Summary
Her diskuterer vi en metode-protokollen, som vil tillade en let analyse af voksen tg(fli:EGFP) zebrafisk retinal Vaskulaturen som en hurtig udlæsning i indstillingerne af langsigtede vaskulære asbestrelaterede neoangiogenesis og strukturelle ændringer.
Abstract
Diabetisk retinopati er den hyppigste årsag til blindhed blandt midaldrende voksne. Den stigende forekomst af diabetes på verdensplan vil gøre forebyggelse af diabetisk mikrovaskulære komplikationer, en af de vigtigste forskningsområder i de næste årtier. Specialiseret, målrettet terapi og nye terapeutiske lægemidler er nødvendige for at håndtere det stigende antal patienter med risiko for tab af synet. For zebrafisk er en etableret dyremodel for udviklingsmæssige forskningsspørgsmål med stigende relevans til modellering af metaboliske multifaktoriel sygdomsprocesser. Fordele af arterne, der giver mulighed for optimal visualisering og høj overførselshastighed stof screening tilgange, kombineret med den stærke evne til at udskære gener af interesse. Her, beskriver vi en protokol, som giver mulighed for nem analyse af voksen tg(fli:EGFP) zebrafisk retinal Vaskulaturen som en hurtig udlæsning i indstillingerne af langsigtede vaskulære asbestrelaterede neoangiogenesis eller fartøj skade. Dette opnås via dissektion af zebrafisk nethinden og hele-montering af væv. Visualisering af de udsatte fartøjer er derefter opnået via Konfokal mikroskopi af den grønne EGFP reporter udtrykt i voksen retinal Vaskulaturen. Korrekt håndtering af væv vil føre til bedre resultater og mindre interne fartøj brud at forsikre visualisering af den uforandret vaskulære struktur. Metoden kan udnyttes i zebrafisk modeller af retinale vasculopathy forbundet med ændringer i fartøjet arkitektur samt neoangiogenesis.
Introduction
Diabetes mellitus er en stofskiftesygdom, der er defineret af hyperglykæmi som følge af dysfunktionelle insulinsekretion eller utilstrækkelig væv svar på udskilles insulin. WHO anslår, at 422 millioner voksne var lever med diabetes mellitus i 20141 og forekomsten af diabetes på verdensplan forventes at stige til 8-10% af befolkningen indtil 20352, hvilket gør diabetes, en af de vigtigste forskningsområder i det næste årtier. At leve med kronisk højt blodsukker fører til langsigtet mikrovaskulære komplikationer, herunder diabetisk retinopati, nefropati og polyneuropati. Håndtering og forebyggelse af disse komplikationer er vanskelige; faktisk, diabetes bliver den hyppigste årsag i slutstadiet nyresygdom (ESRD), hvilket fører til dialyse2, og diabetes er den hyppigste årsag til blindhed blandt midaldrende voksne3.
De første årsager til mikrovaskulære skader i diabetisk øjet er kronisk hyperglykæmi, stofskifteforandringer, samt visse risikofaktorer (f.eks., hypertension, dyslipidæmi), fører til vaskulære endotel dysfunktion, pericyte frafald, og kapillar regression, der resulterer i acellulær vaskulære ærmer. Den resulterende retinal iskæmi er årsag til neovascularization og øget vaskulær permeabilitet fremme udviklingen af proliferativ diabetisk retinopati (PDR)4. Diabetisk retinopati er generelt fundet i 37% af diabetespatienter, mens sight-truende diabetisk retinopati er blevet konstateret i 12% af de screenede hvide europæiske kohorte i UKADS undersøgelse5. Den nuværende behandling kan kun forhindre yderligere komplikationer og er ikke i stand til at genskabe de allerede inducerede skader. Panretinal fotokoagulation, ud over glykæmisk kontrol, er den standard behandling for proliferativ diabetisk retinopati (PDR) men påvirker den tilstødende sunde væv så godt. Anti-VEGF interventioner viser lovende resultater som alternativer til laser behandling6,7, men i sidste ende, specialiseret, målrettet terapi og nye lægemidler er nødvendige for at håndtere det stigende antal patienter med risiko for tab af synet.
De etablerede dyreforskning modeller af diabetisk retinopati deler ikke alle aspekter af human patofysiologi. Udnyttelse af den korrekte arter til at løse de specifikke krav i den videnskabelige forskningsspørgsmål er en af de mest betydelige dele af opsætningen af eksperimenterende. Zebrafisk embryo (Danio rerio) er allerede udbredt i udviklingsmæssige forskning og giver en optimal praktiske baggrund til knockdown eller knockout specifikke gener via morpholinos eller CRISPR/Cas9 teknik8. Disse metoder kan nemt blive udnyttet i zebrafisk at undersøge gener, der blev identificeret af stor skala genome-wide association studier (GWAS), generere indsigt i særlige mekanismer af sygdomsprogression og modtagelighed9. Korte generationsskifte tid, store mængder afkom, nem og billig håndtering og voksende assay støtte steget relevansen af zebrafisk model, især i betragtning af dens store potentiale for modellering stofskiftesygdom. Bevarelse af biologiske mekanismer i zebrafisk har været vist som grundlag for farmakologisk terapi udvikling. For eksempel, har mod diabetes narkotika metformin og kolesterol-sænkende simvastatin vist sig at "behandle" tilstande i modeller af cAMP/dexamethason-induceret høj PEPCK udtryk og høj-kolesterol kost-induceret hyperkolesterolæmi10 , 11 , 12. denne fremrykkende indsigt i overordnede bevarede metaboliske mekanismer understøttes yderligere af det stigende antal zebrafisk diabetes modeller, gennem eksperimenter såsom: skiftevis inkubation i glucose løsninger, Streptozotocin-induceret ablation af beta-celler, nitroreductase-medieret beta cell ablation bruger prodrug metronidazol, monogene diabetes medieret via pdx1 gen knockdown eller knockout, samt modeller af øget insulinresistens i skeletmuskulatur 12. disse allerede etablerede protokoller, ovennævnte specifikationer af arterne, og evnen til at effektivt manipulere genom i et stort antal prøver alle demonstrere fordelene ved zebrafisk for at studere mekanismerne kørsel komplekse sygdomsprocesser såvel som evnen til at screene for farmakologiske interventioner.
