Summary
وهنا نحن نناقش بروتوكول أسلوب الذي سوف تسمح بإجراء تحليل سهلة tg(fli:EGFP) الكبار الزرد المفرج الشبكية كقراءة سريعة في الإعدادات لأمراض الأوعية الدموية الطويلة الأجل المرتبطة بالتغييرات الهيكلية ونيوانجيوجينيسيس.
Abstract
اعتلال الشبكية السكري هو السبب الرئيسي للعمى بين البالغين متوسطي العمر. ارتفاع معدل انتشار مرض السكري في جميع أنحاء العالم سيجعل الوقاية مضاعفات السكري microvascular واحدة من المجالات الرئيسية للبحوث للعقود القادمة. العلاج المتخصصة، مستهدفة والعقاقير العلاجية رواية مطلوبة لإدارة عدد متزايد من المرضى المعرضين لخطر فقدان البصر. الزرد نموذج حيوان الراسخة لشؤون البحوث الإنمائية مع تزايد أهمية لنمذجة العمليات الأيضية الأمراض المتعددة العوامل. مزايا للأنواع تسمح للتصور الأمثل والمخدرات إنتاجية عالية فحص النهج، جنبا إلى جنب مع القدرة القوية لضرب الجينات للفائدة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول الذي سيسمح تحليل سهلة tg(fli:EGFP) الكبار الزرد المفرج الشبكية كقراءة سريعة في الإعدادات لأمراض الأوعية الدموية الطويلة الأجل المرتبطة بالأضرار نيوانجيوجينيسيس أو سفينة. ويتحقق هذا عن طريق تشريح الشبكية الزرد وتركيب كل من الأنسجة. ثم يتحقق التصور الأوعية المكشوفة عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل] مراسل اجفب الخضراء في المفرج الشبكية الكبار. المعالجة الصحيحة للأنسجة يؤدي إلى نتائج أفضل وأقل الكسر السفينة الداخلية أؤكد للتصور من دون تغيير بنية الأوعية الدموية. ويمكن استخدام الأسلوب في نماذج الزرد vasculopathy الشبكية المرتبطة بالتغيرات في هيكل السفينة، فضلا عن نيوانجيوجينيسيس.
Introduction
داء السكري أمراض ايضية يعرف بفرط سكر الدم الناتجة عن إفراز الأنسولين المختلة وظيفيا أو عدم كفاية الأنسجة استجابة للأنسولين يفرز. منظمة الصحة العالمية تقدر أن 422 مليون من البالغين مصابون بمرض البول السكري في 20141 ، ومدى انتشار مرض السكري في جميع أنحاء العالم من المتوقع أن يزداد إلى 8-10% السكان حتى 20352، مما يجعل مرض السكري واحد من مجالات البحوث الرئيسية في العقود القادمة. العيش مع المزمن ارتفاع نسبة السكر في الدم يؤدي إلى مضاعفات microvascular طويلة الأجل، بما في ذلك حدوث اعتلال الشبكية السكري واعتلال. إدارة ومنع هذه المضاعفات صعبة؛ وفي الواقع، أصبح مرض السكري السبب الأكثر تواترا لنهاية مرحلة المرض الكلوي (المسببات)، الأمر الذي يؤدي إلى غسيل الكلي2، ومرض السكري هو السبب الرئيسي للعمى بين البالغين متوسطي العمر3.
الأسباب الأولية للأضرار ميكروفاسكولار في العين السكري هي فرط سكر الدم المزمن، والتغيرات الأيضية، فضلا عن بعض عوامل الخطر (مثل، ارتفاع ضغط الدم، دسليبيدميا)، مما يؤدي إلى خلل الأوعية الدموية غشائي، بيريسيتي التسرب من المدارس، و انحدار الشعرية التي ينتج عنها اللاخلوي الأكمام الأوعية الدموية. الاسكيمية الشبكية الناتجة هي قضية نيوفاسكولاريزيشن وزيادة نفاذية الأوعية الدموية تعزيز التنمية لاعتلال الشبكية السكري التكاثري (PDR)4. تم الكشف عن اعتلال الشبكية السكري عموما بنسبة 37 في المائة مرضى السكري، بينما تأكدت مما يهدد البصر في اعتلال الشبكية السكري في 12% الفوج الأوروبي الأبيض فرزهم في دراسة أوكادس5. المعاملة الحالية يمكن فقط منع المزيد من المضاعفات، وليست قادرة على استعادة كامل الأضرار العمدي فعلا. بانريتينال الضوئي، بالإضافة إلى مراقبة نسبة السكر في الدم، هو العلاج القياسي لاعتلال الشبكية السكري التكاثري (PDR) ولكن يؤثر على الأنسجة السليمة المجاورة كذلك. تدخلات مكافحة VEGF تظهر نتائج واعدة كبدائل للعلاج الليزر6،7، ولكن في نهاية المطاف، العلاج المتخصصة، مستهدفة وعقاقير جديدة مطلوبة لإدارة عدد متزايد من المرضى المعرضين لخطر فقدان الرؤية.
