Summary
Cella-autonome funzioni dei geni nel cervello possono essere studiate inducendo perdita o guadagno di funzione in popolazioni sparse delle cellule. Qui, descriviamo in utero elettroporazione per consegnare la Cre ricombinasi nelle popolazioni sparse di sviluppare neuroni corticali con floxed geni per causare la perdita di funzione in vivo.
Abstract
Cella-autonome funzioni neuronali dei geni possono essere rivelate causando perdita o guadagno di funzione di un gene in una popolazione di piccola e sparsa di neuroni. Per effettuare questa operazione richiede la generazione di un mosaico in cui i neuroni con perdita o guadagno di funzione di un gene sono circondati da tessuto geneticamente imperturbato. Qui, uniamo il sistema di ricombinazione di Cre-lox con elettroporazione nell'utero al fine di generare tessuto cerebrale mosaico che può essere utilizzato per studiare la funzione delle cellule-autonoma dei geni nei neuroni. Costrutti del DNA (disponibili nei repository), che codifica per un'etichetta fluorescente e la Cre ricombinasi, vengono introdotti nello sviluppo di neuroni corticali contenenti geni affiancati con siti loxP nei cervelli degli embrioni del mouse utilizzando in utero elettroporazione. Inoltre, descriviamo vari adattamenti per il metodo di elettroporazione nell'utero che aumentano la sopravvivenza e la riproducibilità. Questo metodo coinvolge anche stabilire un titolo per ricombinazione Cre-mediata in una rada o densa popolazione di neuroni. Preparati istologici del tessuto cerebrale con etichetta non richiedono (ma può essere adattati a) immunohistochemistry. I costrutti utilizzati garantiscono che fluorescente etichettati neuroni trasportare il gene per la ricombinasi Cre. Preparati istologici consentono analisi morfologica dei neuroni confocale imaging delle pergole dentritici ed axonal e spine dendritiche. Perché perdita o guadagno di funzione è realizzato in tessuto di tipo sparse mosaico, questo metodo consente lo studio delle necessità delle cellule autonome e la sufficienza della gene prodotti in vivo.
Introduction
Generando un mosaico genetico è un classico paradigma sperimentale per comprendere la funzione di un gene di interesse. Per determinare se un gene è necessario per un fenotipo cellulare, l'approccio più semplice è causando una perdita di funzione del gene in tutto l'organismo (ad es. ad eliminazione diretta). Tuttavia, per determinare se un gene è necessaria in particolare in un determinato tipo di cellula, knockout del gene in tutto l'organismo non è un approccio valido. Al contrario, è necessario un metodo che causerà la perdita di funzione di un gene in una determinata cella mentre è circondato da tessuto wildtype (cioè geneticamente imperturbata) — in altre parole, creare mosaico tessuto. Se la cellula mutante Mostra un fenotipo mutante, ma non di cellule wildtype circostanti, le funzioni del gene in maniera autonoma delle cellule. L'analisi del tessuto del mosaico, in cui le cellule mutanti sono circondate da tessuto wildtype, è ideale per la comprensione delle cellule autonome funzioni dei geni, in particolare nel cervello dove i neuroni e cellule gliali formano una vasta rete interconnessa di tessuto.
Diverse forme di tessuto cerebrale mosaico hanno fornito modelli potenti per indagare le funzioni delle cellule-autonoma di geni. Studi incentrati su trapianto neuronale1, mosaicismo femminile legato al X2,3,4, ed endogeno mosaicism somatico5,6 hanno attirato loro conclusioni basate su mosaico tessuto cerebrale. Eliminazione condizionale di un gene attraverso il sistema di ricombinazione di Cre-lox è un metodo che sfrutta al meglio la grande disponibilità di linee di topi transgenici. In questo metodo, vengono introdotti due siti loxP su entrambi i lati di una necessaria sequenza di un gene (ad esempio di un esone), lasciandola affiancato da siti loxP che entrambi si affacciano nella stessa direzione ("floxed"). Cre ricombinasi accise la sequenza tra i siti loxP7. Ricombinazione cre-mediata può essere ottenuta da incrocio floxed topi a un'altra linea di mouse che esprimono Cre ricombinasi insieme con un marcatore fluorescente in un sottogruppo di cellule ("Cre reporter linea"). Questo è stato dimostrato in una varietà di modi per scoprire le funzioni di un gene in sottoinsiemi di cellule, quali i neuroni eccitatori o astrociti8. Linee di cre reporter possono esprimere CreERT2 per consentire la ricombinazione Cre-mediata di essere farmaco-inducibile (singoli neuroni etichettatura con knockout inducibile Cre-mediata, o SLICK)9. Un'altra strategia chiamato analisi di mosaico con doppio marker (MADM)10,11, ricombinazione di interchromosomal Cre-mediata consente un omozigote mutante deve essere creato a fianco del tessuto eterozigotico. In questi approcci, una nuova linea di topi deve essere prodotta ogni volta per ogni gene candidato o sottotipo cellulare che viene testato. In alternativa, Cre ricombinasi possono essere introdotto dopo la nascita tramite ionoforesi12 o tramite vettori virali (ad es. virus adeno-associato13 o lentivirus14 trasporto cellulari sottotipo-specifici promotori). Questa strategia crea etichettatura forte e postnatale. Per indirizzare lo sviluppo di neuroni corticali cerebrali scarsamente e prenatally, una strategia ideale è nell'utero elettroporazione di Cre ricombinasi con un marcatore fluorescente.
Oltre alla ricombinazione di Cre-lox attraverso elettroporazione nell'utero per produrre la combinazione del mosaico del tessuto in vivo, vi presentiamo diversi adattamenti alle procedure da altri protocolli pubblicati15,16, 17,18,19,20,21. Forniamo informazioni per migliorare il successo nel tempo-incinta femmine riproduttrici. Descriviamo anche i nostri due strategie per introdurre l'etichettatura dei neuroni nel tessuto corticale sparse e brillante: una strategia consiste nel titolo i livelli di un singolo costrutto che codifica per la Cre ricombinasi e un marcatore fluorescente22. Un'altra strategia consiste nell'utilizzare il sistema di "Supernova", progettato specificamente per questi parametri in mente23,24. Inoltre, offriamo miglioramenti sulla produzione coerente microiniezione pipette e semplificazioni per la chirurgia di elettroporazione nell'utero . Infine, abbiamo delineare fasi critiche in una preparazione istologica semplificata che consente l'analisi delle spine dendritiche e pergole dentritici ed axonal, senza ulteriore colorazione o immunohistochemistry.