En generel forståelse af grundlæggende zebrafisk øje anatomi (figur 1) er nødvendige for dissector for at udnytte zebrafisk som en model for retinal angiopathie. Zebrafisk øjet har seks ekstraokulær muskler, fire rectus, og to skrå muskler, der indsættes på ydersiden af kloden på sclera13. Hornhinden er gennemsigtig væv der dækker linsen og fortsætter direkte ind i sclera, som danner yderstof af øjet. Sclera er uigennemsigtige, har en delvist lys reflekterende overflade, og er stærkt pigmenteret. Selve linsen er mere ballet-formet end den menneskelige modstykke. Nethinden består af tre nukleare lag af neuronale celler, mens ilt-giver retinal Vaskulaturen er tæt forbundet med den indre ganglion cellelag men udgør ikke et subretinal netværk. Choroidal fartøjer, derimod ligge i mellem sclera og nethinden og er forbundet med den retinale pigmenteret epitel (ÅV). Dette kapillar netværket leverer ilt til de ydre dele af nethinden14.
Figur 1: Skematisk visning af voksen zebrafisk øje. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Ligetil visualisering af retinale Vaskulaturen kan opnås ved udnyttelsen af transgene tg(fli:EGFP) zebrafisk linje15. Grøn fluorescerende protein udtrykt under kontrol af fli promotor i endothelial celler af Vaskulaturen er grundlaget for visualisering via en laser scanning mikroskop i de senere trin. Dette opnås via dissektion af zebrafisk nethinden og hele-montering af væv. Denne transgene model giver et hurtigt vaskulære udlæsning uden nogen anvendelse af intravaskulære mærkning eller hele-mount Immunhistokemi. For at analysere diabetisk retinopati i zebrafisk, skal en trin for trin og standardiseret forberedelse rutine bruges af hver dissector.Følgende forberedelse protokol giver andre forskergrupper mulighed for at nemt at vurdere vaskulære ændringer i de udsatte fartøjer af voksen zebrafisk øjet og give vejledning til at oprette en optimeret dissektion rutine for zebrafisk nethinden.
Protocol
Alle procedurer, herunder trin relateret til dyrenes emner, er blevet godkendt af dyr etiske komité (Regierungspräsidium Karlsruhe) og følge retningslinjerne dyrs pleje af Heidelberg Universitet.
1. forberedelse af fiksativ (4% PFA/PBS)
- Forberede Fikseringsvæske frisk hver dag at sikre optimal bevarelse af histologiske væv integritet.
- 0,2 g natriumhydroxid (NaOH) opløses i 90 mL dobbeltdestilleret vand (ddH2O) under konstant omrøring ved stuetemperatur.
- Tilføje 4 g PARAFORMALDEHYD (PFA) og omrør indtil løsningen er helt klart for mindst 5-10 min at forsikre depolymerization af makromolekyler.
Forsigtig: PFA er giftige, håndterer med omhu. - 0.84 g natrium dihydrogen fosfat (NaH2PO4) opløses i opløsningen og kontrollere pH på 7,2 via måling.
- Justere lydstyrken med ddH2O til 100 mL og filtreres gennem filtrerpapir 3.
- Gemme 4% PFA/PBS på is.
2. forberedelse af eutanasi løsning
Bemærk: Følgende trin blev udført med ABTL vildtype zebrafisk stamme i en generel alder af 6-8 mon.
- Bruge ethanol 3-aminobenzoat metan sulfonat, også kaldet "tricaine" eller MS-222, i en koncentration på 0.31 mg/mL for zebrafisk eutanasi16. Udnytte 1 x æg vand, bruges til at hæve zebrafisk embryoner, som opløsningsmiddel for dødshjælp løsning. Generelt, kontrollere den korrekte anæstesi dybde før arbejdet med bedøvet fisk ved at demonstrere tab af ligevægt og røre reaktion tab.
- For at nå 1.000 mL 10 x æg vand, tilsættes disse salte til 1.000 mL dobbeltdestilleret vand (ddH2O) under konstant omrøring i følgende rækkefølge: 10 g NaCl, 0,3 g KCl, 0,4 g CaCl2 *6 H2O, 1.32 g MgSO4 *6 H2O.
3. fiksering af zebrafisk væv
- Overføre 6 mL 4% PFA/PBS løsning pr. prøve til wells af seks-godt plader på forhånd.
