos são essenciais para investigar muitos aspectos dessa abordagem além daqueles abordados até agora25,26,27 , 28e ajustar os parâmetros de estimulação terapêutica em modelos animais, tanto in vitro e in vivo antes de traduzir este conceito para uma prótese de retina química, como discutido acima. No entanto, atualmente não há nenhuma metodologia estabelecida para realizar estimulação química da retina na literatura e os métodos utilizados em obras anteriores não foram descritos em detalhes como seria essencial para estudos replicative. Portanto, a justificativa para este papel de métodos é fornecer uma estrutura bem definida para a realização em vitro química estimulação da retina para os investigadores interessados ou replicar nossos estudos anteriores27, 28 ou avançando ainda mais este conceito emergente de neuroestimulação química.
Aqui vamos demonstrar um método para a condução em vitro química estimulação dos neurônios da retina em wholemount retinas de ratos do selvagem-tipo e um modelo de rato degenerado fotorreceptoras que imita pròxima a progressão do fotoreceptor degenerativa doenças em seres humanos. A lógica por trás do desenvolvimento deste método de estimulação em modelos em vitro é avaliar a terapêutica varia de vários parâmetros de estimulação e estudar as características de resposta neural que seriam impossível ou difícil de observar no em vivo modelos, especialmente durante os estudos iniciais focado em avaliar a viabilidade desta abordagem. Neste procedimento, mostramos o único site e simultâneos multissite estímulos químicos da retina entregando pequenas quantidades de glutamato 1 mM perto de neurônios da retina de destino via Micropipetas de vidro de porta única comercialmente disponível e um costume dispositivo de multi-porta microfluidic microusinado, respectivamente. Enquanto estímulos tanto sites multi e single-site realizar o objectivo básico de investigar a viabilidade terapêutica de neuromodulação química, cada um serve a um propósito distinto com uma vantagem única. A estimulação de site único, que pode ser realizada com Micropipetas de vidro pré-puxada comercialmente disponível, pode ser usada para injetar produtos químicos diretamente no subsolo da retina em um único local e serve para investigar se observável RGC spike taxa respostas que são semelhantes às respostas luz visualmente evocadas podem ser eliciadas focally sob o local da injeção. Por outro lado, estimulação de vários local, que requer um dispositivo microfluidic multiport especialmente fabricados, pode ser usada para injetar produtos químicos espacialmente em vários sites sobre a superfície da retina e serve para investigar como glutamato-evocada RCG padrões de resposta correspondem os padrões de injeção de glutamato em estudos de estimulação padrão.
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Protocol
Todos os animais de experimentos foram conduzidos em conformidade com as directrizes delineadas pelo guia do Conselho Nacional de pesquisa para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Protocolos de tratamento e eutanásia animais foram revistos e aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Illinois em Chicago e institucional Cuidado Animal.
1. animais modelos
- Ratos de Long-Evans do selvagem-tipo
- Adquirir um rato de longa Evans Hooded selvagem-tipo 24-32 dias de idade de ambos os sexos gerado com um ritmo dia/noite do padrão 12 h.
- Escuro adaptar o rato, colocando-o em uma sala completamente escura durante 1 h antes de começar o experimento.
- S334ter-3 ratos
- Abusa albino transgénicos homozigotos S334ter-3 rato (ambos os sexos), expressando a duas cópias do gene mutante rodopsina, com um rato de Long-Evans pigmentado do selvagem-tipo para produzir ratos de S334ter-3 heterozigotos pigmentados que apresentam degeneração fotorreceptoras semelhantes na progressão para humano retinite pigmentosa29,30.
- Criar descendentes heterozigotos com ritmo dia/noite de 12h padrão e usar ratos de ambos os sexos para experiências das seguintes idades correspondentes às seguintes etapas de degeneração fotoreceptoras: degenerescência precoce: 14-20 dias de idade; Degenerescência do meio: 21-27 dias de idade; Degenerescência tarde: 28-35 dias de idade; Completamente cego: > 50 dias de idade.
- Escuro adaptar o rato, colocando-o em uma sala completamente escura durante 1 h antes de começar o experimento.