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Protocol
Metodi descritti qui sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato (ACUC) di James Madison University e sono in accordo e in conformità con tutte le pertinenti orientamenti normativi e istituzionali.
1. Mouse set-up
- Un giovane della casa (> P60) maschio e femmina omozigote floxed mouse insieme per impostare un allevatore coppia25.
Nota: Un buon controllo negativo è quello di impostare un paio di ulteriori allevatore di topi selvatici, in quale Cre espressione ricombinasi non causerà un mosaico26. - Consentire la donna a partorire e aumentare la sua prima cucciolata con l'uomo. Tenere il maschio con la femmina per aumentare la sopravvivenza di lettiera. Dopo lo svezzamento la lettiera, per esempio al giorno postnatale (P) 21, separa il maschio e la femmina.
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Allevamento di murino
- Impostare un tempo accoppiamento tra il maschile e femminile25. Utilizzare segnali visivi per determinare il ciclo di estro della femmina27e controllare per spine vaginali la mattina dopo l'accoppiamento25.
- Se viene trovata una spina, separare e pesare la femmina. Contare il giorno come giorno embrionale (E) 0,5.
- Continuare a pesare la femmina ogni 3-5 giorni per determinare se è incinta. Le femmine gravide avranno un aumento di 10-20% del peso corporeo 7-10 giorni dopo il concepimento (E0).
Nota: Questo passaggio conferma la gravidanza prima e in modo più affidabile rispetto a controllo visivo25. - Se la donna non è incinta, ripetere i passaggi 1.3.1-1.3.3.
- Una volta confermata la gravidanza, scegli la data dell'elettroporazione nell'utero . Per impostare come destinazione progenitori neuronali piramidali corticali di strato II/III, eseguire elettroporazione presso E15.5.
2. set-up DNA
- Scegliere un singolo DNA costruire quello codici per Cre ricombinasi, nonché un marcatore fluorescente, come ad esempio la proteina fluorescente verde (GFP)28,29. In alternativa, utilizzare il sistema di "Supernova", descritto in dettaglio nel precedente Pubblicazioni23,24. Vedere elenco dei materiali ad esempio costrutti.
- Amplificare il DNA construct(s) dal punto 2.1 in e. coli usando tecniche microbiologiche standard30.
- Purificare il costrutto di DNA con un kit di purificazione del plasmide privo di endotossina seguendo le istruzioni del produttore. Eluire il costrutto con acqua priva di endotossina.
Nota: La scelta di un kit di purificazione dell'endotossina-libero sopra un kit di purificazione standard è fondamentale. - Concentrare l'eluato di DNA per 1-3 mg/mL a seconda del desiderato d'etichettatura densità26.
Nota: Un titolo deve sempre essere stabilito quando si lavora con un nuovo costrutto di DNA, dato che hanno diverse lunghezze e promotori. Prendere in considerazione l'iniezione di un costrutto a diverse concentrazioni differenti e/o importi per valutare l'espressione. Ad esempio, l'iniezione di 1 µ l o 1,5 µ l di 2,0 mg/mL GFP. Cre è in grado di causare Radi (1 µ l) o denso (1,5 µ l) etichettatura dello strato II/III visiva corticale neuroni piramidali26. - Aggiungere 0,4% trypan blu in 1x tamponato fosfato salino (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mm Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 in H2O, regolata a pH 7.4 con HCl) 01:10 alla soluzione concentrata del DNA.
- Aggiungere 10 x PBS 01:10 la soluzione concentrata di DNA.
- Conservare la soluzione di DNA concentrata a 4 ° C. La soluzione può essere conservata a tempo indeterminato.
3. Dispensare set-up
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Utilizzando un estrattore capillare di vetro, tirare una pipetta con una lunga punta conica e molto fine (10-15 mm), tipica delle pipette per iniezione di cellule staminali embrionali o trasferimento nucleare31.
Nota: Per impedire la contaminazione le pipette di detriti, essi devono essere effettuate entro 2 giorni dell'ambulatorio.- Calibrare l'estrattore capillare di vetro eseguendo un test di rampa, seguendo le istruzioni del produttore. Uso il risultante valore di calore per programmare un tirando protocollo utilizzando i seguenti parametri: calore = (valore di prova di rampa + 15), tirare = 30, vel = 120, tempo = 100, pressione = 200. Inserire il capillare di vetro, fissare ai morsetti su estrattore e attivare il protocollo trazione programmato, creando un cono il capillare di vetro.
- Assicurarsi che la lunghezza del conica è tra 10-15 mm utilizzando un microscopio ottico composto (per esempio 10 obiettivo X)31.
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Indietro rompere la pipetta per formare una punta quadra grezzo a 20-25 µm di diametro.
- Centrare un wipe monostrato attività (Vedi elenco dei materiali) oltre un 50 mL Becher e tratto pulire tesi con una mano. Con l'altra mano, afferrare e spingere una pipetta (cono rivolto verso il basso) perpendicolarmente e completamente attraverso il centro della transizione, causando una rottura pulita nel cono31.
Nota: Spingendo la pipetta completamente attraverso la cancellazione produrrà una punta di diametro di 20-25 µm circa il 70% del tempo. - Confermare al microscopio ottico composto (ad es. obiettivo 20x).
Attenzione: Indossare occhiali di protezione durante la rottura del vetro.
- Centrare un wipe monostrato attività (Vedi elenco dei materiali) oltre un 50 mL Becher e tratto pulire tesi con una mano. Con l'altra mano, afferrare e spingere una pipetta (cono rivolto verso il basso) perpendicolarmente e completamente attraverso il centro della transizione, causando una rottura pulita nel cono31.
- Calibrare una pipetta da aspirante 1 µ l di 0,4% trypan blu in 1X PBS in un piptte parzialmente riempita, quindi la pipetta con le marcature di 1 µ l di laurea base all'altezza di 1 µ l nella pipetta, usando un pennarello resistente all'alcool punta fine. Utilizzare la pipetta calibrata per laurearsi le pipette di altre prima di eliminarli. Tenere pipette in un supporto di pipetta esente da polvere e altre particelle.
4. nell'Utero elettroporazione
- Posto Graefe forcipe, forbici iris, Hartman pinza mosquito, spugne garza di tessuto non tessuto, con punta anello forcipe e capsule di Petri su un vassoio in acciaio inox e avvolgere con carta stagnola. Posizionare il vassoio e 1 L 0,9% soluzione fisiologica (0,9% wt/vol NaCl in acqua) in autoclave. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C e 3,5 kPa per 40 min. rimuovere dall'autoclave e collocare in un'area chirurgica disinfettata.