نماذج الأبحاث الحيوانية من اعتلال الشبكية السكري لا نشارك في كل جانب من جوانب الإنسان الفيزيولوجيا المرضية. الاستفادة من الأنواع الصحيحة لمعالجة الاحتياجات المحددة لمسألة البحث العلمي أحد الأجزاء الأكثر جوهرية لبرنامج الإعداد التجريبية. ويستخدم على نطاق واسع في البحوث الإنمائية الجنين الزرد (دانيو rerio) ويوفر إلى خلفية عملية مثلى لجينات محددة ضربة قاضية أو الضربة القاضية عن طريق مورفولينوس أو الأسلوب Cas9 كريسبر/8. يمكن بسهولة استخدام هذه الأساليب في الزرد للتحقيق في الجينات، والذي تم تعريفه بواسطة واسعة النطاق على نطاق الجينوم جمعية الدراسات (جواس)، توليد الأفكار إلى آليات خاصة لتطور المرض وقابلية9. الأجيال بوقت قصير، وكميات كبيرة من ذرية، سهلة والمناولة منخفضة التكلفة، والمقايسة الدعم المتزايد ازدادت أهمية النموذج الزرد، ولا سيما في ضوء إمكاناتها كبيرة لنمذجة الأمراض الأيضية. وقد تبين المحافظة على الآليات البيولوجية في الزرد كأساس لتطوير العلاج الدوائي. على سبيل المثال، قد ثبت الميتفورمين أنتيديابيتيك المخدرات والكولسترول سيمفاستاتين "معالجة" الأوضاع في نماذج من مخيم/الديكساميتازون-فعل عالية بيبك التعبير والكوليسترول العالية الناجمة عن النظام الغذائي الكوليستيرول10 , 11 , 12-هذا تقدم نظرة ثاقبة شاملة آليات التمثيل الغذائي يحافظ يتم اعتماد مزيد من العدد المتزايد من نماذج السكري الزرد، ومن خلال تجارب مثل: التناوب حضانة في حلول الجلوكوز، الاجتثاث الناجمة عن بالستريبتوزوتوسين من خلايا بيتا، الاجتثاث nitroreductase بوساطة خلايا بيتا باستخدام ميترونيدازول برودروج، مونوجينيك السكري بوساطة عبر pdx1 الجينات ضربة قاضية أو خروج المغلوب، فضلا عن نماذج للمقاومة الأنسولين زيادة في الهيكل العظمى والعضلات 12-هذه المنشأة بالفعل البروتوكولات، التفاصيل المذكورة أعلاه من الأنواع، وإثبات القدرة على كفاءة التعامل مع الجينوم في عدد كبير من العينات كل مزايا الزرد لدراسة الآليات يقود عمليات الأمراض المعقدة، فضلا عن القدرة على الشاشة للتدخلات الدوائية.
فهم عام لتشريح العين الزرد الأساسية (الشكل 1) ضروري ديسيكتور من أجل الاستفادة من الزرد كنموذج أنجيوباثي الشبكية. وقد العين الزرد ستة extraocular العضلات والمستقيمة الأربعة، وهما العضلات المائلة التي إدراج في الخارج من أنحاء العالم في الصلبة العينية13. القرنية هي النسيج الشفاف تغطي العدسة ولا يزال مباشرة في الصلبة العينية، التي تشكل الغلاف الخارجي للعين. الصلبة العينية غير شفافة، ولديه سطح عاكس ضوء جزئيا، وهي مصطبغة بشدة. العدسة نفسها أكثر من شكل الكرة من نظيره البشري. الشبكية تتألف من ثلاث طبقات النووي من الخلايا العصبية، بينما المفرج الشبكية توفير الأوكسجين يرتبط ارتباطاً وثيقا بطبقة خلايا العقدة الداخلية ولكن لا تشكل شبكة سوبريتينال. وفي المقابل، سفن تشورويدال، تقع بين الصلبة والشبكية وترتبط مع ظهارة المصطبغة الشبكية (RPE). هذه الشبكة الشعرية إمدادات الأوكسجين إلى الأجزاء الخارجية من شبكية العين14.
رقم 1: تصوير تخطيطي للعين الزرد الكبار- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
ويمكن تحقيق التصور مباشرة من المفرج الشبكية باستخدام خط الزرد tg(fli:EGFP) المعدلة وراثيا15. البروتين الفلورية الخضراء أعرب تحت سيطرة مروج fli في خلايا بطانية للمفرج هو أساس التصور عبر ليزر المسح مجهر في خطوات لاحقة. ويتحقق هذا عن طريق تشريح الشبكية الزرد وتركيب كل من الأنسجة. يوفر هذا النموذج المعدلة وراثيا قراءات سريعة والأوعية الدموية دون أي تطبيق التسمية داخل الأوعية أو الجامعة-جبل إيمونوهيستوتشيميستري. تحليل اعتلال الشبكية السكري في الزرد، ينبغي استخدام روتين إعداد خطوة بخطوة وموحدة بكل ديسيكتور.ينص البروتوكول على الإعداد التالية مجموعات بحثية أخرى الخيار لتقييم التغيرات الأوعية الدموية في الأوعية المكشوفة للعين الزرد الكبار بسهولة وتوفير التوجيه لإنشاء روتين تشريح أمثل للشبكية الزرد.
Protocol
جميع الإجراءات، بما في ذلك الخطوات المتعلقة بمواضيع الحيوانات وأقرتها "لجنة الأخلاقيات الحيوانات" (كارلسروه Regierungspräsidium) واتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة هايدلبرغ.
1-إعداد مثبت (4 ٪ PFA/برنامج تلفزيوني)
- إعداد مثبت جديدة كل يوم لضمان الحفاظ على وحدة النسيج النسيجي الأمثل.
- حل 0.2 جم هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) في 90 مل ماء مقطر مزدوجة (ddH2س) بينما التحريك باستمرار في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة بارافورمالدهيد ز 4 (PFA) ويقلب حتى الحل واضح تماما على الأقل 5-10 دقيقة لضمان ديبوليميريزيشن من الجزيئات الكبيرة.
تنبيه: منهاج العمل السامة، والتعامل معها بعناية. - حل ز 0.84 من فوسفات هيدروجين الصوديوم (نة2بو4) في الحل والتحكم في درجة الحموضة في 7.2 عن طريق القياس.
- ضبط حجم الصوت إلى 100 مل مع ddH2س وتصفية الحل عن طريق ورقة تصفية الصف 3.
- تخزين 4% PFA/برنامج تلفزيوني على الجليد.
2-إعداد حل القتل الرحيم
ملاحظة: الخطوات التالية تم القيام به مع سلالة الزرد البرية من نوع أبتل في سن عام من الاثنين 6-8.
- استخدام إثيل 3-أمينوبينزواتي الميثان المشبعة بالفلور أوكتين، المسمى "تريكايني" أو مرض التصلب العصبي المتعدد-222، أيضا في تركيز 0.31 ملغم/مل لالزرد القتل الرحيم16. استخدام x 1 البيض المياه، تستخدم لزيادة الأجنة الزرد، كمذيب لحل القتل الرحيم. وبصفة عامة، التحكم في عمق التخدير الصحيح قبل العمل مع السمك مخدراً بإثبات فقدان التوازن ولمس فقدان رد الفعل.
- لتحقيق 1,000 مل 10 × المياه البيض، إضافة هذه الأملاح إلى 1,000 مل من الماء المقطر مزدوجة (ddH2س) بينما التحريك باستمرار بالترتيب التالي: 10 جرام كلوريد الصوديوم، 0.3 غ بوكل، 0.4 غ كاكل2 *ح 62س، ز 1.32 مجسو4 *ح 62o.