2. preparação da solução média Ames e sistema de perfusão
Figura 1: esquema de instalação experimental. Esquema da instalação experimental para a estimulação química utilizando uma micropipeta de vidro (A) e um dispositivo personalizado microfluidic multiport (B). A retina é colocada em um pMEA e continuamente perfundida com solução de médio de Ames do fresca, oxigenada da parte superior e inferior através da pMEA perfurações. Sinais de resposta neural captados pelos eléctrodos do pMEA são alimentados através do amplificador MEA em um computador de aquisição de dados. Estimulação visual e química são realizadas usando um LED verde e o injetor de pressão de 8 canais, respectivamente, e ambos os estímulos são acionados por um computador dedicado estímulo, que também é usado para posicionar a pipeta através de uma precisão de 3 eixos micromanipulador. Um microscópio invertido é usado para observar a retina durante um experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: configuração Experimental. (A) fotografia da instalação experimental completa mostrando as posições relativas de todos os componentes. O sistema de amplificador MEA é colocado em cima de um microscópio invertido, que é usado para inspecionar visualmente a retina e a imagem digitalmente a interface de dispositivo-retina através da câmera de alta velocidade conectada durante o experimento. Perfusão de superior e inferior são controlados independentemente através de um sistema de perfusão de solenoide controlada. Injeção, controle de posição e medidas de impedância são realizadas usando um injetor de pressão, micromanipulador e amplificador de braçadeira do remendo (laranja caixa; mostrado em mais detalhes em B), respectivamente. A micropipeta ou o dispositivo é inserido em um headstage de braçadeira do remendo para medições de impedância e montado sobre um pórtico (indicado pela caixa verde; mostrado em mais detalhes em C) para facilitar o posicionamento usando um micromanipulador. (B) um close-up dos instrumentos de medição e controle utilizado no experimento: o injetor de pressão de 8 canais, sistema de controle de micromanipulador, amplificador de braçadeira do remendo para medição de impedância e o navio de sucção para eliminação de perfusão. (C) um close-up do pórtico do sistema de injeção mostrando um dispositivo multiporta interfaceado com o titular da pipeta, headstage de braçadeira do remendo e micromanipulador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: configuração de perfusão. (A) fotografia do topo do amplificador MEA mostrando a localização da perfusão superior e sucção, bem como o LED verde usado para estimulação visual de luz. (B) um close-up da câmara de perfusão pMEA ilustrando as localizações precisas da perfusão superior e sucção, o pMEA e o eletrodo de referência utilizado para a medição de impedância. (C) uma Fotomicrografia da perfusão da placa de base. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nota: Ver Figura 1e Figura 2 Figura 3
- Meça 900 mL de água desionizada, à temperatura ambiente (~ 21 ° C) e coloque no recipiente de 1 L.
- Perfundir a água com 100% de CO2 usando um mecanismo de propagação.
- Adicione 8,8 g de médio e Ames em pó no recipiente de 1 L de água.
- Lave o recipiente médio de Ames com alguns mL de água desionizada para remover todos os vestígios do meio em pó Ames e adicionar ao recipiente de 1 L.
- Adicione 25,3 mL de solução de bicarbonato de sódio (7,5% w/v.31) a recipiente de 1 L.
- Adicione a água adicional para trazer a solução para um volume final de 1 L.
- Continue perfusing a água com CO2 por aproximadamente 5 min.
- Pare de perfusão de CO2 e começar perfusing solução com uma mistura de gás de grau médico de 95% O2 e 5% de CO2 pelo menos 30 min ou até que o pH estabiliza em 7,4.
Nota: Para efeitos do presente protocolo, o meio de Ames é mantido à temperatura ambiente (~ 21 ° C) durante todo o experimento para impedir CO2 ou O2 de gases, que pode obstruir as linhas de perfusão com bolhas de ar. - Limpar os tubos de perfusão inferior e superior de enchimento com etanol a 70% e em seguida, lave as duas linhas 3 vezes com água desionizada. Preencha a linha de fundo com água deionizada e o top de linha com ar.
3. Wholemount da retina preparação
Figura 4: preparação de dissecção e wholemount da retina. (A) fotografia de uma ocular intacta tirada de um animal fotorreceptoras-degenerou. (B) Fotomicrografia da retina com cortes longitudinais para achatar-se. (C) após o achatamento da retina, é colocada uma grade de malha com o lado de fotoreceptor, entrar em contato com a malha e achatado no ar (fora do meio de perfusão) para garantir que estão sem dobras ou bordas onduladas. (D) a malha e a retina são rapidamente transferidos para o pMEA com o lado de células ganglionares contatando os eléctrodos e imediatamente perfundidos com meio de Ames oxigenado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: matriz perfurada de multielectrode. (A) fotografia da matriz perfurada multielectrode usada no protocolo. A retina é colocada na matriz de eletrodo (indicada pelo retângulo vermelho, que é mostrado em maior detalhe em B) dentro da câmara de pMEA para permitir que a perfusão contínua com média de Ames oxigenada. (B) uma Fotomicrografia da matriz eletrodo próprio ilustrando o arranjo de perfurações entre eletrodos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nota: Ver Figura 4 e Figura 5
- Usando uma lanterna de LED vermelha portátil para fornecer a iluminação vermelha ofuscante, eutanásia animal através de asfixia de dióxido de carbono, seguida por deslocamento cervical ou outro método de escolha, de acordo com protocolos IACUC.
- Enucleate ambos os olhos usando fórceps de um joalheiro #5 e coloque os olhos sem núcleo em um prato de petri 60 mm de diâmetro com cerca de 3-4 mL de solução média Ames fresca e oxigenada.
- Enquanto observar o olho através de um estereomicroscópio dissecação com iluminadores superior e inferior coberto com tela de filtro vermelho, faça uma pequena incisão na córnea cara usando um bisturi ou tesoura afiada.
- Corte desta pequena incisão a borda da córnea, em seguida, estender o corte em uma seção circunferencial ao redor da borda inteira da córnea. Remova a córnea agora destacada junto com a lente, translúcidos humores aquosos e vítreos.
- Enquanto segura suavemente a viseira com um par de pinças, cuidadosamente fazer duas pequenas incisões em lados opostos da viseira. Em seguida, use dois pares de pinças suavemente separe a viseira em cada uma das incisões e separar a retina da esclera. Lentamente, levante a retina inteira da esclera e viseira. Corte o nervo óptico, se continua preso.