- Aflive den voksne zebrafisk (tidligere vedligeholdes på en standard lys-dages cyklus, fx12 h: 12 h) 2 h efter lys tænder om morgenen, ved at placere dem i tricaine-løsningen og vente, indtil de har nået eutanasi. Efter ophør af opercular bevægelse, hvilket kan tage op til 10 min.
- Tag fisken ud af tricaine eutanasi løsning og læg dem på frisk papirhåndklæder. Tør fisken og bruger en skalpel til at skære hoveder bag laag (Se figur 2A). Overføre hovedet direkte til de prepped godt plader, som indeholder den frisklavede fiksativ.
- Butik godt plader der indeholder fisk hoveder ved 4 ° C natten over i mindst 24 timer til at forsikre fiksativ trænger de dybere retinal lag.
Bemærk: Zebrafisk hoveder kan opbevares i maksimalt 48 h i 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved 4 ° C før forberedelse uden en relevant tab af fluorescens signalstyrke. Øget ventetid kan føre til tab af væv integritet og reduceret billedkvalitet, og derfor bør undgås.
4. forberedelse af zebrafisk Retinal Vaskulaturen
- Fyld en petriskål op til en tredjedel med opvarmet 2% Agarosen og vente, indtil agaren er fast. Dække agar plade med 1 x PBS til at oprette et arbejdsområde til at dissekere øjne.
Bemærk: Dette vil give mulighed for både bevarelsen af forberedelse pincet og lavt tryk på væv mens dissekere, at reducere sandsynligheden for strukturelle skader. Alle yderligere forberedelsestrin bør udføres i arbejdsområdet udnytte #5 lige pincet med fine tips under et dissekere mikroskop med yderligere epi-belysning.- Mens dissekere, skal du bruge forstørrelse mellem 4,0 x og 6,0 x at give mulighed for både overblik og detalje-orienteret vurdering af væv.
- Overfør faste prøven i petriskålen, og ved at holde hovedet på snitfladen med en pincet, indsætte en anden toppunkt-sammen pincet nedenfor øjeæblet på orbital hulrummet. Langsomt åbne pincet under øjet og greb synsnerven, og derefter omhyggeligt rive og frigøre øjne (figur 2B).
Figur 2: fjernelse af voksen zebrafisk øje. Hornhinde side Se med øjet stadig i orbital hulrummet og intakt synsnerven (A). Hornhinde sidekig med fritliggende øje (B). Skematisk visning af zebrafisk øje på dette trin (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Fjerne nogen af de fire rectus og to skrå ekstraokulær muskler, der er stadig forbundet til eye samt resterende ekstraokulær væv forbinder øjet til orbital hulrummet (Sammenlign figur 3 og figur 4).
- Opnå dette ved at holde tilbage i øjet gennem halvt lukkede pincet, og gribende struktur med de andre pincet, sagte rip det ud med et diametermål bevægelse. Da gribende øjeæblet direkte fører til interne fartøj brud, er denne teknik passende blid at bevare Vaskulaturen.
Figur 3: voksen zebrafisk øje med ekstraokulær muskler i fokus. Lateral udsigt med tilknytning af en ekstraokulær muskel til venstre ydre rand af Okulær kloden i fokus (A). Synsnerven sidekig med ekstraokulær muskler symmetrisk flankerende synsnerven (B). Skematisk visning af zebrafisk øje på dette trin (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Bruge en 27G (0,4 x 19 mm) engangs nål til at punktere hornhinden (figur 4 c, rød pil) på det ydre område. Gennem denne åbning hold hornhinden med begge pincet og lidt rive det åbne. Bagefter omhyggeligt arbejde for at skabe en centreret ælde omtrent på størrelse med de respektive elev.
Figur 4: voksen zebrafisk øjet efter fjernelse af alle ekstraokulær muskler. Lateral udsigt med de ryddede ydre rand af okulære kloden synlige (A).Synsnerven sidekig med synsnerven i midten. Lysreflekterende sclera ikke dækker hele området omkring nerve (rød stiplet linje) (B). Skematisk visning af zebrafisk øje på dette trin (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Lægge pres på den hornhinde side af Okulær kloden (bulbus oculi) på yderkanten af hornhinde over iris. Dette vil skabe en lille bule og skubbe linsen til højden af cornea rive. Køre pincet under linse og fjern det (figur 5A).
Figur 5: voksen zebrafisk øje ved at linsen fjernelse. Hornhinde sidekig med linsen skubbes gennem cornea tåre (A). Hornhinde sidekig med linsen ved siden af Okulær kloden (B). Skematisk visning af zebrafisk øje på dette trin (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Øjnene op og ned til synsnerven vender forskeren. Bemærk, at sclera og hornhinden er forbundet og udgør den fibrøse tunika i øjet pære for at beskytte den kop-formede nethinden. (Figur 6).
- Denne shell, bestående af hornhinden og sclera, kaldes også "corneosclera" og reservedele ud området omkring synsnerven (figur 4B, røde stiplede linje). Indsætte en nål på denne afbrydelse en gang at skabe en åbning mellem sclera og nethinden.
Figur 6: Corneosclera bestående af sclera og hornhinden, som er adskilt fra de resterende intraokulært væv. Hornhinde sidekig viser fortsættelse af den gennemskinnelige hornhinden i pigmenteret sclera (A). Lateral udsigt fokuseret på den scleral del af corneosclera (B). Skematisk visning af den fjernede corneosclera (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Ved hjælp af denne adgang med begge pincet, omhyggeligt rip sclera aksialt i striber at øge åbning omkring synsnerven. Vær omhyggelig med at holde corneosclera intakt ved overgangen til hornhinde side omkreds (Se figur 6A).
