Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Inducing grobunn-lox rekombinasjon i musen hjernebarken gjennom In Utero Electroporation

Published: November 17, 2017 doi: 10.3791/56675
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1
1Department of Biology, James Madison University
* These authors contributed equally

Summary

Cellen autonome funksjoner av gener i hjernen kan studeres ved å fremkalle tap eller gevinst på funksjonen sparsom bestander av celler. Her beskriver vi i utero electroporation gir grobunn recombinase i sparsom bestander av utvikle kortikale neurons med floxed gener forårsake tap av funksjon i vivo.

Abstract

Cellen autonome neuronal funksjoner av gener kan vises ved forårsaker tap eller gevinst på funksjon av et gen i en liten og sparsom befolkning av neurons. Det krever genererer en mosaikk der neurons med tap eller fortjeneste av et gen er omgitt av genetisk Uaffisert vev. Her kombineres grobunn-lox rekombinasjon systemet med i utero electroporation for å generere mosaikk hjernevev som kan brukes til å studere funksjonen celle autonome av gener i neurons. DNA konstruksjoner (tilgjengelig i repositories), koding for et lysstoffrør etikett og grobunn recombinase, blir introdusert inn i utvikling av kortikale nevroner som inneholder gener flankert med loxP områder i hjernen til mouse embryoer bruker i utero electroporation. I tillegg beskriver vi ulike tilpasninger for metoden i utero electroporation som øker overlevelsesevne og reproduserbarhet. Denne metoden innebærer også å etablere en titer for grobunn-mediert rekombinasjon i en sparsom eller tett befolkning av neurons. Histologiske preparater av merket hjernevev ikke krever (men kan tilpasses) immunohistochemistry. Konstruksjoner brukes garanterer at fluorescently merket neurons bærer genet for grobunn recombinase. Histologiske forberedelser tillate morfologisk analyse av neurons gjennom AC confocal avbildning av dendrittiske og axonal arbors og dendrittiske spines. Fordi tap eller vinning-funksjonen er oppnådd i sparsom mosaikk vev, tillater denne metoden studiet av cellen autonome nødvendighet og tilstrekkelighet av genet produkter i vivo.

Introduction

Generere en genetisk mosaikk er et klassisk eksperimentelle paradigme for å forstå funksjonen av et genet av interesse. For å avgjøre hvis en genet er nødvendig for en mobilnettet fenotype, forårsaker den enkleste måten tap av funksjon av genet hele organismen (f.eks knockout). Men for å avgjøre om et gen er nødvendig i en bestemt celle type, er knockout av genet hele organismen ikke en gyldig tilnærming. I stedet, en metode er nødvendig som vil føre til tap av funksjon av et gen i en gitt celle mens det er omgitt av wildtype (i.e. genetisk Uaffisert) vev-med andre ord, lage mosaikk vev. Hvis mutant cellen viser en mutant fenotype, men omkringliggende wildtype cellene ikke, gene funksjonene i en celle autonome måte. Analyse av mosaikk vev, der mutant celler er omgitt av wildtype vev, er ideelt for å forstå celle autonome funksjoner av gener, spesielt i hjernen hvor neurons og glia danner en sammenhengende nettverk av vev.