- Fazer cortes longitudinais na retina para obter metade ou trimestre seções usando a tesoura e em seguida, espalhar suavemente uma seção da retina em uma malha de nylon (100 µm rosca de diâmetro com 350 µm abertura) com o revestimento de (lado côncavo da retina) de células ganglionares longe da malha.
- Coloque a malha e a retina para uma matriz de multielectrode perfurada (pMEA) com as células ganglionares em contacto com a superfície do pMEA. Em seguida, coloque delicadamente uma grade ponderada fatia em cima da malha para manter a retina no lugar.
4. MEA e instalação de aquisição de dados
Figura 6: ruído níveis de pMEA. (A) gravação representativa de um subconjunto dos eletrodos pMEA exibindo alto ruído persistente. Este ruído é geralmente devido à falta de contato adequado entre as almofadas de contato pMEA e os pinos do amplificador como resultado do desgaste normal da camada fina perfurada poliimida MEA sobre o pMEA, especialmente para as almofadas de contato. A outra possível fonte de ruído é tipicamente solução vazada para as almofadas de contato pMEA amplificador. Ruído persistente devido à pobre pin contato e/ou vazou solução no contato de almofadas geralmente podem ser corrigidas por mudando a posição do pMEA dentro do amplificador para obter melhor contato e limpeza e secagem as almofadas, respectivamente. Se o ruído não pode ser eliminado por limpeza ou mudando a posição do pMEA, o pMEA pode precisar ser substituído inteiramente. (B) gravação representativa dos níveis de ruído de um subconjunto de pMEA eletrodos de uma pMEA limpo com bom contacto entre o pMEA e o amplificador. Normalmente, o nível médio de ruído está dentro ±16 µV. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nota: Consulte a Figura 6
- Sob a fraca iluminação vermelha, coloque pMEA no amplificador MEA e feche as travas do amplificador.
- Se marcas de referência já não estão presentes no anel de câmara pMEA, etch dois 'X'-marcas em forma de espaçados aproximadamente 5mm separado numa área facilmente visível de cima com o microscópio de bum-estande montado.
- A saída de perfusão superior dentro da câmara de pMEA e rode-a na válvula de perfusão superior para atingir uma taxa de perfusão de aproximadamente 3 mL por minuto. Posicione a topo de aspiração no nível desejado de perfusato (~ 5 mm de profundidade) e certifique-se de que está funcionando.
- Abra o software de aquisição de dados no computador de aquisição de dados e clique no botão 'play' para começar a receber dados. Certifique-se de que todos os canais do pMEA são livre de ruído e gravação de sinais neurais.
- Olhando para uma imagem digital ao vivo do campo de visão do microscópio invertido em um monitor, observe a superfície inferior do pMEA para provas de que a solução está fluindo através da placa de perfusão de fundo.
5. preparação de estimulação de glutamato
Figura 7: vidro micropipeta e dispositivo microfluidic multiporta. (A) um titular de pipeta antes de inserir uma micropipeta ou dispositivo. O eletrodo de prata/cloreto de prata (50 µm de diâmetro) é eletricamente acoplado ao adaptador na extremidade para interface com o headstage de braçadeira do remendo. (B) uma fotografia a micropipeta de vidro interfaceado com o titular da pipeta mostrando a localização da porta de pressão utilizada para iniciar injeções pneumáticas. (C) um dispositivo personalizado microfluidic multiport (1 cm 1 cm cm 0,134) anexado a um elemento de fixação 3D-impresso personalizado e interagi com o titular da pipeta através de um tubo de aço inoxidável. O dispositivo, que foi fabricado em duas camadas, tem oito microports (µm de diâmetro 14) na camada inferior (340 µm de espessura) e oito reservatórios em-microplaqueta (diâmetro 1,6 mm) para armazenar o glutamato na camada superior (1 mm de espessura). Cada um dos oito microports na camada inferior do dispositivo independente está ligado a um reservatório no chip na camada superior através de um microchannel no plano, e cada reservatório no chip por sua vez é conectado a uma porta de pressão do injector pressão de 8 canais através de um tubo flexível para permitir a atuação independente do microports para estampados injeções em vários locais. (D) um close-up do dispositivo multiporta realizado por uma pinça antes de anexar a fixação de interface tubo mostrando o arranjo das oito reservatórios de endereçamento independente em-microplaqueta e entradas de tubulação. (E) uma Fotomicrografia da superfície inferior do dispositivo mostrando o microports de 8 a 14 µm de diâmetro dispostos em uma configuração de 3 x 3 com espaçamento de 200 µm para alinhar com os eléctrodos do pMEA. Os oito fora microports são utilizados para injeções em vários locais, enquanto o porto central foi usado estritamente para o alinhamento durante a fabricação do dispositivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Nota: Consulte a Figura 7.
- Prepare a solução de glutamato misturando estoque glutamato solutionwith oxigenado Ames média solução para obter uma amostra de 0,5 mL em uma concentração de trabalho de glutamato de 1 mM.
- Insira cuidadosamente uma micropipeta pre-puxado 10 µm de diâmetro ou a haste de aço inoxidável ligado ao dispositivo microfluidic multiport em um suporte padrão pipeta contendo um eletrodo de fio de prata/cloreto de prata de 50 µm de diâmetro.