- Hold sclera med en pincet og sensationsprægede synsnerven med andre og trækker væk, helt fjerne corneosclera fra øjet og kassere det (figur 6). Prøv at afskære alle forbindelser før adskillelse af corneosclera og de resterende intraokulært væv, som vedhæftet fil til andre strukturer bliver et kritisk punkt. Dette trin vil give en kop-formet struktur bestående af uvea og nethinden som indeholder retinal Vaskulaturen (figur 7).
- Oprette et brud i choroidal/ÅV lag ved at holde 27G kanyle sidelæns til den resterende kop mens skrabning yderside med rim af needle-tip. Bruge brud som et adgangspunkt til at få styr på laget choroidal/ÅV og rip det med begge pincet i striber, men holde forbindelsen til iris intakt.
- Bagefter, køre en pincet under iris og gå rundt i et kredsløb fra ydersiden mens skaber spændinger ved at trække på den udgåede choroidal/ÅV lag at opnå detachment af de kombinerede struktur.
Bemærk: Iris skal være afbrudt, så man hindrer fluorescens mens visualisere fartøjer (fig. 8B). Sensationsprægede iris direkte for at fjerne det kan føre til omfattende fartøj skade, især på det fiberoptiske inderkreds (IOC), da iris er stadig forbundet til det omgivende væv. Laget choroidal og retinal pigmenteret epitel (ÅV) kan adskilles og ofte beholde en forbindelse til iris, som giver mulighed for en nem sekundære fjernelse. - Hvis dele af iris ikke kan fjernes, udnytte en naturlig bristepunktet voksen zebrafisk øjet udstiller inde fotoreceptor laget (PL), på samme måde til trin 4.9, at fjerne iris.
- Skrab over ydersiden af de resterende kop-formet nethinden til at fremkalde discontinuations i PL over bristepunktet (figur 11C, sort pil). Brug den oprettede adgang til at fjerne den øvre del af lag samtidig med den mulige forbindelse til iris intakt. Bagefter kan køre pincet under iris og gå rundt i et kredsløb, som tidligere nævnt for at løsrive den kombinerede struktur.
Bemærk: Bør man udvise tålmodighed, da det hele trin 4.9 kan være svært, men denne pleje vil opnå en bedre vaskulære resultat end fritagelserne sensationsprægede iris på randen af eleven eller tvinge en åbning ved at ødelægge forbindelser til choroidal/ÅV eller fotoreceptor laget uden at deres respektive fjernelse. Efter dette trin vil således bevare retinal vaskulær integritet, men føre til skader på de ydre retinal lag.
- Bagefter, køre en pincet under iris og gå rundt i et kredsløb fra ydersiden mens skaber spændinger ved at trække på den udgåede choroidal/ÅV lag at opnå detachment af de kombinerede struktur.
Figur 7: voksen zebrafisk øjet efter fjernelse af corneosclera. Lateral udsigt viser den resterende intraokulært væv med intakt iris og synsnerven (A). Hornhinde sidekig med iris i focus (B). Skematisk visning af zebrafisk øje på dette trin (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Brug en microdissection foråret saks med en straight 2,5 mm forkant til at skære synsnerven så tæt som muligt på nethinden; Dette vil give mulighed for en bedre fladskærms-montering af væv.
Figur 8: voksen zebrafisk øjet efter fjernelse af ÅV/årehinden og afkortet synsnerven. Synsnerven viser side nethinden med en afkortet synsnerven (A). Hornhinde sidekig med et direkte kig ind på de mest inderste lag af nethinden (B). Skematisk visning af zebrafisk øje på dette trin (C).Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
5. montering af den retinale Vaskulaturen
- Vask dissekeret nethinden to gange for 5 minutter i 1 x PBS. Hvis du vil overføre nethinden efter trunkering af synsnerven, udnytte en lab spatel med en mikro skeen ende at undgå direkte håndtering af de udsatte væv.
- Anbring en dråbe af PBS på et glas dias og overføre nethinden i slipværktøjet. Bruge en pincet til at holde væv i sted mens der skæres den kop-formet struktur med en skalpel til at oprette en flad fire-petal eller fem-kronblad form afhængigt af den retinale størrelse (Se figur 9).
- Fedte sidesten PBS med et fint stykke papir. Pas på ikke at røre nethinden.
- Coat de fast monterede nethinden i montering medier og dækkes med en coverslip. Være opmærksomme på ikke at skabe skum, som luftbobler kan fordreje visualisering af de retinale fartøjer.
- Minimere bevægelse af coverslip og forsegle dækslet med klar neglelak.
6. visualisering af retinale Vaskulaturen
- Holde tidsforskydninger mellem forberedelse og visualisering så kort som muligt for at reducere billedet detaljer tab gennem fluorescens signaltab. Gemme rede retinal Vaskulaturen mounts ved 4 ° C til at reducere tab af signal, hvis direkte visualisering ikke kan opfyldes, som nedbrydning af billedkvaliteten langsomt bliver synlige 48 timer efter tilberedning.
- Visualisere de retinale Vaskulaturen mounts via Fluorescens mikroskopi eller laser scanning Konfokal mikroskopi.