3-تثبيت أنسجة الزرد
- نقل الحل PFA/برنامج تلفزيوني 4% 6 مل كل عينة في الآبار جيدا ست لوحات مقدما.
- Euthanize الزرد الكبار (سابقا الحفاظ على معيار الضوء أيام دورة، مثلاً، h 12: 12 ح) ح 2 بعد تشغيل في الصباح، بوضعها في الحل تريكيني الأضواء والانتظار حتى أنها وصلت إلى القتل الرحيم. في أعقاب توقف حركة أوبيركولار، التي يمكن أن تصل إلى 10 دقيقة.
- تأخذ الأسماك خارج الحل القتل الرحيم تريكيني ووضعها على المناشف الورقية الطازجة. تجفيف الأسماك واستخدام مشرط لقطع الرؤساء وراء operculum (انظر الشكل 2 أ). نقل الرؤساء مباشرة في لوحات بريبيد جيدا، والتي تحتوي على مثبت الطازجة.
- مخزن جيدا لوحات تحتوي على رؤوس الأسماك عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها لمالا يقل عن 24 ساعة أن أؤكد مثبت تخترق طبقات الشبكية أعمق.
ملاحظة: يمكن تخزين رؤساء الزرد لمدة أقصاها 48 ساعة في 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) عند 4 درجة مئوية قبل إعداد دون فقدان صلة قوة إشارة الأسفار. استتار زيادة يمكن أن يؤدي إلى فقدان سلامة الأنسجة وتقليل جودة الصورة، وهكذا ينبغي تجنبها.
4-إعداد المفرج الشبكية الزرد
- ملء طبق بيتري يصل إلى الثلث مع ساخن 2% [اغروس] وانتظر حتى أجار موقف ثابت. تغطية لوحة أجار مع برنامج تلفزيوني x 1 لإنشاء مساحة عمل تشريح العيون.
ملاحظة: هذا سوف تسمح كلا الحفاظ على إعداد ملاقط والضغط المنخفض في الأنسجة أثناء تشريح، يقلل من احتمال وقوع أضرار هيكلية. ينبغي إجراء جميع خطوات إعداد أخرى في مساحة العمل هذه استخدام الملقط #5 على التوالي مع نصائح الجميلة تحت مجهر تشريح مع برنامج التحصين الموسع-إضاءة إضافية.- بينما تشريح، استخدم التكبير بين 4.0 x و 6.0 x للسماح لاستعراض وتقييم التفصيل المنحى للأنسجة.
- نقل العينة ثابتة في طبق بتري، وعقد الرئيس على سطح قطع مع ملقط واحد، إدراج آخر الملاقط مثبتة معا تحت مقلة العين في تجويف المداري. ببطء فتح الملاقط أسفل العين وقبضة العصب البصري، ثم بعناية المسيل للدموع وفصل العيون (الشكل 2).
رقم 2: إزالة العين الزرد الكبار- عرض الجانب القرنية بالعين لا يزال في تجويف المداري والعصب البصري سليمة (A). عرض الجانب القرنية بالعين فصل (ب). تصوير تخطيطي للعين الزرد في هذه الخطوة (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- إزالة أي المستقيمة الأربعة وهما العضلات extraocular المائلة التي مازلت متصلاً بالعين، فضلا عن بقايا الأنسجة extraocular توصيل العين إلى تجويف المداري (قارن رقم 3 و رقم 4).
- تحقيق ذلك عن طريق عقد مرة أخرى العين عن طريق الملاقط إغلاق نصف، وهدوء تجتاح البنية مع الملاقط الأخرى، مزق قبالة مع حركة مضادة. منذ تجتاح مقلة العين مباشرة يؤدي إلى الكسر السفينة الداخلية، هذا الأسلوب لطيف مناسب للحفاظ على المفرج.
الشكل 3: العين الزرد الكبار مع extraocular العضلات في التركيز- العرض الأفقي مع تمسك العضلات اكستراوكولار بالحافة الخارجية اليسرى للكرة الأرضية العين في التركيز (A). عرض الجانب العصب البصري مع extraocular العضلات شكل متناظر المرافقة العصب البصري (ب). تصوير تخطيطي للعين الزرد في هذه الخطوة (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- استخدام إبرة ز 27 (0.4 × 19 مم) المتاح لثقب القرنية (الشكل 4، السهم الأحمر) في النطاق الخارجي. من خلال هذا الافتتاح عقد القرنية مع كلا ملاقط وقليلاً البلى من فتح. بعد ذلك العمل بعناية من أجل خلق دمعة تركزت تقريبا حجم التلميذ كل منهما.
الشكل 4: العين الزرد الكبار بعد إزالة جميع extraocular العضلات. العرض الجانبي مع مسح الحافة الخارجية للعين العالم مرئية (A).عرض الجانب العصب البصري مع العصب البصري في الوسط. الصلبة التي تعكس الضوء لا تغطي كامل المنطقة المحيطة بالعصب (خط متقطع أحمر) (ب). تصوير تخطيطي للعين الزرد في هذه الخطوة (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- تطبيق الضغط على الجانب القرنية من أنحاء العالم العين (بدءاً العينية) على حافة القرنية الخارجي أعلاه قزحية العين. وهذا خلق عراقيل صغيرة ودفع العدسة إلى ذروة القرنية المسيل للدموع. تشغيل الملاقط تحت العدسة وإزالته (الشكل 5A).
الرقم 5: العين الزرد الكبار عملية إزالة العدسة. عرض الجانب القرنية مع العدسة دفعت من خلال القرنية المسيل للدموع (A). عرض الجانب القرنية مع العدسة بجوار الكرة الأرضية العين (ب). تصوير تخطيطي للعين الزرد في هذه الخطوة (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- دورة العين رأسا على عقب للعصب البصري التي تواجه الباحث. علما بأن الصلبة والقرنية متصلة وتشكل سترة الليفي اللمبة العين لحماية شبكية العين على شكل كأس. (الشكل 6).
- هذا شل، يتألف من القرنية والصلبة العينية، يسمى أيضا "كورنيوسكليرا" وقطع غيارها خارج المنطقة المحيطة بالعصب البصري (الشكل 4 باء، خط متقطع أحمر). أدخل إبرة في هذا التوقف مرة واحدة لإنشاء فتحه بين الشبكية والصلبة العينية.