Nota: Se a detecção de impedância não é disponível, o eletrodo de fio de prata/cloreto de prata pode ser omitido. - O titular de uma pipeta com o remendo-braçadeira headstage da interface e conexão a conexão de luer do porto de pressão do titular da pipeta para o canal 1 do sistema de injeção de pressão, se utilizando uma micropipeta de vidro ou as conexões de luer do porto de pressão de cada um dos os portos de 8 injeção com canais 1-8 do sistema de injeção de pressão, se usando o dispositivo multiporta.
- Manualmente, ligue o sistema de injeção de pressão e ligue o canal 1 (ou canais 1-8, conforme o caso). Certifique-se que o sistema é exalado para a atmosfera e ajustar a pressão de injeção para 0,1 libras por polegada quadrada.
- Ligue o micromanipulador e calibrá-lo pressionando o botão 'Calibrar' no controlador de manipulador. Posicione o micromanipulador de modo que a ponta da micropipeta (ou parte inferior do dispositivo, conforme o caso) é de aproximadamente 30 mm acima do amplificador MEA.
- Encher um pequeno prato de petri com solução de glutamato (glutamato de 1 mM no padrão médio de Ames) e coloque-o debaixo do micromanipulador. Baixar micropipeta dica (ou dispositivo) para a solução e o preenchimento, pressionando o botão 'Preenchimento' no sistema de injeção de pressão (pressão de sucção de-13 em H2O) até há cerca de 20 mm de solução visível na micropipeta de vidro ou o tubulação do dispositivo multiporta.
- Se utilizar o dispositivo multiporta, mude o canal 1 do injector pressão fora e repita o protocolo para canais 2-8. Levante a ponta da micropipeta ou dispositivo fora da solução, retire a placa de Petri e posicionar o micromanipulador acima da câmara de pMEA.
- Usando um estereomicroscópio bum-fixado, alinhe a ponta da micropipeta ou os cantos do dispositivo com as marcas de referência gravadas no anel de câmara do pMEA. Armazenar as posições de manipulador para o software de controle usando os botões 'Loja referência A' e 'Loja referência B' (ou simplesmente observe as coordenadas manipulator manualmente) para mapear o sistema de coordenadas do manipulator com os eletrodos pMEA.
- Usando o software de controle de manipulador, selecione um eletrodo de pMEA alvo com atividade espontânea robusta e clique no botão 'Mover para o canal' para alinhar o micropipettewith de vidro do eletrodo de alvo.
6. interface com Retina
- Se a medição da impedância está disponível, ligue o amplificador de braçadeira do remendo e iniciar o software de visualização de impedância, clicando no botão 'Iniciar' para visualizar a impedância do eléctrodo prata/cloreto de prata dentro o titular de uma pipeta. Enquanto observa os sinais em tempo real de impedância, abaixe lentamente a micropipeta ou dispositivo até que entra em contato com a superfície da retina conforme indicado por um rápido aumento da impedância do sinal (ver Figura 8). Salvar ou anote a posição da superfície da retina.
- Se a medição de impedância é indisponível, detecta contato com a superfície da retina através da observação visual, embora este será menos preciso. Baixe o dispositivo ou pipeta até ele visivelmente entra em contato com a superfície superior da solução Ames média na câmara de MEA.
- Então, enquanto observa o topo da retina com um microscópio invertido, abaixe lentamente a pipeta ou dispositivo até que a superfície superior da retina é visivelmente distorcida, que indica que foi feito contato com a superfície da retina. Salvar ou anote a posição da superfície da retina.
- Para a estimulação de subsuperfície, abaixar a pipeta mais 40 µm (para as retinas S334ter-3) ou 70 µm (para as retinas do selvagem-tipo).
- Executar algumas injeções de curta duração (10-30 ms) usando o sistema de injeção (0,1 psi) de pressão para determinar se as células perto da ponta da micropipeta ou microports de dispositivo são receptivos à estimulação de glutamato, observando os sinais neurais com aquisição de dados software.
Nota: Injeções bem sucedidas irão provocar uma inibição de estourar ou pico de taxa do pico claramente visível (ver Figura 9). Se nenhuma resposta é observada, reposicione a micropipeta ou dispositivo em um eletrodo diferente.