Flere former for mosaikk hjernevev har gitt kraftige modeller for å undersøke celle autonome funksjoner av gener. Studier fokuserte på neuronal transplantasjon1, kvinnelige X-koblede mosaicism2,3,4, og endogene somatisk mosaicism5,6 har trukket sine konklusjoner basert på mosaic hjernevev. Betinget sletting av et gen gjennom grobunn-lox rekombinasjon systemet er en metode som drar full nytte av store tilgjengeligheten av transgene musen linjer. I denne metoden får er to loxP nettsteder innført på hver side av en obligatoriske rekkefølgen til et gen (for eksempel en ekson), la det flankert av loxP at både ansikt i samme retning ("floxed"). Grobunn recombinase avgifter rekkefølgen mellom loxP nettsteder7. Grobunn-mediert rekombinasjon kan oppnås ved krysset floxed mus til en annen mus linje uttrykke grobunn recombinase sammen med merketråd fluorescerende i en gruppe celler ("grobunn reporter linje"). Dette har blitt vist på en rekke måter å avdekke funksjonene til et gen i undergrupper av celler, for eksempel eksitatoriske nerveceller eller astrocyttene8. Grobunn reporter linjer kan uttrykke CreERT2 å tillate grobunn-mediert rekombinasjon skal narkotika-induserbart (single-Nevron merking med induserbart grobunn-mediert knockout eller GLATT)9. En annen strategi kalt mosaikk analyse med dobbel markører (MADM)10,11, kan grobunn-mediert interchromosomal rekombinasjon en homozygous mutant opprettes sammen med heterozygote vev. Disse tilnærmingene må en ny linje av mus produseres hver gang for hver kandidat genet eller cellular undertype som testes. Alternativt kan grobunn recombinase innføres fødselen via Iontoforese12 eller viral vektorer (f.eks adeno-assosiert virus13 eller lentiviruses14 bærer mobilnettet Undertypespesifikke Arrangørene). Denne strategien skaper sterke og postnatal merking. Målrettingsland utvikle cerebral kortikale nevroner tynt og prenatally er en perfekt strategi i utero electroporation av grobunn recombinase med merketråd fluorescerende.

I tillegg kombinerer grobunn-lox rekombinasjon gjennom i utero electroporation å produsere mosaikk vev i vivo, vi introdusere flere tilpasninger til prosedyrer fra andre publiserte protokoller15,16, 17,18,19,20,21. Vi gir informasjon for å forbedre suksessen i avl tidsbestemte-gravide kvinner. Vi også skissere våre to strategier for å innføre sparsom og lyse merking av nerveceller i kortikale vev: en strategi er å sjarmere nivåer av en enkelt konstruere koding for grobunn recombinase og en fluorescerende markør22. En annen strategi er å bruke "Supernova" systemet, designet spesielt med disse parameterne i tankene23,24. I tillegg tilbyr vi forbedringer på konsekvent microinjection Pipetter og forenklinger til i utero electroporation kirurgi. Til slutt, vi skissere avgjørende skritt i en forenklet histologiske forberedelse som tillater analyse av dendrittiske spines og dendrittiske og axonal arbors, uten ytterligere flekker eller immunohistochemistry.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Metodene som er beskrevet her er godkjent av Animal Care og bruk Committee (ACUC) ved James Madison University, og er i samsvar og overholdelse av alle relevante regulatoriske og institusjonelle retningslinjer.

1. musen oppsett

  1. Huset en ung (> P60) mannlige og kvinnelige homozygous floxed mus sammen for å sette opp en oppdretter par25.
    Merk: En god negativ kontroll er å sette opp en ekstra oppdretter par wildtype mus, i hvilken grobunn recombinase uttrykk ikke vil føre til en mosaikk26.
  2. Tillate kvinner å føde og øke sitt første kull med mannlige. Holde mannlige med kvinnelige øke søppels overlevelse. Etter venne skille søppel, f.eks på postnatal dag (P) 21, kvinner og menn.
  3. Murine avl
    1. Definere en tidsbestemt parring mellom de kvinnelige og mannlige25. Bruk visuelle pekepinner bestemme estrus syklusen av de kvinnelige27, og sjekk for vaginal plugger morgenen etter parring25.
    2. Hvis en plugg, skille, og veie kvinnelige. Telle dagen som embryonale (E) 0,5.
    3. Fortsette veier kvinnelige hver 3-5 dager om hun er gravid. Gravide kvinner har en 10-20% økning i kroppsvekt 7-10 dager etter unnfangelsen (E0).
      Merk: Dette trinnet bekrefter graviditet tidligere og mer pålitelig enn visuell inspeksjon25.
    4. Hvis kvinnelige ikke er gravid, gjentar du trinn 1.3.1-1.3.3.
  4. Etter graviditet er bekreftet, velge datoen for electroporation i utero . Målrettingsland layer II/III kortikale pyramidale neuronal progenitors, utføre electroporation på E15.5.