رقم 6: تتألف من الصلبة والقرنية، التي يتم قطع الأنسجة المتبقية داخل مقلة العين كورنيوسكليرا. عرض الجانب القرنية تظهر استمرار القرنية شفافة في الصلبة العينية المصطبغة (A). وركز العرض الجانبي الجزء سكليرال من كورنيوسكليرا (ب). تصوير التخطيطي كورنيوسكليرا تمت إزالتها (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- باستخدام هذا الوصول مع ملاقط على حد سواء، بعناية مزق الصلبة العينية محوريا في المشارب لزيادة فتح حول العصب البصري. يجب الحرص على الحفاظ كورنيوسكليرا سليمة في الانتقال إلى محيط القرنية الجانب (انظر الشكل 6 (أ)).
- عقد الصلبة العينية مع ملقط واحد، والاستيلاء على العصب البصري مع الآخرين وسحب بعيداً، تماما إزالة كورنيوسكليرا من العين وتجاهل ذلك (الشكل 6). في محاولة لقطع أية اتصالات قبل فصل في كورنيوسكليرا والأنسجة المتبقية داخل مقلة العين، كمرفق للهياكل الأخرى ستكون نقطة حرجة؛ وسوف توفر هذه الخطوة بنية على شكل كأس يتألف من عنبية والشبكية التي تحتوي على المفرج الشبكية (الشكل 7).
- إنشاء تمزق في طبقة تشورويدال/RPE بالضغط إبرة ز 27 جانبية لكأس المتبقية أثناء القشط السطح الخارجي مع حافة الحافة إبرة. استخدم التمزق كنقطة وصول للحصول على قبضة على طبقة تشورويدال/RPE والتمزق مع كلا ملاقط في المشارب، ولكن الحفاظ على اتصال بقزحية العين سليمة.
- وبعدها تشغيل الملاقط واحد تحت القزحية ويرحل في دائرة من الخارج بينما خلق التوتر عن طريق سحب في طبقة تشورويدال/RPE توقف إنتاجها لتحقيق مفرزة للهيكل الموحد.
ملاحظة: القزحية يجب فصل، بغية عدم عرقلة fluorescence بينما تصور السفن (8B الشكل). الاستيلاء على القزحية مباشرة لإزالته يمكن أن يؤدي إلى تلف السفينة واسعة النطاق، لا سيما في الدائرة الداخلية الألياف البصرية (IOC)، حيث يزال متصلاً آيريس للأنسجة المحيطة. يمكن فصل طبقة تشورويدال وظهاره المصطبغة الشبكية (RPE) غالباً ما تحتفظ باتصال آيريس، والذي يسمح سهولة إزالة ثانوية. - إذا كان لا يمكن إزالة أجزاء من القزحية، الاستفادة من نقطة الانهيار طبيعية العين الزرد الكبار المعارض داخل طبقة مستقبله (رر)، بطريقة مماثلة للخطوة 4-9، إزالة قزحية العين.
- تتخلص من على السطح الخارجي لشبكية على شكل كأس المتبقية للحث على إلغاء في رر أعلاه نقطة الانهيار (الشكل 11، السهم الأسود). استخدام الوصول الذي تم إنشاؤه لإزالة الجزء العلوي من الطبقة مع إبقاء الاتصال الممكنة لقزحية العين سليمة. وبعدها تشغيل الملاقط تحت القزحية ويرحل في دارة كما ذكرنا من قبل لفصل بنية مجتمعة.
ملاحظة: واحد ينبغي التحلي بالصبر خطوة كاملة 4.9 يمكن أن يكون صعباً، ولكن هذه الرعاية سوف تحقيق أفضل نتائج الأوعية الدموية من الاستيلاء على قزحية العين على حافة التلميذ مستقيم أو إجبار فتحه عن طريق تدمير اتصالات RPE/تشورويدال أو طبقة مستقبله دون إزالتها منها. بعد هذه الخطوة سوف وبالتالي المحافظة على سلامة الأوعية الدموية الشبكية، ولكن تؤدي إلى تلف طبقات الشبكية الخارجي.
- وبعدها تشغيل الملاقط واحد تحت القزحية ويرحل في دائرة من الخارج بينما خلق التوتر عن طريق سحب في طبقة تشورويدال/RPE توقف إنتاجها لتحقيق مفرزة للهيكل الموحد.
رقم 7: العين الزرد الكبار بعد إزالة كورنيوسكليرا- تظهر طريقة العرض الأفقي الأنسجة داخل مقلة العين المتبقية مع قزحية العين والعصب البصري سليمة (A). عرض الجانب القرنية مع آيريس في التركيز (ب). تصوير تخطيطي للعين الزرد في هذه الخطوة (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
- استخدام مقص ربيع ميكروديسيكتيون مع قطع حافة مستقيمة 2.5 ملم لقطع العصب البصري أقرب ما يكون إلى الشبكية؛ هذا سوف يسمح لشقة-تركيب أفضل من الأنسجة.
الشكل 8: العين الزرد الكبار بعد إزالة RPE/المشيمية والعصب البصري مبتوراً. يظهر عرض الجانب العصب البصري الشبكية مع عصب البصري مبتوراً (A). عرض الجانب القرنية مع إلقاء نظرة مباشرة على الطبقة الداخلية أكثر من الشبكية (ب). تصوير تخطيطي للعين الزرد في هذه الخطوة (ج).الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
5-تركيب المفرج الشبكية
- أغسل الشبكية تشريح مرتين لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1 x. نقل الشبكية بعد اقتطاع للعصب البصري، استخدام ملعقة مختبر مع نهاية ملعقة صغيرة لتجنب التعامل مباشرة مع الأنسجة المعرضة.
- ضع قطره من برنامج تلفزيوني على شريحة زجاجية ونقل الشبكية إلى الحبرية. استخدام الملاقط إبقاء الأنسجة في مكان بينما قطع هيكل على شكل كأس مع مشرط لإنشاء شكل مسطح تلة-أربعة أو خمسة-تلة تبعاً لحجم الشبكية (انظر الشكل 9).
- تمتص بقايا برنامج تلفزيوني مع غرامة قطعة من الورق. احرص على عدم لمس الشبكية.
- معطف الشبكية مسطحة مثبتة في تركيب وسائل الإعلام، وتغطي مع ساترة. تكون منتبهة لا لخلق الرغوة، كما فقاعات الهواء يمكن أن تشوه التصور الأوعية الشبكية.