Figura 8: medição de impedância. (A) um esquema da técnica de medição da impedância. Usando o amplificador de braçadeira do remendo, a impedância da micropipeta é continuamente monitorada como é levada lentamente em direção à superfície da retina. Quando a micropipeta é acima da retina, a relativamente alta condutividade iônica do meio de Ames resulta em uma leitura de baixa impedância. Como a micropipeta faz contato com a superfície da retina, a condutividade iônica através do fio de prata/cloreto de prata é reduzida, causando um aumento rápido na impedância medida. (B) uma parcela exibindo a mudança de impedância gravado antes e após o contato da ponta da pipeta com a superfície da retina. A impedância medida é relativamente baixa quando a ponta da micropipeta é na solução apenas antes do contato com (indicado pela região laranja à esquerda). Uma vez que o contato é feito (indicado pela seta vermelha e região verde à direita), a impedância aumenta rapidamente devido à reduzida condutividade iônica em caso de contacto com o tecido da retina. Na prática, a superfície da retina é registrada como a altura correspondente ao aparecimento da subida íngreme da impedância medida (a localização da ponta de seta vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: gravações de eletrodo de atividade neural durante visual, espontânea e gravações de injeção de glutamato. (A) gravações representativas de nove eletrodos pMEA, mostrando a passa-alta filtrado dados do eletrodo durante a estimulação visual de luz com um LED verde onde cada retângulo mostra os dados neurais de um único eletrodo. Cada gravação de eletrodo ilustra dados coletados no primeiro segundo depois de ligar o LED verde (mostrado com setas laranja em cada parcela de tempo) com uma escala comum de tensão mostrada em y a esquerda. Espigões foram identificados utilizando uma tensão de limiar de-18 µV (linha vermelha horizontal em cada parcela de eletrodo) e são representados por traços negros sobre os dados do eléctrodo verde. Estimulação visual causou uma explosão de picos (excitação) em todos os eletrodos exceto centro superior um, que possuía uma resposta inibitória à luz. (B) um enredo semelhante para os eletrodos mesmos mostrando espontânea atividade neural sem estimulação visual ou injeção. Apesar de explosões menores estavam presentes, os padrões de picos foram muito diferentes daqueles registrados em resposta a estímulos visuais. (C) gravações representativas do mesmo subconjunto de eletrodos gravada imediatamente após uma injeção de glutamato no eléctrodo central (indicado por setas laranja em cada parcela de tempo). O glutamato injetado provocou uma explosão de picos no eléctrodo central que era muito parecido com as descargas de pico visualmente evocados. Todos os outros eletrodos foram afetados através da injeção de glutamato, o que demonstra a resolução espacial bem a técnica de estimulação química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
7. Inicie a gravação da retina e do programa de estímulo
- Oriente o LED verde em direção a superfície superior da retina. Começa a gravação usando o software de aquisição de dados no computador dedicado gravação digitando o nome do arquivo e clicar no botão "gravar".
- Uma vez que a gravação foi iniciado, abra o programa de controle de estímulo e carregar o arquivo de estímulo padrão clicando no botão "Arquivo de estímulo de leitura". Em seguida, clique no botão "Executar arquivo de estímulo" para iniciar o arquivo padrão de estímulo, consistindo do protocolo de aquisição de dados e estímulos descrito na nota abaixo.
Nota: (i) 30 ensaios de 2 ON s e 2 s OFF campo completo flash (5 intensidade lm/m2 ) usando o LED verde. (ii) 120 s de dados sem usar o LED verde para registrar a atividade espontânea da retina ao longo de uma escala de tempo similar. (iii) 1 ou mais conjuntos de injeções de glutamato consistindo de 30 ensaios de injeções de glutamato em 0,1 psi com injeção de ms 10-30 vezes (cerca de 100-300 pL por injecção) e 3 s interpulse durações. No caso de injeções de vários locais, selecione 2 ou mais portas para injetar simultaneamente.
Figura 10: Peristimulus histogramas de visual, espontânea e glutamato respostas. (A) representante peristimulus histogramas (30 ms binwidth) os dados de pico do subconjunto de eletrodos na Figura 9A, média de 20 ensaios de estimulação visual de luz. Uma escala comum de taxa de pico foi aplicada a todos os eletrodos e é mostrada as esquerda y-Axes. A linha preta em cada parcela de eletrodo representa a taxa média de pico para todas as pontas, gravado durante o primeiro segundo depois de ligar o LED verde. Como pode ser visto, estimulação visual causado uma resposta da taxa de pico excitatórios transiente em todos os eletrodos exceto o elétrodo de centro superior, que teve uma resposta inibitória transitória à luz. (B) as respostas de taxa média de aumento espontâneo gravam nos eletrodos mesmos sem qualquer estímulo visual ou químico. Sem estimulação, as taxas de pico para cada eletrodo são relativamente constantes. (C) as respostas de taxa de pico média gravam no mesmos eletrodos em resposta a uma injeção de glutamato num local acima do eletrodo central. A resposta só transitória evidente é a resposta excitatória no eléctrodo directamente sob o local da injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Representative Results
Este protocolo pode ser usado para estimular quimicamente retina normal, tipo selvagem, bem como fotorreceptoras degenerou as retinas, apesar da substancial celular remodelação causada pela perda dos FOTORRECEPTORES. Antes de iniciar experimentos com qualquer fotorreceptoras degenerou ou as retinas do selvagem-tipo, a necessidade de equipamento (Figura 1 e Figura 2) gravação e estimulação para ser preparado e o pMEA (Figura 5) devem ser limpo para minimizar a ruído em cada canal do eletrodo (Figura 6). Embora fotorreceptoras degeneraram as retinas são mais finos e, portanto, mais delicados do que as retinas do selvagem-tipo, o mesmo procedimento de dissecação (Figura 4) é usado para ambos. Seguir de dissecação, a retina é cuidadosamente colocada o pMEA com a virada de células ganglionares os eléctrodos e o pMEA protegido dentro do amplificador MEA (Figura 3A), onde ele pode ser continuamente perfundido com meio fresco, oxigenado, Ames por parte superior (Figura 3B) e os lados da parte inferior (Figura 3). Depois de se assegurar que a retina se estabilizou de trauma cirúrgico, uma micropipeta de vidro ou dispositivo multiport é montado em um suporte de pipeta (Figura 7A-E) e interfaceado com um remendo-braçadeira headstage cuja posição é controlada por um de 3 eixos micromanipulador de precisão. O microport(s) da pipeta ou dispositivo deve então ser alinhados com um eletrodo de alvo e cuidadosamente abaixado até o contato pode ser detectado usando o método de impedância, mostrado na Figura 8 ou confirmado visualmente através da microscopia. Uma vez que a porta (s) entrega de injeção é posicionado no local apropriado na superfície ou subsuperfície da retina, o programa de estimulação pode ser iniciado.