Bemærk: Fartøj visualisering af Fluorescens mikroskopi blev opnået på 2,5 x forstørrelse med en eksponeringstid på 2,0 s, gevinst på 6,0 x og gamma indstillinger af 1,67. For Konfokal mikroskopi, et Ar-laser (488 nm/20 mW) på 20% strøm blev udnyttet i kombination med en TD 488/543/633 excitation filter, en 20 x / 0,7 NA multi fordybelse mål med ddH2O som fordybelse medier og emission filterindstillinger 505-560 nm. Konfokal billeder er sammensat af 4 x 4, 4 x 5 eller 5 x 5 ental billeder kombineres gennem en flise scanning afhængigt af den retinale størrelse.
7. han dele af zebrafisk nethinden
Bemærk: For han dele af zebrafisk nethinden, forberede væv, som beskrevet i protokollen indtil trin 4.5 og bagefter springe direkte til trin 7.1.
- Vask kerneløse øjnene (efter trin 4.5) to gange for 5 minutter i 1 x PBS. Bagefter overføre vævet ind i 70% ethanol (EtOH). På dette punkt kan parat øjne opbevares ved 4 ° C indtil paraffin indlejring.
- Vaske væv på følgende måde til at dehydrere den før paraffin indlejring: 2 x 15 min med 80% ethanol, 2 x 15 min i 90% ethanol, 3 x 15 min i 96% ethanol, 3 x 15 min i 99% ethanol, 2 x 15 min i acetone/99% ethanol (1:2), 3 x 15 min i acetone. Holde væv i paraffin ved 62 ° C natten over.
- Varme op frisk paraffin til 62 ° C og hæld det i indlejring forme. Overføre vævet i forme direkte og i et hurtigt tempo, kontrol korrekt orientering af øjnene for den ønskede sektion. Bagefter, anvende en indlejring kassette til mug og dække med yderligere opvarmet paraffin.
- Fjerne integrering formene efter paraffinblokke har kølet. Skær paraffinblokke på en mikrotom i 10 µm sektioner og flyde dem ud på en 45 ° C vandbad på vandoverfladen længe nok for dem at flade helt.
- Fange sektioner på et glas dias og dræne dem lodret for at fjerne overskydende vand før tørring dem natten over i en ovn ved 45 ° C.
- Processen afsnittene yderligere med følgende tidsplan til deparaffinize og han pletten: 4 x 1 min i xylol, 1 x 1 min. i 99% ethanol, 1 x 1 min. i 96% ethanol, 1 x 1 min. 80% ethanol, 1 x 1 min. i 70% ethanol, 1 x 1 min. i ddH2O, 1 x 4 min i Mayers hæmatoxylin , 1 x 10 min i ddH2O, 1x2min i 0,5% eosin, 1 x 30 s i ddH2O, 1 x 30 s i 80% ethanol, 2 x 30 s i 96% ethanol, 3 x 1 min. i 99% ethanol og 1 x 1 min. i xylol.
- Tage glas dias ud af xylol og hurtigt dække væv med montering medier. Undgå for at lade væv tørre ud helt, derefter placere en coverslip på toppen og forsegle det farvede væv.
Representative Results
Her vi viser to typiske morfologiske eksempler af retinale Vaskulaturen i voksen tg(fli:EGFP) zebrafisk: endnu en visualiseret med et fluorescens mikroskop (figur 9A) og en gang med en Konfokal laser scanning mikroskop (figur 9B). Den afslørede retinal struktur viser en meget organiseret mønster. Stærk autofluorescence er set i zebrafisk nethinden, når visualiseret med et fluorescens mikroskop. Således, en visualisering af kun det vaskulære lag via en Konfokal scanning er rådes til at reducere baggrund fluorescens og øge kontrasten. For hurtigere billede erhvervelse eller situationer, hvor kvalitative data er nok, er fluorescens mikroskop et attraktivt alternativ.
Figur 9: repræsentative billeder af voksne tg(fli:EGFP) zebrafisk retinal Vaskulaturen. To typiske morfologiske eksempler af retinale Vaskulaturen er vist: den centrale optic arterie spredes til 5-7 vigtigste fartøjer, som derefter forgrening ind i en række af arkader. Alle yderligere fartøjer afløb i omkredsen vene (CV) begrænsning af den ydre del af hver petal. Visualisering via Fluorescens mikroskopi på 2,5 x forstørrelse (A). Visualisering af den retinale Vaskulaturen af Konfokal laser scanning mikroskopi gennem en kombineret 5 x 5 enkelt billede flise scanning (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Den optiske arterie trænger nethinden på synsnerven hoved og i de fleste prøver, spredes til 5-7 vigtigste fartøjer (figur 10A). De vigtigste fartøjer derefter forgrening ind i en række af arkader og oprette forbindelse til den optiske inderkreds (IOC), også kaldet omkredsen venen (CV), omkranser den optiske disk i periferien af den flade monteret nethinden (Se figur 10B). IOC er den venøse fartøj, der dræner det arterielle blod på den indre rand af Okulær kloden (bulbus oculi). Zebrafisk retinal Vaskulaturen viser også høj vaskulær aktivitetssektorer med forgrening af kapillærer og angiogene spiring (figur 10C). Denne vaskulære aktivitet ligger for det meste i nærheden af nærhed til IOC. Det er vigtigt at bemærke, at det samme øje kan påvise både høj og lav vaskulære aktiviteter indenfor forskellige områder af nethinden (Sammenlign figur 10B og figur 10C). I almindelighed, viser retinal Vaskulaturen af zebrafisk mere avascular plads og færre kapillærer i mellem de vigtigste grene hvis i forhold til eksempelvis nethinden mus17. Begge øjne af hver prøve skal analyseres, fordi Vaskulaturen kan variere i mellem og ental inspektion kan føre til bias.