Nota: È fondamentale per mantenere condizioni di sterilità durante l'intervento chirurgico. - Riscaldare la bottiglia di Salina 1 L in autoclave in un bagno piccolo acqua a 38 ° C per almeno 2 h prima della chirurgia.
- Collegare gli elettrodi di tipo pinzette e il pedale al generatore (vedere elenco dei materiali). Seguendo le istruzioni del produttore, impostare il generatore per consegnare cinque 50 ms impulsi di 50 V (con un intervallo di 950 ms) quando attivato mediante il pedale. Disinfettare la pinzetta-tipo di elettrodi e posto sulla zona chirurgica disinfettata.
- Fare un cono di naso di anestesia come precedentemente pubblicati32, ma utilizzare l'estremità di un nitrile o dito del guanto di lattice per formare un diaframma che si adatta saldamente sopra l'apertura del cono di naso. Tagliare un buco nel diaframma abbastanza grande per adattarsi sopra il muso del mouse.
- Profondamente anestetizzare incinto topi ad E15.5 in una camera di induzione riempita con isoflurano (2-4%) in ossigeno puro che fluisce ad 1 L/min. Dopo ~ 1 min, prova il riflesso di raddrizzamento (delicatamente la camera di induzione di inclinazione e assicurarsi che il mouse non giusto per sé). Pesare il mouse per determinare i dosaggi di analgesia amministrato più successivamente durante l'intervento chirurgico.
- Trasferire il mouse l'area chirurgica e amministrare inalato isoflurano (1-2%) in ossigeno puro che fluisce ad 1 L/min attraverso un cono di naso per mantenere il mouse in aereo chirurgica. Utilizzare pinze per testare il riflesso pedale (pizzicare delicatamente la zampa e assicurarsi che il mouse non viene restituito un riflesso) per verificare amputate. Monitorare la frequenza respiratoria e sforzo, cercando di regolare respirazione profonda (~ 70-100 respiri/min), e che le mucose sono colore rosa e umida.
- Applicare abbastanza veterinario unguento oftalmico sopra gli occhi per coprirle completamente per protezione contro l'essiccazione durante la procedura.
- Flex il disco di metallo attivatore di un sacchetto sigillato pieno di sovrasatura soluzione salina (vedere elenco dei materiali), attivando una cristallizzazione esotermica del sale. Porre 2 salviettine imbevute di attività monostrato in cima il sacchetto e posizionare il mouse sulla busta per mantenere la temperatura corporea.
- Massaggiare la crema depilatoria sulla zona addominale con tamponi di cotone fino a pelliccia addominale si dissolve (circa 20-40 s), quindi togliere pelliccia addominale. Pulire accuratamente fuori qualsiasi crema restante residuo e depilatoria con tamponi di cotone e di etanolo 70%. Posizionare un telo chirurgico sterile fenestrato sull'area addominale.
- Utilizzando una tecnica asettica, tirare la pelle in alto e lontano dal addome con il forcipe di Graefe e fare un'incisione ventrale del midline ~ 2 cm sulla pelle utilizzando forbici iris, assicurando che il muscolo sottostante non sia tagliato.
Nota: Un'alternativa accettabile per fare un'incisione con le forbici pinze e iris Graefe consiste nell'utilizzare un bisturi, come precedentemente pubblicato17. - Trovare la linea alba, per visualizzare la linea mediana del rectus abdominis. Sollevare il muscolo ed dall'addome con il forcipe di Graefe e fare un'altra incisione del midline di ~ 2 cm ci con forbici iris, esponendo la cavità addominale (l'utero è traslucido ed embrioni sarà visibili sotto). Assicurarsi che non sia tagliata alla base del tessuto uterino e intestinale. Effettuare l'incisione solo abbastanza grande (in genere ~ 2 cm) per tirare fuori ed esporre l'utero comodamente.
Nota: Un'alternativa accettabile per fare un'incisione con le forbici pinze e iris Graefe consiste nell'utilizzare un bisturi, come precedentemente pubblicato17. - Utilizzando una punta sterile di 10 µ l della micropipetta, dispensare carprofen (disciolto in soluzione fisiologica 0,9% sterile) a 4 mg/kg nella cavità addominale per analgesia.
- Bloccare una pinza mosquito di Hartman sul bordo sinistro dell'incisione di abdominis del rectus. Riposare il forcipe su rovesciata di Petri a sinistra dell'incisione, tenendo la sinistra dell'incisione aperta. Bloccare un'altra pinza mosquito di Hartman sul bordo destro dell'incisione di abdominis del rectus e riposare il forcipe su una rovesciata di Petri a destra dell'incisione, tenendo il lato destro dell'incisione aperta. Posizionare garze spugna intorno alla zona dell'incisione.
- Mezzo anello forcipe (senza una vite di finecorsa allegata), tirare l'utero tra qualsiasi due embrioni vicini senza schiacciare o ferire qualsiasi tessuto. Inizia tirando fuori tutti gli embrioni attraverso l'incisione, appoggiandole sopra la garza spugna. Quando si tira fuori l'ultimi embrioni dalla cavità addominale, assicurarsi di non tirare le ovaie o la cervice. Una volta esposto, è fondamentale per mantenere l'utero umido con soluzione salina calda. L'utero contiene in genere tra 5 e 8 embrioni.
Nota: È possibile aggiungere penicillina e streptomicina al Salina17. - Collegare una pipetta calibrata per l'Assemblea di tubo aspiratore (vedere elenco dei materiali) e iniettare esattamente 1 µ l della soluzione di DNA preparata nel passaggio 2 tramite la parete uterina in un ventricolo laterale di ciascun embrione. Ventricoli laterali appaiono come due patch il telencefalo dorsale dell'embrione (le patch sono più scure del tessuto del telencefalo circostante). È possibile utilizzare il pollice e l'indice durante la microiniezione ed elettroporazione per manipolare gli embrioni, rivelando i ventricoli laterali e permettendo gli embrioni essere spinto delicatamente contro la parete uterina durante l'iniezione. Confermare successo iniezione osservando trypan blu di riempimento del ventricolo laterale.
- Posizionare il catodo di pinzette-tipo di elettrodi (Vedi elenco dei materiali) sull'utero, direttamente sopra la corteccia mediale e caudale per indirizzare la corteccia visiva (targeting aree alternative del cervello richiederà posizionamento elettrodo diverso)16, 26. Posto l'anodo sull'utero, appena inferiore e anteriore testa dell'embrione.