2. DNA oppsett

  1. Velg en enkelt DNA konstruere de kodene for grobunn recombinase samt en fluorescerende markør, som grønne fluorescerende protein (GFP)28,29. Du kan også bruke "Supernova", beskrevet i detalj i tidligere publikasjoner23,24. Se liste over materialer for eksempel konstruksjoner.
  2. Forsterke DNA construct(s) fra trinn 2.1 i E. coli bruker standard mikrobiologisk teknikk30.
  3. Rens DNA Konstruer med en endotoxin-fri plasmider rensing kit følge instruksjonene fra produsenten. Elute konstruksjon med endotoxin-fritt vann.
    Merk: Velger en endotoxin uten rensing kit over en standard rensing kit er avgjørende.
  4. Konsentrere DNA eluate til 1 til 3 mg/mL avhengig av ønsket merking tetthet26.
    Merk: En titer må alltid opprettes når du arbeider med en ny DNA konstruksjon, gitt at de har forskjellige lengder og arrangører. Vurdere å injisere en konstruksjon på flere ulike konsentrasjoner og/eller beløp å vurdere uttrykk. For eksempel injeksjon av 1 µL eller 1,5 µL av 2,0 mg/mL GFP. Grobunn er kjøpedyktig sparsom (1 µL) eller tett (1,5 µL) merking av lag II/III visuelle kortikale pyramidale nevroner26.
  5. Legge til 0,4% trypan blå i 1 x fosfat bufret saltvann (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 H2O, justere pH 7.4 med HCl) 1:10 til konsentrert DNA løsning.
  6. Legge 10 x PBS 1:10 til konsentrert DNA løsningen.
  7. Lagre konsentrert DNA løsningen på 4 ° C. Løsningen kan lagres på ubestemt tid.

3. pipette oppsett

  1. Ved hjelp av en glass kapillær avtrekker, trekke en pipette med en svært lang (10-15 mm) taper og veldig fine tips, typisk for Pipetter for embryonale stamcelleforskningen injeksjon eller kjernefysiske overføring31.
    Merk: For å hindre rusk fra forurensende Pipetter, de skal være gjort innen 2 dager etter operasjonen.
    1. Kalibrere glass kapillær puller ved å utføre en rampe test, etter instruksjonene fra produsenten. Bruk varme resultatverdien å programmere en trekker protokollen bruker følgende parametere: varme = (rampen testverdi + 15), trekke = 30, vel = 120, tid = 100, trykk = 200. Sett av glass kapillær, sy klemmer på avtrekker, og aktivere programmert trekke protokollen, skaper en taper på glass kapillær.
    2. Kontroller at taper lengden er mellom 10-15 mm bruker en sammensatt lys mikroskopet (f.eks 10 X objektiv)31.
  2. Bryte tilbake pipette for å danne et ujevne kanter tips til 20-25 µm diameter.
    1. Midtstille en ett lag oppgave tørke (se liste over materialer) over en 50 mL kanne og stretch tørke stram med én hånd. Med den andre hånden, hold og presse en pipette (taper side ned) vinkelrett og fullt gjennom midten av av tørke, forårsaker en ren pause i de taper31.
      Merk: Skyve pipette helt gjennom tørke vil produsere et 20-25 µm diameter tips ca 70% av tiden.
    2. Bekreft under et mikroskop med sammensatte lys (f.eks 20 x objektiv).
      Advarsel: Bruk vernebriller mens bryte glasset.
  3. Kalibrer en pipette ved aspirating 1 µL av 0,4% trypan blå i 1 x PBS i en delvis fylte piptte, deretter eksamen pipette med 1 µL tegninger basert på høyden på 1 µL i pipette, med en tynn alkoholmotstandig markør. Bruk den kalibrert pipette for å oppgradere de andre Pipetter før forkaster. Holde Pipetter i en pipette holder fri for støv og andre partikler.