- تقليل الحركة ساترة وختم الغطاء مع طلاء الأظافر واضحة.
6-التصور المفرج الشبكية
- الحفاظ على الفارق الزمني بين إعداد والتصور قصيرة قدر الإمكان التقليل من فقدان تفاصيل الصورة من خلال فقدان إشارة الأسفار. تخزين يتصاعد المفرج الشبكية مستعدة عند 4 درجة مئوية لتقليل فقدان إشارة، وإذا تعذر تحقيق التصور مباشرة، كما تدهور جودة الصورة ببطء يصبح مرئياً 48 ساعة بعد إعداد.
- تصور يتصاعد المفرج الشبكية عن طريق الفحص المجهري fluorescence أو ليزر المسح المجهري [كنفوكل].
ملاحظة: تحقق التصور السفينة بالفحص المجهري fluorescence في 2.5 x التكبير مع وقت تعرض 2.0 s، 6.0 x وأشعة غاما للحصول على إعدادات 1.67. للفحص المجهري [كنفوكل]، استخدمت ليزر Ar (488 نانومتر/20 ميغاواط) في السلطة 20% في تركيبة مع عامل تصفية إثارة TD 488/543/633، 20 س/0.7 غ الغمر متعددة الهدف مع ddH2س كالغمر وسائط الإعلام، وإعدادات التصفية الانبعاثات من 505-560 نانومتر. صور [كنفوكل] تتألف من 4 × 4 أو 5 × 4 أو 5 × 5 صور فريدة جنبا إلى جنب من خلال مسح بلاط تبعاً لحجم الشبكية.
7-وأقسام الشبكية الزرد
ملاحظة: لأنه المقاطع الشبكية الزرد، إعداد الأنسجة كما هو موضح في البروتوكول حتى الخطوة 4، 5 وبعد ذلك انتقل مباشرة إلى الخطوة 7، 1.
- غسل العينين انوكليتيد (بعد الخطوة 4، 5) مرتين لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1 x. وبعد ذلك، نقل الأنسجة إلى إيثانول 70% (EtOH). عند هذه النقطة، يمكن تخزين عيون مستعدة عند 4 درجة مئوية حتى البارافين التضمين.
- يغسل النسيج بالطريقة التالية ليذوي أنه قبل تضمين البارافين: 2 × 15 دقيقة في الإيثانول 80%، 2 × 15 دقيقة في الإيثانول 90 ٪، 3 × 15 دقيقة في الإيثانول 96 ٪، 3 × 15 دقيقة في الإيثانول 99 ٪، 2 × 15 دقيقة في الإيثانول acetone/99% (1:2)، 3 × 15 دقيقة في الأسيتون. الحفاظ النسيج في البارافين في 62 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- تسخين البارافين الطازجة إلى 62 درجة مئوية ومن أجل ذلك إلى تضمين قوالب. نقل الأنسجة في قوالب مباشرة، وعلى نحو سريع الوتيرة، مراقبة التوجيه الصحيح للعيون للقسم المطلوب. بعد ذلك، تنطبق كاسيت تضمين على العفن والغطاء مع البارافين ساخنة إضافية.
- إزالة قوالب التضمين بعد أن يبرد كتل البارافين. قص كتل البارافين في مبضع إلى 10 ميكرون أقسام وتطفو بها على حمام مائي 45 درجة مئوية على سطح الماء مدة كافية بالنسبة لهم لشد تماما.
- التقاط المقاطع على شريحة زجاجية واستنزاف لهم عمودياً لإزالة الماء الزائد قبل التجفيف عليها بين عشية وضحاها في فرن عند 45 درجة مئوية.
- العملية المزيد من المقاطع مع الجدول الزمني التالي ديبارافينيزي وأنه وصمة عار: 4 × 1 دقيقة في إكسيلول، 1 x 1 دقيقة في 99 ٪ الإيثانول، 1 x 1 دقيقة في الإيثانول 96%، 1 x 1 دقيقة في الإيثانول 80%، 1 x 1 دقيقة في الإيثانول 70%، 1 x 1 دقيقة في ddH2س، 1 × 4 دقيقة في الهيماتوكسيلين ماير في ، 1 x 10 دقيقة في ddH2س، 1x2min في ويوزين 0.5%، 1 x 30 s في ddH2س، 1 x 30 s في الإيثانول 80%, s في الإيثانول 96% 2 × 30, 3 × 1 دقيقة في الإيثانول 99%، و 1 × 1 دقيقة في إكسيلول.
- تأخذ الشريحة الزجاجية من أصل إكسيلول وتغطي بسرعة الأنسجة مع تركيب وسائط. تجنب ترك الأنسجة تجف تماما، ثم ضع ساترة في الأعلى وختم الأنسجة الملون.
Representative Results
هنا نظهر مثالين المورفولوجية نموذجية من المفرج الشبكية في الزرد tg(fli:EGFP) الكبار: تصور مرة واحدة مع مجهر الأسفار (الشكل 9 ألف) ومرة مع ليزر [كنفوكل] المسح مجهر (9B الشكل). كشف بنية الشبكية يظهر نمط تنظيم عالية. ويعتبر أوتوفلوريسسينسي قوية في الشبكية الزرد، عندما تصور مع مجهر الأسفار. وهكذا، ينصح مرئيات فقط طبقة الأوعية الدموية عن طريق المسح الضوئي [كنفوكل] الحد من الأسفار الخلفية وزيادة التباين. للحصول على صورة أسرع أو الحالات التي تكون فيها البيانات النوعية ما يكفي، المجهر fluorescence بديلاً جذاباً.