Figur 10: forstørret områder af voksen tg(fli:EGFP) zebrafisk retinal Vaskulaturen visualisering. Optic arterie filialer i vigtigste fartøjer (A). Retinal kapillærer i et område med lav vaskulære aktivitet tilslutning til den optiske inderkreds (IOC) nederst i billedet (B). Retinal kapillærer i et område med høj vaskulære aktivitet forbinder med IOC (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
En meget bevaret arkitektur af neuronal lag er allerede til stede i zebrafisk fra ca 72 h post befrugtning (hpf) og fremefter18. Voksen zebrafisk nethinden viser følgende lag fra indefra og ud (Figur 11): ganglion cellelag (GCL), inderste plexiform lag (IPL), inderste nukleare lag (INL), ydre plexiform lag (OPL), ydre nukleare lag (ger), fotoreceptor laget (PL), og den retinale pigmenteret epitel (ÅV). Estimering af vaskulære parametre fra retinal Vaskulaturen visualisering er vist i figur 12. Den indre nethinde Vaskulaturen ligger på ganglion cellelag (GCL) (Figur 13B, hvide boks) mens den choroidal kapillærer ville være forbundet med den retinale pigmenteret epitel (ÅV).
Figur 11: han farvning af voksen zebrafisk øje. Tværsnits oversigt over hele øjet efter fjernelse af linsen (A). Retinal lag af den voksne zebrafisk eye19 (B). Angivelse (sort pil) af den naturlige bristepunktet i PL (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Modeller af hypoxi-induceret retinal neoangiogenesis viser øget antal forgrening punkter, angiogene spirer, samlede vaskulære område og faldt intercapillary afstand i zebrafisk20. Disse resultater støtter tanken om, at zebrafisk er modtagelige for diabetisk mikrovaskulære komplikationer21, som Hovedresultaterne af senere diabetisk retinopati omfatter hypoxi-medieret neoangiogenesis, som er stærkt knyttet til VEGF udtryk. Hyperglykæmi-inducerede ændringer i zebrafisk nethinden føre til øget tykkelse af fartøjerne, men fastholder det overordnede mønster22. Skiftevis fordybelse i glucose løsninger for 30 dage også nedsætter tykkelsen af IPL og INL23. Den direkte indflydelse af glucose metabolitter i zebrafisk metaboliske fortalere for vasculopathy var også allerede vist. Yderligere vaskulær hyperbranching blev observeret i trunk Vaskulaturen af zebrafisk embryoner efter inkubation med methylglyoxal24. I øjeblikket er der ingen dyr model, som giver alle de vigtigste kriterier for diabetisk retinopati. Tidlige ændringer findes ofte, men progression til proliferativ diabetisk retinopati mangler25. For zebrafisk også falder ind under denne definition, som vi har kun set enten hypoxi-medieret neoangiogenesis eller hyperglykæmi-inducerede ændringer indtil nu. De nuværende resultater støtter tanken om, at zebrafisk er modtagelige for hyperglykæmi-medieret vaskulære ændringer og som en dyremodel potentielt kan vise en progression til proliferativ diabetisk retinopati. Afhængigt af styrken og eksponering til hyperglykæmi-medieret effekt, kunne de lige eksperimentel model fører til iskæmi i visse områder af zebrafisk nethinden og fremme neoangiogenesis som nøglekriterier for proliferativ diabetisk retinopati. Men som zebrafisk er en forholdsvis ny spiller inden for modellering langsigtede mikrovaskulære patologier, kommende diabetes modeller i zebrafisk vil give yderligere oplysninger og præcisere dens betydning i forhold til andre modeller og deres patologier. For eksempel, kunne en på tværs af tg(gata1a:DsRed) zebrafisk med rød-mærket erytrocytter ind i tg(fli:EGFP) linjen bruges samtidigt visualisere potentielle intraokulært blødninger i fremtiden zebrafisk modeller viser microaneurysms som en indikator for progression til Laos.
Da den retinale Vaskulaturen skrider frem i en række af arkader, evaluering af den intervascular afstand, række forgrening punkter og det samlede vaskulære område er relateret til afstanden fra den centrale optic arterie. For at undgå bias i de vurderede vaskulære parametre, er et punkt af orientering påkrævet. IOC er sådan struktur og er yderst relevant, da vaskulær aktivitetssektorer ligge i umiddelbar geografisk nærhed. For ensartet vurdering, bør retinal scanningen opdeles i flere rektangulært billede sektioner med en ensartet afstand til IOC. Hele nethinden skal analyseres og billeder numerisk symmetrisk fordelt. Zebrafisk nethinden viser områder med høj og lav kapillær densitet og en ulige fordeling af billedet dele kan føre til yderligere bias.