- Confermare che l'anodo e il catodo stanno toccando l'utero che circonda l'embrione in posizioni appropriate. Con un pedale del piede, innescare la consegna di cinque 50 ms impulsi di 50 V (con un intervallo di 950 ms) attraverso gli elettrodi.
Nota: Iniettata, caricati negativamente DNA si sposterà verso il catodo e sarà incorporato nella zona ventricolare cellule più vicina al catodo. - Restituire l'utero alla cavità addominale nello stesso orientamento che è stato trovato. Utilizzare soluzione salina per lubrificare l'utero mentre guidandolo manualmente e molto delicatamente, facendo attenzione a non per spostare gli embrioni dalla loro posizione nell'utero.
- Chiudere i muscoli addominali con suture assorbibili (vedere elenco dei materiali) usando un semplice punto interrotto, legando le estremità con un nodo del chirurgo. Non non clip che le estremità troppo vicino al nodo o il nodo diventerà slacciato.
Nota: È fondamentale alla sutura dei muscoli addominali tale che i bordi della ferita sono completamente chiuso chiuso, ma senza causare scottatura del muscolo. Nodi devono essere stretti quindi non possono essere slacciate. - Chiudere lo strato della pelle con suture assorbibili (punto di interruzione semplice, nodo del chirurgo, come descritto al punto 4.19). Applicare una piccola quantità di tessuto adesivo per sigillare la ferita. Applicare l'adesivo del tessuto sui nodi per prevenire slacciare. Utilizzare una micropipetta per rimuovere qualsiasi adesivo del tessuto che circonda la ferita che può essere aspirata dalla micropipetta.
- Abbassare i livelli di isoflurano a 0,5-1,5%. Una volta che l'adesivo del tessuto è a secco (prova toccando guanto ad adesivo), rimuovere da isoflurane e consentire femmina a recuperare da soli in una gabbia calda. Amministrare la buprenorfina per via intraperitoneale a 0,03 mg/kg con una siringa da 1 mL con un 26G, ½" dell'ago.
- Continuare a monitorare il mouse fino a quando il mouse è completamente recuperato e comportarsi normalmente (cioè governare, esplorare la gabbia, mangiare o bere). Una volta recuperato, posto femminile torna in gabbia con il maschio.
Nota: Se tutti i passaggi sono seguiti, il mouse in genere riprendere coscienza entro 2 min e immediatamente iniziare a muoversi per la gabbia, non mostra segni di disagio. - Se il mouse presenta segni di disagio (ad es. curvato postura, le secrezioni della porfirina)33, amministrare carprofen a 0,1 mg/mL nel rifornimento idrico. Se sono presenti diversi segni di disagio, o se il malessere persiste per più di 4 h malgrado la gestione di carprofen, immediatamente eutanasia il mouse con la somministrazione di un'iniezione letale intraperitoneale di ketamina (240 mg/kg) - xilazina (48 mg/kg)- cocktail di acepromazina (1,85 mg/kg) utilizzando una siringa da 1 mL con un 26 G, ½" ago e seguire con una forma secondaria approvata di eutanasia33.
- Per aumentare la sopravvivenza degli embrioni individulamente dopo la nascita, è necessario tenere la gabbia in una zona tranquilla che tiene ambiente privo di rumori e vibrazioni. Arricchire l'ambiente con igloo plastica, materiali di nidificazione e integratori alimentari come semi di girasole (Vedi elenco dei materiali). Non spostare o disturbare la gabbia, specialmente durante i primi 3 giorni dopo il parto.
5. istologico preparazione per microscopia a fluorescenza
Nota: Questo protocollo di istologia è ottimizzato per la preparazione del tessuto da animali oltre giorno postnatale (P) 13 anni di età che erano individulamente in utero. Per preparare il tessuto da più giovani animali postnatali (P0-P13), si consiglia di seguire tutti i passaggi (tra cui perfusione perfusione), anche se il cervello deve essere incorporato nell'agar prima di preparare sezioni (passo 5,9). Tessuto può anche essere preparato dagli embrioni entro 1-2 giorni dopo l'elettroporazione, utilizzando i metodi descritti precedentemente18,20.
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Preparare la soluzione di paraformaldeide (PFA).
Nota: È fondamentale per preparare fresco PFA, entro un giorno dell'esperimento.
Attenzione: Paraformaldeide è tossico e deve essere gestito in una cappa aspirante con opportuni dispositivi di protezione personali.- Per fare 50 mL di 4% PFA, 40 mL di acqua di calore a 60 ° C. Aggiungere 2 g PFA continuando a mescolare con barra di vetro asta o agitazione. Aggiungere 10 µ l di NaOH 10 M ogni 2 min fino a PFA si scioglie.
- Aggiungere 5 mL di PBS 1x 10 e portare la soluzione ad un volume finale di 50 mL con acqua.
- Dopo aver portato soluzione a 50 mL, regolare il pH a 7,4 come necessario con una soluzione di HCl. Consenti di 10 M per raffreddare e conservare a 4 ° C.
- Eutanasia del mouse con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (240 mg/kg) - xilazina (48 mg/kg) - con una siringa da 1 mL con un 26G, ½" ago acepromazina (1,85 mg/kg) cocktail. Via irrorare 10 o 20 mL ghiacciata 1X PBS, seguita da 25 o 40 mL preparati, ghiacciata 4% PFA17. Utilizzare volumi inferiori per giovani postnatale (P0-P13) topi e maggiori volumi per più vecchi topi (P14 e sopra).
- Immediatamente dopo l'aspersione, decapita la carcassa del mouse fra l'osso occipitale e la vertebra C1 con grandi forbici e staccarsi e scartare la maggior parte della pelle che circonda il cranio utilizzando forbici iris, particolarmente della pelle occipitale, parietale e frontale circostante ossa. Mantenere intatto il cranio e il cervello.
- Posizionare il cranio e il cervello in 10 mL 4% PFA in una provetta conica da 50 mL per 24 h a 4 ° C per post-Difficoltà tessuto. Quindi aggiungere 30 mL di PBS 1x tubo conico per diluire la soluzione all'1% PFA per conservazione a 4 ° C.
Nota: Utilizzare un tubo conico separato per ogni cranio e il cervello post-fissato. Non Incubare il cervello in 1% PFA per più di 2 settimane, o fluorescenza inizierà a svanire. - Posto il cervello e cranio su una superficie piana con salviette attività inumiditi con 1x PBS monostrato. Utilizzare un paio di pinzette (vedere elenco dei materiali) per rimuovere qualsiasi residuo della pelle o membrana che circonda il cranio.