الشكل 9: صور الممثل من tg(fli:EGFP) الكبار الزرد المفرج الشبكية. تظهر الأمثلة المورفولوجية نموذجية اثنان من المفرج الشبكية: الشريان الألياف البصرية المركزية الذي ينتشر في السفن الرئيسية 5-7، والتي ثم التفرع إلى خلافة أروقة. جميع سفن أخرى تصب في هذا السياق كفافى (CV) يحد من الجزء الخارجي من كل تلة. التصور عبر الفحص المجهري fluorescence في 2.5 x التكبير (A). تصور المفرج الشبكية بالليزر [كنفوكل] الفحص المجهري عن طريق مسح بلاط صورة واحدة (ب)5 × 5 مجتمعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشريان الألياف الضوئية تخترق الشبكية على رأس العصب البصري، وينتشر في معظم العينات، إلى 5-7 سفن رئيسية (الشكل 10A). السفن الرئيسية ثم التفرع إلى خلافة أروقة والاتصال بالألياف الضوئية الدائرة الداخلية (IOC)، على المنوال كفافى (CV)، وتسمى أيضا تطويق القرص البصري في محيط الشبكية المحملة مسطحة (انظر الشكل 10 باء). اللجنة الأولمبية الدولية هو السفينة الوريدية التي تستنزف الدم الشرياني عند الحافة الداخلية للكرة الأرضية العين (بدءاً العينية). كما يبين المفرج الشبكية الزرد مجالات نشاط الأوعية الدموية عالية مع المنطق التفريعي الشعيرات الدموية والأوعية التي تنتشر في (الشكل 10). هذا النشاط والأوعية الدموية يقع معظمها في الجوار القريب للجنة الأولمبية الدولية. من المهم أن تلاحظ أن العين نفسها يمكن أن تثبت كل الأنشطة العالية والمنخفضة والأوعية الدموية في مناطق مختلفة من الشبكية (قارن الرقم 10 باء ، و الشكل 10). بشكل عام، يظهر المفرج الشبكية من الزرد المزيد من مساحة أفاسكولار والشعيرات أقل ما بين الفروع الرئيسية إذا ما قورنت، على سبيل المثال، شبكية الفئران17. يجب أن يتم تحليل كل من عيون كل عينة نظراً للمفرج قد تختلف بين والتفتيش المفرد يمكن أن تؤدي إلى التحيز.
رقم 10: تضخيم المناطق tg(fli:EGFP) الكبار الزرد المفرج الشبكية التصور. الشريان الألياف البصرية المتفرعة إلى السفن الرئيسية (A). الشعيرات الدموية الشبكية في مجال نشاط الأوعية الدموية منخفض الاتصال بالدائرة البصرية الداخلية (IOC) في الجزء السفلي من الصورة (ب). الشعيرات الدموية الشبكية في مجال نشاط الأوعية الدموية عالية الاتصال باللجنة الأولمبية الدولية (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
بنية المحافظة على درجة عالية من طبقات الخلايا العصبية موجودة بالفعل في الزرد من حوالي 72 ساعة بعد الإخصاب (hpf) فصاعدا18. الشبكية الزرد الكبار يبين الطبقات التالية من الداخل إلى الخارج (الشكل 11): العقدة خلية طبقة (جكل)، الطبقة بليكسيفورم الداخلية (IPL)، والطبقة النووية الداخلية (المكتب)، الطبقة الخارجية بليكسيفورم (المناضل)، طبقة النووي الخارجي (ONL)، طبقة مستقبله (رر)، وظهاره المصطبغة الشبكية (RPE). ويرد في الشكل 12تقدير معلمات الأوعية الدموية من التصور المفرج الشبكية. ويقع المفرج الشبكية الداخلية على طبقة الخلايا العقدة (جكل) (الشكل 13B، مربع أبيض) في حين تشورويدال الشعيرات الدموية ستكون مرتبطة مع ظهارة المصطبغة الشبكية (RPE).
رقم 11: أنه تلطيخ العين الزرد الكبار- نظرة عامة على مستعرضة العين كله بعد إزالة العدسة (A). طبقات الشبكية من الزرد الكبار العين19 (ب). إشارة (السهم الأسود) من نقطة الانهيار الطبيعية في رر (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
نماذج نيوانجيوجينيسيس الشبكية التي يسببها نقص تظهر زيادة في إعداد النقاط المتفرعة، الأوعية براعم، إجمالي مساحة الأوعية الدموية وتقلص المسافة إينتيركابيلاري في الزرد20. هذه النتائج تدعم الفكرة القائلة بأن الزرد عرضه لمضاعفات microvascular السكري21، كما تتضمن النتائج الرئيسية لاعتلال الشبكية السكري في وقت لاحق نيوانجيوجينيسيس نقص بوساطة، الذي يرتبط بقوة بالتعبير VEGF. التغيرات المستحثة بفرط سكر الدم في الشبكية الزرد تؤدي إلى زيادة سمك الأوعية ولكن الحفاظ على مجمل الزخرفة22. الغمر في حلول الجلوكوز لمدة 30 يوما بالتناوب يقلل أيضا من سمك الشعيرات والمكتب23. وأبدى أيضا الفعل التأثير المباشر الأيض الجلوكوز في الزرد كأنصار vasculopathy الأيضية. ولوحظ هايبربرانتشينج وعائية إضافية في المفرج جذع أجنة الزرد بعد الحضانة مع ميثيلجليوكسال24. في هذه اللحظة، هناك لا يوجد نموذج الحيوان الذي يوفر جميع المعايير الرئيسية لاعتلال الشبكية السكري. غالباً ما توجد تغييرات مبكرة، ولكن الانتقال إلى اعتلال الشبكية السكري التكاثري يفتقد25. كما يندرج الزرد هذا التعريف، كما فقط شهدنا تغييرات الناجم عن فرط سكر الدم أو نقص بوساطة نيوانجيوجينيسيس حتى الآن. النتائج الحالية ندعم فكرة أن الزرد هي عرضه للتغيرات الوعائية فرط سكر الدم بوساطة كنموذج لحيوانات قد يحتمل أن إظهار تقدم إلى اعتلال الشبكية السكري التكاثري. اعتماداً على قوتها والتعرض لتأثير ارتفاع السكر في الدم بوساطة، يمكن أن تؤدي إلى الاسكيمية في مناطق معينة من الشبكية الزرد النموذج التجريبي الحق وتعزيز نيوانجيوجينيسيس كمعايير رئيسية لاعتلال الشبكية السكري التكاثري. كما الزرد لاعب جديد نسبيا في مجال نمذجة الأمراض microvascular طويلة الأجل، نماذج السكري القادمة في الزرد سوف تقديم مزيد من المعلومات وتوضيح أهميتها فيما يتعلق بنماذج أخرى، وهذه الأمراض. على سبيل المثال، يمكن استخدامها في يب الزرد tg(gata1a:DsRed) مع الأحمر المسمى الكريات الحمراء في خط tg(fli:EGFP) في نفس الوقت تصور عيونهم توتر محتمل في المستقبل نماذج الزرد عرض ميكروانيوريسمس منبئ الانتقال إلى الديمقراطية.