4. i Utero Electroporation

  1. Plasser Graefe tang, iris saks, Hartman mygg tang, ikke-vevde gasbind svamper, ring-tipped tang og Petri retter på et rustfritt stål brett, og bryte med aluminiumsfolie. Sett skuffen og 1 L 0,9% saltløsning (0,9% wt/vol NaCl i vann) i autoclave. Autoclave 121 ° c og 3,5 kPa i 40 min. fjerne fra autoklav og plasser i en desinfiseres kirurgiske området.
    Merk: Det er viktig å opprettholde sterile forhold under operasjonen.
  2. Varm autoklaveres 1 L saltvann flasken i en liten vannbad til 38 ° C minst 2 timer før operasjonen.
  3. Koble tweezer-type elektrodene og fotpedal til generatoren (se liste over materialer). Følg produsentens instruksjoner, angi generatoren å levere fem 50 ms pulser 50 V (med en 950 ms intervall) når utløst av fotpedalen. Desinfiser tweezer-type elektrodene og plasser på desinfiseres kirurgiske området.
  4. Gjøre en bedøvelse nesen membran som er publisert tidligere32, men bruker en nitril eller latex hansker finger for å danne en membran som passer sikkert over nesen kjegle åpningen. Skjære hull i pessar stor nok til å passe over musen er snuten.
  5. Dypt bedøve gravid mus på E15.5 i en induksjon kammer fylt med isoflurane (2-4%) i ren oksygen i 1 L/min. Etter ~ 1 min, teste rettende refleks (forsiktig vippe induksjon kammeret og sikre at musen ikke høyre seg). Vei for å bestemme dosering av analgesi administrert senere under operasjonen.
  6. Overføre musen til det kirurgiske området og administrere inhalert isoflurane (1-2%) i ren oksygen i 1 L/min gjennom en nesen kjegle å opprettholde musen i kirurgiske fly. Bruk tang til å teste den pedal refleks (knip labben forsiktig og sikre at musen ikke returnerer en refleks) til å kontrollere anesthetization. Overvåke respirasjonsfrekvens og innsats, leter dype, puste vanlig (~ 70-100 åndedrag/min), og at slimhinner er rosa farge og fuktig.
  7. Bruke nok veterinær ophthalmica salven over øynene for å dekke dem helt for beskyttelse mot tørker under prosedyren.
  8. Flex metall aktivator platen av en forseglet pose fylt med overmettet salt løsning (se liste over materialer), aktivere en eksoterm krystallisering av salt. Legge 2 ett lag oppgave kluter på posen, og plassere musen på posen å opprettholde kroppstemperatur.
  9. Massasje depilatory fløte til mageområdet med bomull vattpinner til abdominal pels oppløses (ca 20-40 s), og tørk av abdominal pels. Rengjør av eventuelle gjenværende rester og riktige krem med 70% etanol og bomull vattpinner. Plasser en fenestrated sterilt kirurgisk drapere over mageområdet.
  10. Bruker steril teknikk, trekke huden opp og fra magen med Graefe tang, og gjøre en ~ 2 cm ventrale midtlinjen snitt på huden med iris saks, sikre at underliggende muskel ikke er kuttet.
    Merk: En akseptabel alternativ til å gjøre et snitt med Graefe tang og iris saks er å bruke en skalpell, som publisert tidligere17.
  11. Finn linea alba visualisere midtlinjen av rectus abdominis. Trekke muskel opp og fra magen med Graefe tang, og gjøre en annen ~ 2 cm midtlinjen snitt det med iris saks, utsette bukhulen (livmoren er gjennomsiktig og embryo blir synlig under). Sikre at underliggende livmor og intestinal vev ikke er kuttet. Gjør i snitt bare store nok (vanligvis ~ 2 cm) å trekke ut og utsette livmoren komfortabelt.
    Merk: En akseptabel alternativ til å gjøre et snitt med Graefe tang og iris saks er å bruke en skalpell, som publisert tidligere17.
  12. Bruker et sterilt 10 µL brønnene tips, dispensere carprofen (oppløst i sterilt 0,9% saltløsning) 4 mg/kg i bukhulen for analgesi.
  13. Klemme en Hartman mygg tang på venstre kant av rectus abdominis innsnitt. Hvile tang på veltet Petriskål til venstre for snitt, holder til venstre i snitt åpen. Klemme en annen Hartman mygg tang på høyre kant av den rectus abdominis snittet og hvile tang på en veltet Petriskål til høyre i snitt, holde til høyre i snitt åpen. Plasserer gasbind svamp rundt området av innsnitt.