- Con una pinzetta, prima rimuovere l'osso occipitale, quindi rimuovere con cautela le ossa parietali, spostando le pinzette fuori e lontano dalla superficie del cervello. Rimuovere con cautela le meningi per evitare danni alla corteccia.
- Sul retro delle pinzette a cuneo sotto il cervello lungo il cranio di recidere ogni nervi cranici e rimuovere il cervello.
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Per giovani postnatale (P0-P13) cervelli
- Fare 25 mL di agar di 4% di riscaldamento 25 mL di PBS 1X a 80 ° C. Mescolare e sciogliere 1 g di agar con una barra di vetro asta o agitazione).
- Soluzione fredda a 35 ° C, pur continuando a mescolare. Mettere il cervello in un piccolo contenitore (ad esempio il tappo di una provetta conica da 50 mL) e versare la soluzione di agar sul cervello. Consentire l'agar indurire.
- Fare un taglio corona manualmente utilizzando una lama di rasoio tagliente attraverso il cervello, circa 0,5 mm rostrale di bregma. Fare un altro taglio corona attraverso il cervello circa 0,5 mm caudale alla corteccia visiva. Posizionare un pool di colla del cianoacrilato con lo stesso diametro estremità rostrale del cervello sul centro del disco di preparato microtomo vibrante. Posizionare l'estremità rostrale del cervello sopra la piscina di colla, assicurando che l'intera superficie rostrale del tessuto è associata al disco di preparato con colla.
- Montare il tampone sul microtomo a vibrazione e fissarlo con leva di bloccaggio incorporato. Inserire la lama nel portalama e montare portalama sul microtomo con vite di bloccaggio incorporato di vibrazione. Fissare il disco di preparato con il cervello sul tampone utilizzando il dispositivo di bloccaggio incorporato. Impostazione della velocità impostata a 5.70 (= 0.285 mm/s) e impostazione della frequenza di 5,33 (53,3 Hz).
- Riempire la camera sopra il livello del cervello con PBS 1X e abbassare la lama in PBS. Cominciare a prendere 100 µm sezioni coronali attraverso il tessuto.
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Se non che richiedono un'ulteriore elaborazione, ad esempio 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) macchiatura nucleare o immunohistochemistry.
- Utilizzare un pennello punta fine per trasferire sezioni direttamente dal microtomo vibra su un vetrino da microscopio, raccordo 4-6 sezioni in ogni diapositiva.
- Consentire le sezioni asciugare wicking lontano soluzione con un pennello punta fine, tale che le fette di cervello non deriva non più sulle diapositive.
- Quindi, mettere una goccia di liquido di montaggio (vedere elenco dei materiali) su ogni sezione della diapositiva.
- Delicatamente adagiarvi un vetrino coprioggetto 24 x 50 mm, non assicurando che 1) bolle d'aria forma sulle sezioni, 2) le sezioni non si muovono, e 3) il montante completamente copre l'area tra la diapositiva e il vetrino coprioggetti. Consentire il montante curare per almeno 24-48 h.
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A macchiare i nuclei con DAPI per esame istologico delle lamine corticali
- Utilizzare un pennello punta fine per trasferire ogni sezione in una soluzione contenente 10 µ g/mL DAPI (vedere elenco dei materiali) diluito in PBS 1x da soluzione madre (20 mg/mL DAPI in acqua).
- Incubare in soluzione DAPI per 5 min a temperatura ambiente, quindi utilizzare un pennello punta fine per trasferimento sezione da soluzione DAPI a 1X PBS e incubare in PBS 1X per 5 min a temperatura ambiente. Trasferimento sezione due volte più di PBS 1X fresco per 5 minuti ciascuno. Quindi, utilizzando un pennello punta fine, trasferimento la sezione su un vetrino da microscopio, seguire i passi 5.11.2-5.11.4 e procedere con il passaggio 5.13.
- Scaldare una piastra Petri vetro contenente Valap (parti uguali vaselina, lanolina e paraffina) su un piatto caldo a un calore moderato fino a quando completamente sciolto. Guarnizione esposti bordi di diapositive spazzolando il fuso Valap.
- Per ispezionare la fluorescenza nel tessuto, utilizzare un microscopio ottico o microscopio confocale (vedere elenco dei materiali) e un set di filtri adeguati per la visualizzazione il fluoroforo (ad es. DAPI: eccitazione 325-375 nm, emissione 435-485 nm; GFP: eccitazione 450-490 nm, emissione 500-550 nm)17. Immagini confocal possono essere preso con basso - (4 X, apertura numerica, NA = 0.20), medium-(20 X, NA = 0,75) e ad alta potenza (60 X, NA = 1.40) obiettivi.
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Representative Results
Il singolo costrutto GFP. CRE (vedere elenco dei materiali) era individulamente presso E15.5 e visualizzati a P14. A seconda della concentrazione del costrutto e il volume di iniezione, un risultato rado o denso può essere ottenuto22,26. Ad esempio, l'iniezione di 1 µ l di 2 mg/mL GFP. Cre risultati in una distribuzione sparsa delle cellule con etichettate, alcuni dei quali possono essere luminoso (Figura 1A) e localizzata a livello II/III (Figura 1B). Perché il tessuto è 100 µm di spessore, la maggior parte delle pergole dendritiche sono conservata (Figura 1). Le spine dendritiche possono essere osservate ad alti ingrandimenti (60 X; Figura 1). Iniezione di 1,5 µ l alla stessa concentrazione si traduce in molto denso etichettatura (Figura 2A) nel livello II/III (Figura 2B), che può essere sub-ottimale, come è difficile rintracciare l'origine dei neuriti e delle spine dendritiche (Figura 2). Tuttavia, è ancora possibile all'immagine di un neurone (Figura 2D) e dei suoi processi (Figura 2E) selezionando una cella luminosa nella periferia della zona con etichetta (Figura 2D).
Infine, è possibile massimizzare la luminosità dei neuroni pur mantenendo una distribuzione sparsa delle cellule con etichettate. Qui, Supernova-GFP (vedere elenco dei materiali) era individulamente presso E15.5 e visualizzato al P23. Si noti che, sulla base delle osservazioni del tessuto di cervello preso alle varie età postnatale, non sembra essere un effetto dell'età sulla luminosità di qualsiasi costrutti fluorescente utilizzato qui23,24,26. Iniezione di 1 µ l di una miscela contenente 1 mg/mL Sn-GFP (CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE) e 10 µ g/mL TRE-Cre risultati in una distribuzione sparsa delle cellule per lo più brillanti (Figura 3A) nel livello II/III (Figura 3B). È possibile visualizzare processi dentritici ed axonal (Figura 3B) e spine dendritiche (Figura 3). Nella nostra esperienza, il targeting sia con un singolo costrutto come GFP. Cre o con "Supernova" costrutti riproducibile resa di espressione in almeno il 75% degli embrioni individulamente.