حيث يتقدم المفرج الشبكية في سلسلة متعاقبة أروقة، تقييم المسافة إينتيرفاسكولار وعدد من النقاط المتفرعة وإجمالي مساحة الأوعية الدموية ترتبط بالمسافة من الشريان الألياف البصرية المركزية. تجنب التحيز في معلمات الأوعية الدموية المقررة، مطلوب نقطة الاتجاه. اللجنة الأولمبية الدولية مثل هذا هيكل وهو وثيق الصلة نظراً لمجالات نشاط الأوعية الدموية تكمن في القرب المكاني المباشر. للتقييم متسقة، مسح الشبكية يجب أن تقسم إلى مقاطع صورة مستطيلة متعددة مع مسافة متسقة للجنة الأولمبية الدولية. يجب أن يتم تحليل كامل الشبكية وتوزيع الصور رقمياً شكل متناظر. الشبكية الزرد تبين المناطق ذات الكثافة العالية والمنخفضة الشعرية وتوزيع غير متكافئ لأقسام الصورة يمكن أن يؤدي إلى تحيز إضافية.
الشكل 12: عرض المثال المعلمات الأوعية الدموية كقراءات تصور المفرج الشبكية. دائرة قياس المسافة إينتيرفاسكولار (سهم أحمر مزدوج) قرب البصرية الداخلية (IOC) (A). بالقرب من ثلاث نقاط التفريع (دوائر حمراء) اللجنة الأوقيانوغرافية الحكومية الدولية (ب). التصور من الزرد المفرج الشبكية مع منطقة موسع (المربع الأحمر) تظهر سفينة تبرعم (ج). سفينة القطر يقاس على مسافة معينة (سهم مزدوج أبيض) من الشريان المركزي (الصليب الأبيض) (د). كثافة السفينة هو النسبة المئوية للشبكية المنطقة المحتلة التي تتراكب السفن (خطوط حمراء قطرية) (ه). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
لقياس المسافة إينتيرفاسكولار، يحتاج المرء مسافة معينة إلى اللجنة الأولمبية الدولية كمعيار (الرقم 12A، سهم مزدوج أبيض) ورسم خط أفقي تخيلي (الرقم 12A، خط أبيض أفقي) موازية للجنة الأولمبية الدولية. يساوي المسافة بين السفن على هذا الخط إضافة وحسابيا متوسط المسافة التي إينتيرفاسكولار. يتم حساب النقاط المتفرعة داخل كل صورة كلما انشقاقات سفينة ويستمر التجويف الأوعية الدموية أكثر من نقطة المنشأ. وهذا يشمل أيضا الاتصالات الأفقية بين الشعيرات الدموية. من المهم أن تبقى متسقة مع التحليل وتقرر فيه النقاط المتفرعة للاعتماد والحفاظ على هذه القواعد خلال التجربة كلها إلى تقليل التباين غير الضرورية. تنتشر الأوعية الدموية، كما هو موضح في الشكل 12، هو معلمة أخرى يمكن أن تحسب في كل صورة تقييم تأثير على المفرج الشبكية. لا تتبع براعم الأوعية خلافة مثل الممرات بين الشريان المركزي واللجنة الأوقيانوغرافية الحكومية الدولية وتركيز قرب الجزء الخارجي من الشبكية. لتقييم بعض أقطار السفينة، نقطة اتجاه مطلوب دائماً من خلالها مسافة تعيين علامات القياس الموضعي. المنشأ الشريان الرئيسي لداخل الشبكية هذه توجيهات للسفن الجذع الرئيسي (12D الشكل، بيضاء عبر). منطقة تحتلها السفن (الرقم 12E، خطوط حمراء قطرية) كنسبة مئوية من منطقة الشبكية كله هو كثافة الأوعية الدموية ويرتبط غير مباشرة بمنطقة أفاسكولار.
ينبغي أن تتألف بمسح كامل [كنفوكل] من عينة واحدة من العديد من الصور عالية من التفصيل للسماح لتصور هايبرسبروتينج الشعرية الصغيرة. لتحسين الوقت والموارد التي تنفق على هذه الخطوة، ينبغي استخدام إجراء تيلينج الآلي مع عمق مسح عام لكل بلاطة. يمكن زيادة تصاعد التفاوت الشبكية إلى حد كبير الوقت المستغرق لإتمام عملية المسح المفرج مع مجهر [كنفوكل]. في نهج أمثل يود المرء أن تفحص فقط في طبقة الأوعية الدموية (الشكل 13B، مربع أبيض)، ولكن إدراج الجزئي جكل ضروري غالباً.ترك طول الزائد للعصب البصري بعد اقتطاع، فضلا عن التخفيضات لتحقيق المسطحة-جبل كونها قصيرة جداً، يمكن أن يؤدي إلى تصاعد التفاوت.
الشكل 13: مقارنة بين أنه يلطخ وأوتوفلوريسسينسي في الشبكية الزرد الكبار- المفرج الشبكية في التركيز أعلاه جكل (A). المفرج الشبكية (مربع أبيض) عرض الأخضر إشارة اجفب وطبقات الشبكية العارضة أوتوفلوريسسينسي قوية ((ب)). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
كالتحضير السليم للمفرج الشبكية الزرد الاحتياجات التدريبية السابقة، هي حجم عينة صغيرة مع dissectors غير مدربين ونتائج إعداد متباينة بشدة القيد الرئيسي من هذا الأسلوب. أثناء إعداد tg(fli:EGFP) الزرد عيون يعطي فكرة سريعة في حالة المفرج، يستخدم التقنية لا يزال حوالي 20 دقيقة من وقت العمل لكل الشبكية للباحثين ذوي خبرة. يجب أن يتم تنفيذ كل خطوة من هذه الخطوات إعداد للمفرج الشبكية تحت مجهر تشريح وتتركز dissectors الحاجة إلى البقاء طوال الوقت كخطوة إهمال يمكن أن يستحث يحتمل أن تكون سفينة الكسر. يجب ممارسة ديسيكتور بانتظام كما الغياب المطول من إعداد يقلل احتمال ديسيكتور الحفاظ على سلامة السفينة.