Figur 12: eksempel præsentation af vaskulære parametre som udlæsning af retinale Vaskulaturen visualisering. Måling af intervascular afstand (rød dobbelt pil) nær den indre optik cirkel (IOC) (A). Tre forgrening punkter (røde cirkler) nær IOC (B). Visualisering af zebrafisk retinale kar med et udvidet område (rød boks) viser et spirende fartøj (C). Fartøj diameter måles over en vis afstand (hvid dobbeltpil) fra den centrale arterie (hvide Kors) (D). Fartøj tæthed er procentdelen af retinale område besat af overliggende fartøjer (diagonal røde linjer) (E). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
For at måle den intervascular afstand, skal man sætte en vis afstand til IOC som standard (fig. 12A, hvid dobbelt pil) og tegner en imaginær vandrette linje (figur 12A, vandret hvid streg) parallelt med IOC. Afstanden mellem fartøjer på denne linje tilføjet og matematisk gennemsnit er lig med den intervascular afstand. Forgrening punkter tælles inde i hvert billede, når et fartøj opdeler og mere end én vaskulære lumen fortsætte med udgangspunkt i oprindelse. Dette omfatter også horisontale forbindelser mellem kapillærer. Det er vigtigt at holde overensstemmelse med analyse og beslutte, hvilke forgrening punkter til at tælle og holde disse regler i hele hele forsøget at reducere unødvendige variation. Vaskulære spiring, er som vist i figur 12C, en anden parameter, der kan tælles i hver billed at evaluere indflydelse på den retinale Vaskulaturen. Angiogene spirer følger ikke den arcade-lignende Arvefølgekrig mellem centrale arterie og IOC og fokus i nærheden af de ydre dele af nethinden. For at vurdere visse fartøj diametre, et punkt af orientering er altid nødvendig som et sæt afstand markerer måling spot. Den centrale arterie oprindelse inde i nethinden indeholder sådanne retningslinjer for de vigtigste stilk fartøjer (figur 12D, hvide Kors). Området besat af fartøjer (figur 12E, diagonal røde linjer) som en procentdel af hele retinal området er de kar densitet og korrelerer indirekte til området avascular.
En komplet Konfokal scanning af én prøve bør bestå af flere high-detaljerede billeder til at tillade visualisering af små kapillær hypersprouting. For at optimere tid og ressourcer, der anvendes på dette trin, skal en automatiseret tilling fremgangsmåde anvendes med en generel scanning dybde for hver flise. Ujævn montering af nethinden kunne højlig forhøje den tid brugt til at scanne Vaskulaturen med en Konfokal mikroskop. I en optimal tilgang en ønsker at scan kun vaskulære lag (Figur 13B, hvide boks), men delvis integration af GCL er ofte nødvendig.Forlader en overskydende længde af synsnerven efter trunkering samt nedskæringer at opnå fladskærms-mount bliver for kort, kan føre til ulige montering.
Figur 13: sammenligning af han farvning og autofluorescence i voksne zebrafisk nethinden. Retinal Vaskulaturen i fokus over GCL (A). Retinal Vaskulaturen (hvid boks) viser grøn et EGFP signal og retinal lag udstillende stærke autofluorescence (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Som en god forberedelse af zebrafisk retinal Vaskulaturen behov for forudgående uddannelse, en lille stikprøvestørrelse med utrænede dissectors og stærkt varierende forberedelse resultater er en vigtigste begrænsning af teknikken. Mens forberedelsen af tg(fli:EGFP) zebrafisk øjne giver hurtig indsigt i status for Vaskulaturen, udnytter teknikken stadig ca 20 min af arbejdstid pr. nethinden for en erfaren forsker. Alle disse forberedelsestrin for den retinale Vaskulaturen skal udføres under et dissekere mikroskop og dissectors behov for at bo koncentreret hele tiden som en skødesløs trin kan potentielt inducere fartøj brud. Dissector bør praksis regelmæssigt som længerevarende fravær fra forberedelse reducerer en dissector sandsynligheden for, at fastholde fartøjets integritet.
Desuden er yderligere udlæsning via Immunhistokemi (IHC) stadig begrænset, da kun et lille antal antistoffer valideret på menneskelige og gnaver væv arbejder med zebrafisk. Eksperimentatorer interesseret i IHC rådes til at søge efter zebrafisk-specifikke antistoffer, især når du arbejder med nye mål. Alternativt kan anbefales det at bruge ekstra zebrafisk reporter linjer, som er nyttige at studere celler ud over Vaskulaturen i øjet. Denne strategi, men er tidskrævende, da det tager et par måneder til at generere voksen zebrafisk linjer, som bærer flere transgene journalister.
