Cel-autonome functies van genen in de hersenen kunnen worden bestudeerd door het induceren van verlies of winst van functie in dunbevolkte van cellen. Hier beschrijven we in utero electroporation om te Cre recombinase leveren in dunbevolkte corticale neuronen met floxed genen te ontwikkelen om te leiden tot verlies van functie in vivo.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cel-autonome neuronale functies van genen kunnen worden onthuld door het veroorzaken van verlies of winst van de functie van een gen in een kleine en spaarzame bevolking van neuronen. Vereist voor het genereren van een mozaïek waarin neuronen met verlies of winst voor de functie van een gen zijn omringd door genetisch onverstoorbaar weefsel om dit te doen. Hier combineren we het Cre-lox recombinatie systeem met in utero electroporation om te genereren van mozaïek hersenweefsel die kan worden gebruikt voor het bestuderen van de cel-zelfstandige functie van genen in neuronen. DNA constructies (beschikbaar via repositories), codering voor een fluorescerende label en Cre recombinase, worden ingevoerd in de ontwikkeling van de corticale neuronen met genen geflankeerd met loxP sites in de hersenen van muis embryo's met behulp van in utero Electroporation. Daarnaast beschrijven we verschillende aanpassingen aan de in utero electroporation methode waardoor overlevingsvermogen en reproduceerbaarheid. Deze methode omvat ook tot oprichting van een titer voor Cre-gemedieerde recombinatie bij een schaars of dichte bevolking van neuronen. Histologische preparaten van gelabelde hersenweefsel vereisen geen (maar kan worden aangepast aan) immunohistochemistry. De constructies gebruikt garanderen dat label fluorescently neuronen dragen het gen voor Cre recombinase. Histologische preparaten toestaan morfologische analyse van neuronen via confocal beeldvorming van dendritische en axonale arbors en dendritische spines. Omdat verlies of winst van functie in sparse mozaïek weefsel wordt bereikt, wordt deze methode kunnen de studie van cel-autonome noodzaak en de toereikendheid van gene producten in vivo.
Inleiding
Het genereren van een genetische mozaïek is een klassieke experimentele paradigma voor het begrijpen van de functie van een gen van belang. Om te bepalen als een gen noodzakelijk voor een cellulaire fenotype is, wordt de eenvoudigste aanpak veroorzaakt door een verlies van functie van het gen in het organisme (bijvoorbeeld knock-out). Om te bepalen als een gen specifiek in een bepaalde celtype vereist is, is knock-out van het gen in het organisme echter niet een geldige benadering. In plaats daarvan een methode is verplicht die zal leiden tot het verlies van functie van een gen in een bepaalde cel terwijl het wordt omringd door wildtype (dat wil zeggen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité (ACUC) van James Madison University, en zijn overeenkomstig en naleving van alle relevante regelgevend en institutioneel richtsnoeren.
1. muis Set-up
- Huis van een jonge (> P60) mannelijke en vrouwelijke homozygoot floxed muis samen aan het opzetten van een kweker paar25.