Um conjunto representativo de gravações de atividade neural em um subconjunto dos eletrodos pMEA é mostrado na Figura 9 para visual (Figura 9A), espontâneo (Figura 9B) e estímulos de forma exógena injetado glutamato (Figura 9). Estímulos visuais e químicos bem sucedidos geralmente são observáveis como rajadas de espinhos RGC ou cessação temporária dos picos de atividade, como pode ser visto nos exemplos na Figura 9. Se as células vizinhas são não responde a estímulos químicos, os dados resultantes de spike vão olhar semelhantes ao comportamento de cravação espontâneo. Depois de extrair RGC picos e organizando-os em ensaios, as respostas neurais em cada eletrodo podem ser ilustradas usando um histograma de tempo médio de peristimulus (PSTH) da taxa de cravação, tais como as mostradas na Figura 10, que correspondem a matéria-prima dados de eletrodo na Figura 9.
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Discussion
O método apresentado aqui demonstra um paradigma único de estimulação neural, onde os neurônios da retina são quimicamente estimulados injetando produtos químicos neurotransmissor nativo no subsolo da retina em vitro. Esta técnica de estimulação química oferece várias vantagens sobre a técnica de estimulação elétrica convencional, incluindo alta especificidade focal de neurônios alvo e seletividade. O protocolo acima detalhes como pequenos injeções pneumático de volume de glutamato o neurotransmissor entregues perto de neurônios da retina de destino usando uma micropipeta de vidro de porta única ou um personalizado microusinado multiport microfluidic dispositivo eliciar respostas RGC fisiologicamente significativas. Embora este protocolo tem sido demonstrado com somente o glutamato, o protocolo permanece útil para estudar química estimulação da retina com outros tipos de neurotransmissores. Além disso, embora seja preferível usar um pMEA para uma gravação eletrofisiológicas32 , conforme descrito no presente protocolo, outros projetos MEA, incluindo o tipo não perfurado, poderia ser usado para alcançar resultados semelhantes como o pMEA. Nos parágrafos a seguir, discutimos as etapas mais críticas do nosso protocolo, métodos para solucionar problemas comuns e as limitações e futuras aplicações desta técnica de estimulação.
Para obter estimulação química segura e confiável, vários passos críticos devem ser realizados neste protocolo. Um dos passos essenciais é a obtenção de uma preparação bem sucedida da retina cuidadosamente extraindo a retina e minimizando a quantidade de tempo que é mantido fora oxigenado Ames médio, ou seja, quando o achatamento da retina recém dissecada na grelha de malha antes de transferi-lo para o pMEA perfundidos com meio de Ames. Dissecação inicial da retina requer ferramentas afiadas dissecação e prática, desde que o olho do rato é relativamente pequeno. Além disso, a extração de fotorreceptoras degenerou as retinas pode ser particularmente difícil, já que eles são mais frágeis do que o já frágil retinae normal e são, portanto, propensos a rasgar. O processo de dissecção inteira, de Enucleação inicial para colocação da retina no pMEA, deve ser realizado mais rapidamente possível evitar a morte prematura de células por falta de oxigênio ou outros nutrientes. Trauma mecânico, transmitido para o tecido durante a dissecção deve ser minimizado, evitando um corte ou danos no tecido, como este também pode levar a respostas neurais antinaturais e morte celular.
Depois de colocar a retina sobre o pMEA, deve ter cuidado ao iniciar perfusão superior e inferior e linhas de sucção, como este é um ponto comum de falha do experimento. Todas as linhas de sucção e perfusão devem ser verificadas para autorização antes de começar o experimento e examinadas periodicamente durante todo o experimento para garantir que as bolhas de ar não impedir o fluxo através das linhas. Em particular, a formação de bolhas de ar dentro da linha de perfusão inferior pode impedir completamente o fluxo de perfusão por causa de seu menor diâmetro e assim causar um fim prematuro para o experimento, privando a retina de oxigênio e nutrientes. Por causa do perigo de bolhas de ar, o protocolo acima é conduzido à temperatura ambiente, em vez da temperatura fisiológica mais ideal para evitar que os gases de oxigênio dissolvido ou dióxido de carbono a partir da solução de médio de Ames. Se as bolhas de ar occlude uma das linhas de perfusão durante um experimento, eles geralmente podem ser dispersos em bolhas menores, não-oclusão tocando levemente na linha de perfusão.
Outro problema comum relacionado com o sistema de perfusão é o ajuste fino da pressão de sucção no fundo para que ele mantém a retina firmemente em contacto com os eléctrodos, mas sem danos. Se a pressão de sucção é muito alto, pode chupar pequenos pedaços da retina através de perfurações do pMEA e eventualmente levar à cessação de todas as respostas neurais. Por outro lado, se a pressão for muito baixa, a retina vai flutuar longe os eletrodos e, portanto, interromper a gravação neural. Ajustando a pressão de sucção entre estes dois níveis extremos requer prática e é facilitada se o pMEA é usado em um microscópio invertido, que permite a observação perto das perfurações do pMEA. Ao observar essas perfurações enquanto ajusta a sucção, pode-se encontrar o equilíbrio que mantém contato sem danificar a retina. Para minimizar a possibilidade de fotobranqueamento os fotorreceptores quando estimulando as retinas do selvagem-tipo, o iluminador microscópio invertido deve ser filtrado para emitir luz vermelha só e observações devem ser concluídas mais rapidamente possível.