  14. Bruker ring tang (uten en tilknyttet limit-skruen), trekk på livmoren mellom noen to nabokommunene embryo uten knusing eller skadet noen vev. Starte trekke ut alle embryoer gjennom snitt, legge dem på gasbind svamp. Når trekke ut de siste embryoene fra bukhulen, sørg for ikke å trekke på eggstokkene eller cervix. Når utsatt, er det avgjørende å holde livmoren fuktig med varmt saltvann. Livmoren inneholder vanligvis mellom 5 og 8 embryoer.
    Merk: Det er mulig å legge penicillin og streptomycin til de saltvann17.
  15. Koble en kalibrert pipette til aspirator rør montering (se liste over materialer), og injisere nøyaktig 1 µL av DNA løsningen i trinn 2 gjennom livmor veggen i en lateral ventrikkel på hver fosteret. Lateral ventriklene vises som to flekker på rygg telencephalon av embryoet (patcher er mørkere enn omkringliggende vev av telencephalon). Bruk tommelen og pekefingeren under microinjection og electroporation for å manipulere embryoer, avslørende lateral ventriklene og la embryoene å bli presset forsiktig mot livmor veggen under injeksjon. Bekrefte vellykket injeksjon ved å observere trypan blå fylle lateral ventrikkel.
  16. Plasser katoden av tweezer-type elektroder (se liste over materialer) på livmoren, rett over mediale og caudal cortex målrette i hjernebarken (målretting alternativ områder av hjernen vil kreve forskjellige elektrodeplassering)16, 26. Plass anoden på livmoren, bare dårligere og fremre embryoets hode.
  17. Bekreft at anoden og katoden berører livmoren rundt embryoet på de riktige stedene. Med en fotpedal, utløse levering av fem 50 ms pulser 50 V (med en 950 ms intervall) over elektrodene.
    Merk: Den injiserte, negativt ladet DNA flyttes mot katoden og vil bli innarbeidet i ventrikkel sonen celler nærmest katoden.
  18. Tilbake livmor til bukhulen i samme retning ble funnet. Bruke saltholdig for å smøre livmoren mens guiding det manuelt og svært forsiktig, ta vare ikke for å fortrenge embryoer fra sin posisjon i livmoren.
  19. Lukk magemusklene med absorberbare suturer (se liste over materialer) bruker en enkel avbrutt maske, binde endene med en kirurg 's knute. Gjør ikke klippet ender for nær knuten eller knute vil bli unfastened.
    Merk: Det er viktig å Sutur magemusklene slik at kantene på såret er helt stengt stengt, men uten å forårsake blanchering av muskel. Knop bør være stram så de ikke unfastened.
  20. Lukk huden laget med absorberbare suturer (enkel avbrutt maske, kirurg 's knot, som i trinn 4,19). Påfør en liten mengde vev limet å forsegle såret. Bruk vev lim knuter å hindre løsne. Bruk brønnene for å fjerne lim. vev rundt såret som kan være aspirated av av brønnene.
  21. Lavere isoflurane nivåer til 0,5-1,5%. Når vev limet tørker (test ved å berøre hanske å lim), fjerne fra isoflurane og tillate kvinner å komme seg alene i en varm bur. Administrere buprenorfin intraperitoneally ved 0,03 mg/kg med 1 mL sprøyte med en 26G, ½" p.
  22. Fortsette å overvåke musen til musen er helt frisk og oppfører seg normalt (dvs. Stell, utforske bur, spise eller drikke). En gang gjenopprettet, plassere kvinnelige tilbake i bur med mannlige.
    Merk: Hvis alle trinnene blir fulgt, musen vil vanligvis gjenvinne bevissthet innen 2 min og umiddelbart begynne å flytte om byrået, viser ingen tegn til ubehag.
  23. Hvis musen forevise underskriver av ubehag (f.eks bøyd holdning, porphyrin sekret)33, administrere carprofen på 0,1 mg/mL i vannforsyning. Hvis flere tegn på ubehag, eller hvis ubehag vedvarer for mer enn 4 h til tross for carprofen administrasjon, umiddelbart euthanize musen ved å tilsette en intraperitoneal dødelig injeksjon av ketamin (240 mg/kg) - xylazine (48 mg/kg)- acepromazine (1,85 mg/kg) cocktail med en 1 mL sprøyte med en 26 G, ½" p, og følger med en godkjent sekundær form for euthanasia33.
  24. For å øke overlevelse av electroporated embryo etter fødselen, holde buret i rolige holde rommet, uten støy og vibrasjoner. Berike miljøet med plast igloene, hekkende materialer og kosttilskudd som solsikkefrø (se liste over materialer). Ikke flytte eller forstyrre buret, spesielt i de første 3 dagene etter fødsel.