Figura 1: Sparse e brillante espressione dopo nell'utero elettroporazione con un singolo costruire contenenti GFP e Cre ricombinasi. (A) micrografo di fluorescenza di basso ingrandimento (4x) della corteccia cerebrale alle P23, dopo elettroporazione presso E15.5. (B) medio-ingrandimento (X 20) fluorescenza micrografo di macchia nucleare DAPI, rivelando laminazione corticale (livelli I, II/III, IV e strati profondi a IV). (C) micrografo di fluorescenza di ingrandimenti medio (X 20) di un singolo neurone. (D) micrografo di fluorescenza ad alto ingrandimento (60 X) delle spine dendritiche. Scala bar = 200 µm (A); 100 µm (B, C); e 5 µm (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Denso e brillante espressione dopo nell'utero elettroporazione con un singolo costruire contenenti GFP e Cre ricombinasi. (A) micrografo di fluorescenza di basso ingrandimento (4x) della corteccia cerebrale a P14, dopo elettroporazione presso E15.5. (B) medio-ingrandimento (X 20) fluorescenza micrografo di macchia nucleare DAPI, rivelando laminazione corticale (livelli I, II/III, IV e strati profondi a IV). (C) micrografo di fluorescenza di ingrandimenti medio (X 20) dei neuroni nella zona di etichettatura più densa. (D) micrografo di fluorescenza di ingrandimenti medio (X 20) dei neuroni preso alla periferia della zona di etichettatura più densa. (E) micrografo di fluorescenza ad alto ingrandimento (60 X) delle spine dendritiche. Scala bar = 200 µm (A); 100 µm (B, C, D); e 5 µm (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Sparse e brillante espressione dopo nell'utero elettroporazione con Supernova-GFP costrutti contenenti GFP e Cre ricombinasi. (A) micrografo di fluorescenza di basso ingrandimento (4x) della corteccia cerebrale a P14, dopo elettroporazione presso E15.5. (B) medio-ingrandimento (X 20) fluorescenza micrografo di macchia nucleare DAPI, rivelando laminazione corticale (livelli I, II/III, IV e strati profondi a IV). (C) micrografo di fluorescenza di ingrandimenti medio (X 20) di un singolo neurone. (D) micrografo di fluorescenza ad alto ingrandimento (60 X) delle spine dendritiche. Scala bar = 200 µm (A); 100 µm (B, C); e 5 µm (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui, presentiamo la combinazione dell'elettroporazione in utero con Cre ricombinasi nei topi floxed per generare tessuto cerebrale mosaico. Un vantaggio di questo approccio è che una nuova linea di mouse non ha bisogno di essere generata ogni volta un diverso sottotipo cellulare deve essere mirata: elettroporazione in utero può essere utilizzato per indirizzare i neuroni eccitatori, neuroni inibitori o glia a seconda del periodo e la posizione di elettroporazione15,16,17,18,19,20,21,34. Nel nostro approccio, targeting della corteccia cerebrale è coerente e riproducibile perché usiamo elettrodi di elettroporazione del diametro di 5 mm che possono essere posizionati su una vasta area del telencefalo in via di sviluppo. Per impostare come destinazione siti alternativi nel cervello (per esempio diencefalo, retina), o per un targeting più specifico delle regioni all'interno della corteccia cerebrale, le procedure e gli elettrodi progettati esplicitamente per questo scopo possono essere usato15, 16. Forniamo anche un singolo costrutto che fornisce brillante etichettatura e garantisce che ogni neurone con etichetta fluorescente contiene Cre ricombinasi. Uno svantaggio di usare un singolo costrutto per realizzare etichette brillante è che la popolazione con etichetta può essere troppo densa (Figura 2), ma questo può essere risolto mediante imaging cellule alla periferia della zona con etichetta (Figura 2D). In alternativa, espressione di un costrutto fluorescente può essere progettato a dipendere da Cre ricombinasi espressione17, ma i livelli di espressione bassa possono richiedere immunostaining per il marcatore fluorescente. Questa limitazione è affrontata con il sistema "Supernova" di Cre-dipendente marcatore fluorescente espressione (Figura 3A)23,24.
Oltre alla combinazione di ricombinazione Cre-lox con elettroporazione in utero , offriamo diversi miglioramenti per la riproduzione ottimale di femmine gravide cronometrato. È importante tenere i topi in una stanza di detenzione che è esente da rumori e vibrazioni causate da apparecchiature quali cappe a flusso laminare. Arricchire l'ambiente con igloo plastica, materiale, di incastramento e integratori alimentari come semi di girasole (Vedi elenco dei materiali). Oltre a considerazioni di carattere ambientale, abbiamo notato che la prima cucciolata di una donna in genere ha il più basso tasso di sopravvivenza. Così, il nostro protocollo suggerisce attendere la seconda gravidanza della femmina per eseguire nell'utero elettroporazione. Mentre questa strategia aumenta la sopravvivenza della cucciolata, inoltre tende ad aumentare la dimensione della lettiera, che può allungare il tempo chirurgico e abbassare così il successo della chirurgia. Pertanto, se incontrando un numero particolarmente elevato di embrioni (ad es. più di 8), vi consigliamo di ignorare l'elettroporazione su alcuni degli embrioni, soprattutto gli embrioni più vicini alle ovaie e cervice, dove il tessuto è più incline al pregiudizio. Inoltre, utilizzando la stessa strategia di arricchimento ambientale cui sopra (plastica igloo, integratori dietetici, materiale di nidificazione) tende ad aumentare la sopravvivenza delle cucciolate dopo la nascita. È anche importante notare che estro può accadere nella femmina un paio d'ore dopo il parto della prima cucciolata. In questo caso, permettere la donna a partorire sua seconda cucciolata, quindi separare dopo lo svezzamento al fine di tentare a tempo accoppiamento. Quando alla ricerca di tappi vaginali, è consigliabile separare la femmina anche se non si trova una spina, soprattutto se la femmina è in estro la sera prima. Spine in alcuni ceppi sono difficili da individuare, e concezione potrebbe essersi già verificato.