Depois de garantir as condições de perfusão adequado, o próximo passo crítico está referenciando o dispositivo ou pipeta com uma visível fixo ponto ou marcador sobre o pMEA para que os portos de injeção podem ser precisamente alinhados com os eléctrodos do pMEA. Normalmente, isso é realizado através de triangulação em que duas marcas de referência colocadas a borda da câmara pMEA grosseiramente estão alinhadas com a ponta de micropipeta de vidro ou Marcos no dispositivo multiporta por observação visual acima usando o Boom-estande montado microscópio. Um alinhamento mais fino dos portos de injeção com eletrodos de destino é alcançado então por inspeção visual através do microscópio invertido. Uma vez alinhados corretamente, deve ter cuidado quando se aproxima a retina com uma pipeta ou um dispositivo microfluidic, já que qualquer variação de manipulador ou deriva poderia esmagar a retina ou danificar o pMEA. A melhor maneira de evitar acidentalmente danificar a retina é monitorar continuamente a impedância do eléctrodo pipeta para detectar precisamente o contato com a superfície superior da retina. Medição de impedância também pode ser usada para verificar rapidamente se a ponta da micropipeta inseridos no subsolo da retina é bloqueado, que é indicado por uma impedância anormalmente elevada (tipicamente na faixa de gigaohm). Se bloqueada, a ponta da micropipeta geralmente pode ser cancelada por iniciando um pulso de alta pressão com sua ponta de posicionado longe da retina para evitar danos não intencionais. Em casos raros, pipetas bloqueadas podem precisar ser substituído inteiramente se os pulsos de alta pressão não desmarcar o bloqueio. Um valor anormal ou alta impedância também pode ser gravado quando o eletrodo de referência não corretamente a interface entre a solução na câmara de pMEA e o amplificador de braçadeira do remendo.
Uma vez posicionado no local de destino, o volume de injeção de glutamato deve ser rigidamente controlado pela pressão, tempo de injeção e concentração do neurotransmissor para evitar superestimulação de neurônios, que foi mostrada para causar a restrição danos excitotoxic.Os parâmetros de injeção de glutamato detalhadas no presente protocolo representam um regime que é bem inferior ao limiar conhecido por causar glutamato excitotoxicidade33 , mas, ao tentar este protocolo com outros tipos de neurotransmissores, correspondente os níveis de limite para efeitos de excitotoxicidade devem ser considerados para a estimulação do segura. Também, a pressão de injeção de 0,1 libras por polegada quadrada prescrita no protocolo acima foi derivada a menor pressão possível configuração disponível sobre o injector 8-canal de pressão utilizado neste estudo, mas tem produzido bons resultados consistentemente. Portanto, 0,1 psi para as injeções de neurotransmissor é apenas sugestivo, mas não restritiva, para alcançar o sucesso estímulos químicos. Se baixas pressões de atuação são possíveis com um injetor de pressão diferentes, as injeções podem ser efectuadas em pressões inferiores a 0,1 libras por polegada quadrada.
Uma limitação do presente protocolo envolvendo em vitro wholemount da retina preparações é a janela de tempo curta experimental, que é limitado para durações de 8 h ou menos, mesmo com extremo cuidado tomado ao longo de todo o experimento. Esta janela de tempo experimental limitado não permite análise dos efeitos a longo prazo da estimulação química como excitotoxicidade. Outra limitação deste protocolo específico é a escolha para gravar na temperatura de quarto em oposição a temperatura fisiológica, que provavelmente afeta ambos os visualmente - e quimicamente-evocado spike respostas de taxa, uma vez que estudos anteriores demonstraram que inferior temperaturas de gravação pode alterar a taxa de cravação, latência de resposta e taxa de absorção de glutamato entre várias outras propriedades34,35,36,37,38. Essa limitação poderia ser evitada pelo uso de um MEA não perfurado com uma placa de fundo aquecido, ao contrário do pMEA, que utiliza uma placa de perfusão de fundo especialmente projetada sem uma placa aquecida e/ou um debubbler térmico eficaz para a parte superior e inferior perfusão.
Finalmente, a preparação em vitro é limitada pela necessidade de perfusão ativa do meio de Ames oxigenado para manter a retina saudável. As correntes de fluido causadas pelo sistema de perfusão são tipicamente muito mais rápidas do que os mecanismos naturais de perfusão encontraram em39, o olho na vivoe poderiam interferir com injeções químicas desenhando injetados neurotransmissores longe do retina. Injeções de baseada em superfície, como aqueles feitos com o dispositivo multiporta, provavelmente seria mais suscetíveis à interferência atual de perfusão em comparação com injeções de subsuperfície, embora a presença de perfusão do fundo do pMEA poderia causar um efeito semelhante em toda a retina inteira. Por esta razão, substâncias químicas de glutamato no atual protocolo foram entregues com pressão pneumática, mas a pressão de injeção necessária para a realização bem sucedida de estimulação em vivo pode ser substancialmente menor do que o utilizado para em vitro estudos.