Opmerking: Een goede negatieve controle is het opzetten van een paar extra Fokker van wildtype muizen, in welke Cre recombinase expressie niet leiden een mozaïek-26 tot zal. - Toestaan dat de vrouw te bevallen en ver....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De single construeren GFP. CRE (Zie materiaallijst) was electroporated op E15.5 en gevisualiseerd op P14. Afhankelijk van de concentratie van de constructie en de omvang van de injectie, kan een schaars of dichte resultaat worden verkregen van22,26. Bijvoorbeeld injectie van 1 µL van 2 mg/mL GFP. De resultaten van het CRE in een verspreide verdeling van gelabelde cellen, waarvan sommige helder (figuur 1A
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier introduceren we de combinatie van in utero electroporation met Cre recombinase bij floxed muizen voor het genereren van mozaïek hersenweefsel. Een voordeel van deze aanpak is dat een nieuwe lijn van de muis niet hoeft te worden gegenereerd elke keer een verschillende cellulaire subtype is gericht: in utero electroporation kan worden gebruikt om te richten excitatory neuronen, remmende neuronen of glia afhankelijk van de tijd en de locatie van electroporation15,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken de gulle steun van het James Madison University Department of Biology, James Madison Universiteit licht microscopie en de Imaging faciliteit. Dr. Mark L. Gabriele voor nuttig advies met betrekking tot jonge postnatale weefsel voorbereiding, en Drs. Justin W. Brown en Corey L. Cleland voor gulle coördinatie van chirurgische materialen en ruimte. Dit onderzoek werd gedeeltelijk gefinancierd door een gezamenlijke onderzoeksbeurs door 4-VA, een samenwerkingspartnerschap ter bevordering van de Commonwealth van Virginia (G.S.V.), en door een Virginia Academie van Science kleine onderzoek projectsubsidie (G.S.V.). Ondersteuning is royaal ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| C57BL/6J muizen | The Jackson Laboratory | #000664 | Zie "1. Muisopstelling" (stap 1.1, "wildtype muizen") |
| GFP.Cre lege vector | AddGene | #20781 | Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.1 "enkelvoudige DNA-construct die codeert voor Cre-recombinase evenals een fluorescente marker"). GFP.Cre lege vector was een geschenk van Tyler Jacks. |
| pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #69138 | Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.1 "Supernova" systeem) en http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was een geschenk van Takuji Iwasato. |
| pK031.TRE-Cre (Supernova) | AddGene | #69136 | Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.1 "Supernova" systeem) en http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was een geschenk van Takuji Iwasato. |
| pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #85006 | Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.1 "Supernova" systeem) en http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was een geschenk van Takuji Iwasato. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | #12362 | Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.3 "endotoxine-vrije plasmide-zuiveringskit") |
| Trypanblauw poeder, BioReagent-kwaliteit | Sigma | T6146-5G | Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "trypanblauw") |
| Natriumchloride, ACS, 2,5 kg | VWR | BDH9286-2.5KG | Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "NaCl") |
| Kaliumchloride, ACS, 500 g | VWR | #97061-566 | Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "KCl") |
| Natriumfosfaat dibasisch, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | S0876-100G | Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "Na2HPO4") |
| Kaliumfosfaat monobasisch, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | P5379-100G | Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "KH2PO4") |
| Zoutzuur, ACS-reagens, 500 mL | Fisher Scientific | A144-500 | Zie "2. DNA-opstelling" (stap 2.5 "HCl") |
| P-97 Micropipet Puller | Sutter Instrument | P-97 | Zie "3. Pipet-opstelling" (stap 3.1 "glas capillaire puller") |
| 3,0 mm brede trog gloeidraad | Sutter Instrument | FT330B | Zie "3. Pipet-opstelling" (stap 3.1 "glas capillaire puller") |
| Dünnwandige Glaskapillaren, 4", 1 / 0,75 OD/ID | World Precision Instruments | TW100-4 | Zie "3. Pipet-opstelling" (stap 3.1.1 "glas capillair") |
| Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" | Phenix | LW-8148 | Zie "3. Pipet-opstelling" (stap 3.2.1 "single-ply taakdoek"); andere single-ply doeken (bijv. Kimwipes) kunnen worden gebruikt. |
| Graefe-pincetten, 7 cm, recht, 0,7 mm 1x2 tanden | World Precision Instruments | #14140 | Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "Graefe-pincetten") |
| Iris-schaar, 11,5 cm, recht, 12-pack | World Precision Instruments | #503708-12 | Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "iris-schaar") |
| Hartman-muggenpincetten, 9 cm, recht, 12-pack | World Precision Instruments | #503728-12 | Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "Hartman-muggenpincetten") |
| Algemene niet-geweven sponzen, 2" x 2", 4-laags | Medrepexpress | #2204-c | Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "niet-geweven gaas sponzen") |
| Ring-tip-pincetten, 10 cm, recht, 2,2 mm ID | World Precision Instruments | #503203 | Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "ring-tip-pincetten") |
| Pyrex petrischalen compleet, O.D. × H 100 mm × 20 mm | Sigma-Aldrich | CLS3160102-12EA | Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "Petrischalen") |
| Vlak type instrumentenbak, roestvrij staal, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" | Amazon | B007SHGAHA | Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.1 "roestvrij stalen bak") |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm | BTX | #45-0489 | Zie "4. In utero elektroporatie" (stap 4.3 en 4.16 "pincet-type elektroden") |
| ECM 830 vo |
Referenties
- Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genot....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