Un'altra area di miglioramento è nella produzione di pipette di microiniezione adeguata per elettroporazione nell'utero . Tirando le pipette per l'iniezione di DNA nei ventricoli laterali è un passo fondamentale. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'impostazione di pipette con una dimensione di coerente punta e bordo di estremità ruvida. Altri metodi includono rottura indietro la punta con un bisturi lama15 o pizzicamento largo della punta con forcipe16,17. Si noti che se i puntali per pipette sono troppo piccoli, essi saranno correttamente perforare la parete uterina ma portate di iniezione sarà troppo basse, allungando il tempo in cui è presentata la pipetta nel cervello embrionale. Se i puntali per pipette sono troppo grandi, potrebbero danneggiare la parete uterina e cervello embrionale. Se i puntali per pipette sono troppo lisce, causeranno una piota grande alla parete uterina e/o embrionale cranio prima di sfondare, possibilmente danneggiare l'embrione. Pratica di creazione di un'interruzione di grezza per produrre una punta di 20-25 µm e controllare punte sotto un microscopio chiaro semplice (ad esempio con un obiettivo 10x) fino ad ottenere un risultato uniforme. Test di quel liquido può essere dispensato ad un prezzo ragionevole (ad es. ~0.5 µ l/s) con un assemblaggio di tubo aspiratore è un altro metodo per garantire che il formato di punta è all'interno di un intervallo accettabile. Poiché le pipette di iniezione sono calibrate e laureate, è noto l'esatta quantità di DNA consegnato al ventricolo laterale. Questo è il punto più critico per il raggiungimento di un desiderato sparseness riproducibile a un ordine di grandezza. In altre parole, una data concentrazione dovrebbe produrre etichettatura entro un determinato intervallo, ad esempio 10 a 100 neuroni con etichettati.
Il passo più importante nel protocollo è la procedura di elettroporazione nell'utero . Essere estremamente delicata mentre esponendo l'utero. Quando si tira fuori l'ultimi embrioni dalla cavità addominale, assicurarsi di non tirare le ovaie o la cervice. Usando il pollice e l'indice durante la microiniezione ed elettroporazione consente delicato, abile manipolazione degli embrioni per rivelare il ventricolo laterale e gli embrioni essere spinto delicatamente contro la parete uterina. Un tocco estremamente delicato è fondamentale quando si maneggia l'utero e gli embrioni. Se è difficile raggiungere un tocco delicato, è possibile utilizzare pinze anello con una vite di finecorsa incorporato per impedire le pinze di bloccaggio su un embrione o utero, causando danni ai tessuti. Un'ulteriore considerazione è quello di amministrare il carprofen e la buprenorfina immediatamente prima della chirurgia, una pratica che sembra fornire efficace del dolore durante l'intervento chirurgico in utero senza colpire la sopravvivenza embrionale prezzo35 .
Seguendo la nostra procedura semplificata istologico, diversi passaggi sono fondamentali. Dopo che irrora sperimentali cervelli con fissativo, mantenere il cervello intatto nel cranio per proteggere il tessuto cerebrale da danno durante la post-fissazione. Mentre è possibile memorizzare il cervello in PFA per giorni, settimane, notare quello fluorescenza diminuirà come la soluzione PFA polimerizza l'1%. Affettare 100 µm sezioni coronali è in genere abbastanza sottile per permettere la microscopia confocale attraverso l'intera sezione pur conservando gran parte della morfologia dendritica e assonale. Se la fissazione verificato correttamente, cervelli da animali più vecchi di P13 possono essere montati sul microtomo vibra semplicemente con la colla del cianoacrilato. Tuttavia, se il cervello è troppo flessibile mentre venga tagliato dal microtomo vibra, colla giù una piccola agar o un blocco di agarosio dietro al cervello per impedire di piegatura mentre esso è essere sezionato. Se il problema non viene risolto, è possibile incorporare il cervello in agar per formare un blocco da tagliare con il microtomo vibra, come suggerito per i più giovani cervelli postnatali (punto 5.8).
Questo metodo associa il sistema di ricombinazione di Cre-lox con elettroporazione nell'utero al fine di generare mosaici che possono essere utilizzati per studiare la funzione delle cellule-autonoma dei geni nei neuroni. Questo metodo potrebbe anche essere configurato per supportare nell'utero elettroporazione del gene editing costrutti (es. CRISPR/Cas9)6o altri ricombinasi site-specific(p.es. Flp/FRT o Dre/rox24), che potrebbero essere tutti progettato per produrre il tessuto cerebrale mosaico. Una tecnica alternativa promettente che poteva essere utilizzata per produrre tessuti di mosaico è virale consegna via l'iniezione intraventricolare a topi neonatali36. Unito con l'iniezione intraventricolare alle età embrionale come dimostrato qui e altrove15,16,17,18,19,20, 21,22,37, vettori virali che codifica per la Cre ricombinasi potrebbe essere consegnato prima della nascita di infettare le cellule progenitrici floxed presso la zona ventricolare. Una considerazione critica sarebbe quello di garantire che i vettori virali sono diluiti sufficientemente per raggiungere l'asportazione sparsa e l'etichettatura. Tuttavia, questo comporterebbe anche a basso numero di copie del costrutto recapitato, includendo marcatori fluorescenti essenziale per neuroanatomical osservazioni (ad es. delle spine dendritiche o arborization)24. Per contrastare questo trabocchetto, nuovi costrutti utilizzando la stessa strategia come i costrutti di "Supernova" dimostrati qui potrebbero essere utilizzati per realizzare etichette sparse senza una corrispondente diminuzione della luminosità delle cellule con etichetta24. Un'altra considerazione critica con consegna virale è garantire che costrutti consegnati hanno promotori specifici per la popolazione delle cellule in fase di studio (ad es. eccitatorio neuroni piramidali). L'iniezione intraventricolare di vettori virali provoca infezione di tutto il tessuto che circonda i ventricoli, tra cui non solo la zona ventricolare del telencefalo dorsale dove vengono generati i neuroni eccitatori corticali e ippocampali, ma anche mediale e laterali eminenze gangliare dove molti interneuroni corticali sono nato34. Un'altra caratteristica dell'elettroporazione in utero rispetto a virale consegna dei costrutti è una finestra relativamente stretta tempo di consegna. Virus iniettato nei ventricoli laterali può persistere dopo l'intervento chirurgico, continuando ad infettare le cellule che allineano la zona ventricolare. Al contrario, elettroporazione avviene in pochi secondi, un insieme molto più specifico delle cellule di targeting. Questo può essere un vantaggio o uno svantaggio per l'investigatore, a seconda la sottopopolazione delle cellule per essere studiato.