وعلاوة على ذلك، لا تزال محدودة، كما تعمل سوى عدد قليل من الأجسام المضادة للتحقق من صحة على الأنسجة البشرية والقوارض مع الزرد قراءات إضافية عن طريق إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة). وينصح المجربون المهتمة في المدينة للبحث عن الأجسام المضادة الزرد محددة، لا سيما عند العمل مع الأهداف الجديدة. وبدلاً من ذلك، من المستحسن استخدام خطوط مراسل الزرد إضافية ومفيدة لدراسة الخلايا خارج المفرج في العين. بيد أن هذه الاستراتيجية، مضيعة للوقت، كما يستغرق بضعة أشهر لإنشاء خطوط الزرد الكبار التي تحمل العديد من الصحفيين المحورة وراثيا.
ومع ذلك، يطرح الزرد مجموعة فريدة من المزايا. فهي صغيرة نسبيا وسهولة استنساخها. يمكن أن تنمو على مراحل الكبار بسرعة، وهذه الأجنة الأمثل لفحص المخدرات. المجال يتزايد بسهولة والأدب أكثر أصبح موجوداً. مع القدرة على توليد الجينات بالضربة القاضية سرعة ووفرة من خطوط مراسل fluorescence التحوير، اختيار الزرد مقيدة فقط بالسؤال البحثي الذي تم اختياره.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر كاترين بينيويتز ومارلين هاوسنير لتربية الزرد، وتقديم المساعدة التقنية. الكتاب تقر دعم "الأساسية مرفق يعيش خلية التصوير مانهايم" في المركز للطب الحيوي والتكنولوجيا الطبية مانهايم (DFG أنست 91027/9-1). أيد هذه الدراسة الألمانية الأوقيانوغرافية (المشروع الدولي بحوث التدريب الفريق 1874/1 "دياميكوم"، حزمة الخدمة SP5 و SP9؛ SFB1118 مركز البحوث التعاونية، ومشروع B1 ومشروع مركز البحوث التعاونية SFB/TR23 Z5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Roth | 6771.3 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| CaCl2*6H20 | Roth | 5239.2 | |
| MgSO4*7H20 | Merck | 1.05886.0500 | |
| Paraformaldehyd | Roth | 0335.3 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Roth | 2370.1 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| PBS | Roth | 9143.1 | |
| Agarose | Roth | 2267.3 | |
| Fluoromount-G | Thermo-Fischer | 00-4958-02 | |
| Petri dish | Greiner Bio one | 633180 | |
| Six-well plate | StarLab | CC7682-7506 | |
| Needle | MSG Praxisbedarf | BD 300900 | |
| Micro Tweezer | World Precision Instruments | 14095 | |
| Microdissection Scissor | World Precision Instruments | 501778 | |
| Glass slide | Carl Roth | H872.1 | |
| Coverslip 22mmx22mm | neoLab | 103512222 | |
| Scalpel | MSG Praxisbedarf | FEA111 | |
| Epi-Illumination | Leica | 10446389 | |
| Fluorescence stereomicroscope MZ10 F | Leica | NA | |
| Confocal laser-scanning microscope SP5 DS | Leica | NA | |
| Stereomicroscope M80 | Leica | NA | |
| Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype | NA | NA | see Reference 15 |
| Mayer’s hematoxylin | Dr. K. Hollborn & Söhne | 0088663 | |
| 0.5% eosin | Dr. K. Hollborn & Söhne | NA | |
| 99,9% ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Paraffin | Merck | 1,071,501,000 | |
| Xylol | Roth | 4436.2 | |
| Acetone | Emsure | 606-001-00-8 | |
| Microtome RM 2165 | Leica | NA |
References
- WHO. Global report on diabetes. , 88 (2016).
- Lim, A. Diabetic nephropathy - complications and treatment. Int J Nephrol Renovasc Dis. 7, 361-381 (2014).
- Yau, J. W., et al. Global prevalence and major risk factors of diabetic retinopathy. Diabetes Care. 35 (3), 556-564 (2012).
- Cheung, N., Mitchell, P., Wong, T. Y. Diabetic retinopathy. The Lancet. 376 (9735), 124-136 (2010).
- Raymond, N. T., et al. Higher prevalence of retinopathy in diabetic patients of South Asian ethnicity compared with white Europeans in the community: a cross-sectional study. Diabetes Care. 32 (3), 410-415 (2009).
- Heng, L. Z., et al. Diabetic retinopathy: pathogenesis, clinical grading, management and future developments. Diabet Med. 30 (6), 640-650 (2013).
- Writing Committee for the Diabetic Retinopathy Clinical Research, N., et al. Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 314 (20), 2137-2146 (2015).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Sharma, K. R., et al. ELMO1 protects renal structure and ultrafiltration in kidney development and under diabetic conditions. Sci Rep. 6, 37172 (2016).
- Baek, J. S., Fang, L., Li, A. C., Miller, Y. I. Ezetimibe and simvastatin reduce cholesterol levels in zebrafish larvae fed a high-cholesterol diet. Cholesterol. , 564705 (2012).
- Elo, B., Villano, C. M., Govorko, D., White, L. A. Larval zebrafish as a model for glucose metabolism: expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase as a marker for exposure to anti-diabetic compounds. J Mol Endocrinol. 38 (4), 433-440 (2007).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiol Rev. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kasprick, D. S., et al. Microanatomy of adult zebrafish extraocular muscles. PLoS One. 6 (11), e27095 (2011).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Dev Neurobiol. 72 (3), 302-327 (2012).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
- Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
- Avanesov, A., Malicki, J. Analysis of the retina in the zebrafish model. Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).
- Gramage, E., Li, J., Hitchcock, P. The expression and function of midkine in the vertebrate retina. Br J Pharmacol. 171 (4), 913-923 (2014).
- Cao, R., Jensen, L. D., Soll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), e2748 (2008).
- Jorgens, K., Hillebrands, J. L., Hammes, H. P., Kroll, J. Zebrafish: a model for understanding diabetic complications. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 120 (4), 186-187 (2012).
- Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycaemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Dis Model Mech. 3 (3-4), 236-245 (2010).
- Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetol. 44 (3), 157-163 (2007).
- Jorgens, K., et al. High tissue glucose alters intersomitic blood vessels in zebrafish via methylglyoxal targeting the VEGF receptor signaling cascade. Diabetes. 64 (1), 213-225 (2015).
- Lai, A. K., Lo, A. C. Animal models of diabetic retinopathy: summary and comparison. J Diabetes Res. 2013, 106594 (2013).