Ikke desto mindre, zebrafisk udgør en unik vifte af fordele. De er relativt små og reproducere let. De kan vokse til voksen faser hurtigt og deres embryoner er optimal for narkotika-screening. Feltet er let stigende og mere litteratur bliver tilgængelige. Med evnen til at generere gen knockouts på en hurtig hastighed og en overflod af transgenet fluorescens reporter linjer, er valget for zebrafisk kun tilbageholdende af den valgte problemformulering.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Katrin Bennewitz og Marlene Hausner for zebrafisk dyrehold og teknisk bistand. Forfatterne anerkender støtten fra den Core facilitet Live celle Imaging Mannheim i centrum for biomedicin og medicinsk teknologi Mannheim (DFG INST 91027/9-1). Denne undersøgelse blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (International forskning uddannelse gruppe 1874/1 "DIAMICOM", projekt SP5 og SP9; Collaborative Research Center SFB1118, projekt B1 og Collaborative Research Center SFB/TR23 projekt Z5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaOH | Roth | 6771.3 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| CaCl2*6H20 | Roth | 5239.2 | |
| MgSO4*7H20 | Merck | 1.05886.0500 | |
| Paraformaldehyd | Roth | 0335.3 | |
| Sodium dihydrogen phosphate | Roth | 2370.1 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (MS-222,Tricaine) | Sigma | A5040 | |
| PBS | Roth | 9143.1 | |
| Agarose | Roth | 2267.3 | |
| Fluoromount-G | Thermo-Fischer | 00-4958-02 | |
| Petri dish | Greiner Bio one | 633180 | |
| Six-well plate | StarLab | CC7682-7506 | |
| Needle | MSG Praxisbedarf | BD 300900 | |
| Micro Tweezer | World Precision Instruments | 14095 | |
| Microdissection Scissor | World Precision Instruments | 501778 | |
| Glass slide | Carl Roth | H872.1 | |
| Coverslip 22mmx22mm | neoLab | 103512222 | |
| Scalpel | MSG Praxisbedarf | FEA111 | |
| Epi-Illumination | Leica | 10446389 | |
| Fluorescence stereomicroscope MZ10 F | Leica | NA | |
| Confocal laser-scanning microscope SP5 DS | Leica | NA | |
| Stereomicroscope M80 | Leica | NA | |
| Zebrafish line: Tg(fli:EGFP), ABTL wildtype | NA | NA | see Reference 15 |
| Mayer’s hematoxylin | Dr. K. Hollborn & Söhne | 0088663 | |
| 0.5% eosin | Dr. K. Hollborn & Söhne | NA | |
| 99,9% ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Paraffin | Merck | 1,071,501,000 | |
| Xylol | Roth | 4436.2 | |
| Acetone | Emsure | 606-001-00-8 | |
| Microtome RM 2165 | Leica | NA |
References
- WHO. Global report on diabetes. , 88 (2016).
- Lim, A. Diabetic nephropathy - complications and treatment. Int J Nephrol Renovasc Dis. 7, 361-381 (2014).
- Yau, J. W., et al. Global prevalence and major risk factors of diabetic retinopathy. Diabetes Care. 35 (3), 556-564 (2012).
- Cheung, N., Mitchell, P., Wong, T. Y. Diabetic retinopathy. The Lancet. 376 (9735), 124-136 (2010).
- Raymond, N. T., et al. Higher prevalence of retinopathy in diabetic patients of South Asian ethnicity compared with white Europeans in the community: a cross-sectional study. Diabetes Care. 32 (3), 410-415 (2009).
- Heng, L. Z., et al. Diabetic retinopathy: pathogenesis, clinical grading, management and future developments. Diabet Med. 30 (6), 640-650 (2013).
- Writing Committee for the Diabetic Retinopathy Clinical Research, N., et al. Panretinal Photocoagulation vs Intravitreous Ranibizumab for Proliferative Diabetic Retinopathy: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 314 (20), 2137-2146 (2015).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Sharma, K. R., et al. ELMO1 protects renal structure and ultrafiltration in kidney development and under diabetic conditions. Sci Rep. 6, 37172 (2016).
- Baek, J. S., Fang, L., Li, A. C., Miller, Y. I. Ezetimibe and simvastatin reduce cholesterol levels in zebrafish larvae fed a high-cholesterol diet. Cholesterol. , 564705 (2012).
- Elo, B., Villano, C. M., Govorko, D., White, L. A. Larval zebrafish as a model for glucose metabolism: expression of phosphoenolpyruvate carboxykinase as a marker for exposure to anti-diabetic compounds. J Mol Endocrinol. 38 (4), 433-440 (2007).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiol Rev. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kasprick, D. S., et al. Microanatomy of adult zebrafish extraocular muscles. PLoS One. 6 (11), e27095 (2011).
- Gestri, G., Link, B. A., Neuhauss, S. C. The visual system of zebrafish and its use to model human ocular diseases. Dev Neurobiol. 72 (3), 302-327 (2012).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
- Bell, B. A., et al. Retinal vasculature of adult zebrafish: in vivo imaging using confocal scanning laser ophthalmoscopy. Exp Eye Res. 129, 107-118 (2014).
- Avanesov, A., Malicki, J. Analysis of the retina in the zebrafish model. Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).
- Gramage, E., Li, J., Hitchcock, P. The expression and function of midkine in the vertebrate retina. Br J Pharmacol. 171 (4), 913-923 (2014).
- Cao, R., Jensen, L. D., Soll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), e2748 (2008).
- Jorgens, K., Hillebrands, J. L., Hammes, H. P., Kroll, J. Zebrafish: a model for understanding diabetic complications. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 120 (4), 186-187 (2012).
- Alvarez, Y., et al. Predominant cone photoreceptor dysfunction in a hyperglycaemic model of non-proliferative diabetic retinopathy. Dis Model Mech. 3 (3-4), 236-245 (2010).
- Gleeson, M., Connaughton, V., Arneson, L. S. Induction of hyperglycaemia in zebrafish (Danio rerio) leads to morphological changes in the retina. Acta Diabetol. 44 (3), 157-163 (2007).
- Jorgens, K., et al. High tissue glucose alters intersomitic blood vessels in zebrafish via methylglyoxal targeting the VEGF receptor signaling cascade. Diabetes. 64 (1), 213-225 (2015).
- Lai, A. K., Lo, A. C. Animal models of diabetic retinopathy: summary and comparison. J Diabetes Res. 2013, 106594 (2013).