Il nostro approccio supporta ricombinazione Cre-lox di introduzione di un singolo costrutto o costrutti "Supernova". Nel caso i costrutti di "Supernova", esortiamo gli investigatori per acquisire familiarità con i vantaggi e le limitazioni di utilizzo di questa strategia. Ad esempio, i tempi di cancellazione Cre ha dimostrato di verificarsi entro 2 giorni in neuroni eccitatori del II/III di strato della corteccia cerebrale24. Pertanto, è plausibile che l'asportazione Cre potrebbe verificarsi più dei 48 h seguendo l'elettroporazione, piuttosto che segue immediatamente l'elettroporazione. Pertanto, altre forme di corroborare la temporizzazione e la posizione dell'asportazione di Cre (ad es. usando una linea di topo reporter Cre) dovrebbero essere utilizzate per integrare l'uso di questa nuova tecnica, specialmente negli studi dove l'asportazione di Cre entro un lasso di tempo piccolo è un critico considerazione. Un altro trabocchetto potenziale è che una piccola percentuale di cellule senza etichetta in un esperimento di "Supernova" poteva esprimere la Cre ricombinasi. Ad esempio, in Figura 3, abbiamo co-individulamente due plasmidi: un'alta concentrazione di CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE e una concentrazione bassa di TRE-Cre. Poiché TRE è un promotore che perde, Cre ricombinasi potrebbero essere espresso in cellule che hanno ricevuto il plasmide di TRE-Cre ma non il plasmide loxP-fermata-loxP-EGFP-tTA, anche se questo sarebbe un avvenimento raro. In un esperimento dove è essenziale che tutte le celle senza etichetta non hanno alcuna asportazione di Cre-mediata qualunque, un esperimento di "Supernova" potrebbe essere necessario essere completati con un esperimento di controllo nel quale Cre espressione ricombinasi di fuori di etichettato neuroni è valutato con altri mezzi (ad es. Cre ricombinasi immunoistochimica).
In sintesi, il nostro protocollo è facilmente modificato per accogliere questi nuovi costrutti, rendendo nell'utero elettroporazione un metodo ancora più utile e adattabile per analisi di mosaico. Così, nell'utero elettroporazione può essere combinato con il potere di ricombinazione genetica in più modi per studiare mosaico cervello tessuto in vivo.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il generoso sostegno della James Madison University Dipartimento di biologia e la microscopia luce James Madison University e Imaging Facility. Dr. Mark L. Gabriele per consigli utili per quanto riguarda la preparazione di tessuti postnatale giovane, e d. ssa Justin W. Brown e Corey L. Cleland per generoso coordinamento dei materiali chirurgici e spazio. Questa ricerca è stata finanziata in parte da una sovvenzione di ricerca collaborativa da 4-VA, una partnership di collaborazione per far progredire il Commonwealth della Virginia (G.S.V.) e da un Virginia Accademia di scienza piccolo progetto Research Grant (G.S.V.). Supporto è stato generosamente fornito da una dotazione di Betty Jo amorevole Butler 58 per borsa di ricerca dello studente non laureato (a K.M.B.), una borsa di ricerca di estate di Farrell (a K.M.B.), un James Madison University secondo secolo Scholarship (a K.M.B.), un James Madison University Centennial borsa di studio (C.J.H.), una James Madison University Lucy Robinson cerca 30 Memorial Scholarship (a Z.L.H.) e a James Madison University College di Scienze e matematica facoltà assistenza Grant (a G.S.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000664 | See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice") |
| GFP.Cre empty vector | AddGene | #20781 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks. |
| pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #69138 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| pK031.TRE-Cre (Supernova) | AddGene | #69136 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #85006 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | #12362 | See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit") |
| Trypan Blue powder, BioReagent grade | Sigma | T6146-5G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue") |
| Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg | VWR | BDH9286-2.5KG | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl") |
| Potassium Chloride, ACS, 500 g | VWR | #97061-566 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl") |
| Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | S0876-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4") |
| Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | P5379-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4") |
| Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL | Fisher Scientific | A144-500 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl") |
| P-97 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
| 3.0 mm wide trough filament | Sutter Instrument | FT330B | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
| Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID | World Precision Instruments | TW100-4 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary") |
| Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" | Phenix | LW-8148 | See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used. |
| Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 Teeth | World Precision Instruments | #14140 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps") |
| Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503708-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors") |
| Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503728-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps") |
| General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply | Medrepexpress | #2204-c | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges") |
| Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID | World Precision Instruments | #503203 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps") |
| Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm | Sigma-Aldrich | CLS3160102-12EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes") |
| Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" | Amazon | B007SHGAHA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray") |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm | BTX | #45-0489 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes") |
| ECM 830 Foot Pedal | BTX | #45-0211 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal") |
| ECM 830 Generator | BTX | #45-0052 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator") |
| Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box | Harvard Apparatus | #72-6468 | See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber") |
| Ophthalmic ointment | Hanna Pharmaceutical Supply Co | #0536108691 | See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment") |
| Space Gel (AIMS) | VWR | #95059-640 | See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution") |
| Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula | Veet | #062200809951 | See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream") |
| 10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) | Phenix Research Products | TSP-10LKIT | See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip") |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly") |
| Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" | Medrepexpress | MV-J397 | See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures") |
| “LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive | Medrepexpress | VG3 | See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive") |
| Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe") |
| BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192392-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle") |
| Nestlets Nesting Material | Ancare | NES3600 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials") |
| Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile | Bio-Serv | S5137 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds") |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA") |
| Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips | World Precision Instruments | #501976 | See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers") |
| Agar powder | Alfa Aesar | #10752 | See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar") |
| Single-edge razor blades, #9 blade | Stanley Tools | #11-515 | See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade") |
| Specimen disc S D 50 mm | Leica | #14046327404 | See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc") |
| Buffer tray S assembly | Leica | #1404630132 | See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray") |
| VT1000 S Vibratome | Leica | #14047235612 | See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome") |
| Double Edge Razor Blades | Personna | BP9020 | See "5. Histology" (step 5.10 "blade") |
| Knife Holder S | Leica | #14046230131 | See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder") |
| Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set | Amazon | B0089KU6XE | See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush") |
| Superfrost Plus Slides | Electron Microscopy Services | #71869-11 | See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide") |
| ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml | Thermofisher | P36970 | See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant") |
| Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 | Phenix Research Products | MS1415-10 | See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip") |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI") |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope") |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | TE2000/C2si | See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope") |
| 4x objective, NA = 0.20 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 4X | See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective") |
| 20x objective, NA = 0.75 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 20X | See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective") |
| 60x objective, NA = 1.40 | Nikon | CFI Plan Apo VC 60X Oil | See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective") |
References
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