Estimulação química, que visa ativar os neurônios com estímulos mais naturais do neurotransmissor, oferece uma alternativa eficaz para a estimulação elétrica convencional, mas ainda não foi seriamente explorada. Como consequência, há pouca literatura disponível descrevendo o protocolo ou práticas recomendadas para alcançar confiança subretinal estimulação química dos neurônios da retina. Recentes estudos28 usando este protocolo têm demonstrado que a estimulação química subretinal de neurônios da retina pode confiantemente eliciar respostas RGC com resoluções espaciais comparáveis ou melhores do que a estimulação elétrica da retina e há provas que subretinally aplicado glutamato exógeno podem estimular células bipolares diretamente, permitindo que este método tirar proveito dos circuitos de processamento visual inerente da retina e, presumivelmente, evocando as percepções mais semelhantes à luz natural estimulação.
Mais estudos são necessários para validar esses achados em sistemas não-murino modelo e investigar questões não abordadas pelos estudos anteriores, incluindo os efeitos a longo prazo e aspectos práticos relacionados à implementação na vivo disto estratégia. Portanto, direções futuras desta abordagem claramente mentem em traduzir este conceito na vivo de modelos animais através do desenvolvimento de tecnologia apropriada para atingir a longo prazo entrega química e estimulação com um implantável microfluidic luz-alimentado dispositivo que serve como um substituto para a camada de fotorreceptoras degenerado. Como um paradigma de estimulação relativamente pouco estudado, as aplicações mais amplas de estimulação química ainda precisa ser descoberto, mas desde que a retina é uma parte do sistema nervoso central40, esta estratégia de estimulação potencialmente pode ser aplicada em outros contextos de estimulação neural, tais como o tratamento da cortical, espinal medula, ou doenças neuromusculares, usando diferentes neurotransmissores. Além disso, o protocolo apresentado poderia ser mais geralmente adoptado para estudos investigando os efeitos da entrega controlada de uma droga ou outros produtos químicos em tecidos neurais com resolução spatiotemporal fina em uma configuração em vitro .
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
O trabalho apresentado no livro foi apoiado pela Fundação Nacional de ciência, fronteiras emergentes na pesquisa e programa de inovação (NSF-EFRI) conceder o número 0938072. O conteúdo deste artigo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não necessariamente representam a opinião oficial da NSF. Os autores também desejam agradecer Dr. Samsoon Inayat o trabalho de projetar e testar a configuração inicial e experimental para a estimulação química e Sr. Ashwin Raghunathan pelo seu trabalho, projetar, fabricar e avaliar o dispositivo microfluidic multiport usado em Este estudo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microelectrode array, perforated layout | Multi Channel Systems, GmbH | 60pMEA200/30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| MEA amplifier | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| Bottom perfusion groundplate for pMEA | Multi Channel Systems, GmbH | MEA1060-Inv-(BC)-PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3-axis Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments, Novato, CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Micromanipulator Control System | Sutter Instruments, Novato, CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Gantry style micromanipulator stand with linear slide | Sutter Instruments, Novato, CA | MT-75/LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| 8-channel Programmable Multichannel Pressure Injector | OEM: MicroData Instrument, S. Plainfield, NJ Vendor: Harvard Apparatus UK |
PM-8000 or PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm Vendor: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | Axopatch 200A | Axopatch 200A has been replaced with a newer model Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier |
| Patch clamp headstage | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| Vacuum waste kit | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| Pipette holder | Warner Instruments, Hamden, CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| Pre-pulled 10 μm tip diameter glass micropipettes | World Precision Instruments, Sarasota, FL | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| Zoom stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| Microscope boom stand with dual linear ball bearing arm | Old School Industries, Inc., Dacono, CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| Zoom Stereo Microscope with C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| Inverted microscope system | Nikon, Tokyo, Japan | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| Ames medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| L-Glutamic Acid (Glutamate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| 60 mm Petri dish (10 mm tall) | Fischer Scientific, Waltham, MA | FB0875713A | 60 mm clear petri dish; https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a |
| Jewelers #5 Forceps | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| Standard Scalpel Blad #24 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| Scalpel Handle #4 | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments, Sarasota, FL | 503378 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ |
| Nylon mesh kit | Warner Instruments, Hamden, CT | NYL/MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| Harp slice grid | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag/AgCl reference electrode pellet | Multi Channel Systems, GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4 Channel Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS microscope camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| Silver wire (50 μm diameter) | Fischer Scientific, Waltham, MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Tygon microbore tubing (1.6 mm diameter) | Cole Parmer, Vernon Hills , IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
| Tilting Tool Holder with Steel Cannula | ALA Scientific Instruments, Farmingdale, NY | TILTPORT | One each of these were utilized for top perfusion and suction; http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux #26 Light Red Filter Sheet | Rosco Laboratories Inc., 52 Harbor View, Stamford, CT | R2611 | Manufacturer: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux Vendor: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| Smith & Wesson Galaxy Red Flashlight | Smith & Wesson, 2100 Roosevelt Avenue, Springfield, MA | 4588 | Manufacturer: https://www.smith-wesson.com/ Vendor: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems, GmbH | MC_Rack | http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack |
| Labview Software | National Instruments, Austin, TX | LabVIEW | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Basic Research Software | Nikon, Tokyo, Japan | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
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