5. histologiske forberedelse til fluorescens mikroskopi

Merk: Denne histology protokollen er optimalisert for å forberede vev fra dyr eldre enn postnatal dag (P) 13 som var electroporated i utero. For å forberede vev fra yngre postnatal dyr (P0-P13), anbefales det å følge alle trinnene (inkludert transcardial perfusjon), men hjernen skal bygges i agar før forberede deler (trinn 5.9). Vev kan også tilberedes fra embryo innen 1-2 dager etter electroporation, ved hjelp av metodene beskrevet tidligere18,20.

  1. Forberede paraformaldehyde (PFA) løsning.
    Merk: Det er viktig å forberede frisk PFA, innen en dag av eksperimentet.
    Forsiktig: Paraformaldehyde er giftig og bør behandles i avtrekksvifte med riktig personlig verneutstyr.
    1. Å gjøre 50 mL av 4% PFA, varme 40 mL vann til 60 ° C. Legg 2 g PFA under omrøring med glass stang eller omrøring bar. Legge til 10 µL av 10 M NaOH hver 2 min til PFA oppløses.
    2. Legge til 5 mL 10 x PBS og få løsningen til et endelig antall 50 mL med vann.
    3. Etter å bringe løsning til 50 mL, justere pH 7,4 etter behov med 10 M HCl. Tillat løsning å kjøle og lagre på 4 ° C.
  2. Euthanize musen med en intraperitoneal injeksjon av ketamin (240 mg/kg) - xylazine (48 mg/kg) - acepromazine (1,85 mg/kg) cocktail med en 1 mL sprøyte med en 26G, ½" p. Transcardially perfuse 10 eller 20 mL iskald 1 x PBS, etterfulgt av 25 eller 40 mL nylaget, iskalde 4% PFA17. Bruke lavere volumer for unge postnatal (P0-P13) mus og høyere salgsvolumer for eldre mus (P14 og over).
  3. Umiddelbart etter perfusjon, halshugge musen carcass mellom nakkeknølen og C1 vertebra med store saks og løsner og forkaste de fleste av huden rundt skull bruke iris saks, spesielt hud rundt frontal parietal og tilpassing bein. Holde skallen og hjernen intakt.
  4. Plasser skallen og hjernen i 10 mL 4% PFA i et 50 mL konisk rør for 24 h på 4 ° C etter fikse vev. Legg deretter til 30 mL 1 x PBS konisk tube å fortynne løsningen på 1% PFA for lagring på 4 ° C.
    Merk: Bruk et separat konisk rør for hver skallen og hjernen rettes etter. Ikke ruge hjernen i 1% PFA lenger enn 2 uker eller fluorescens begynner å falme.
  5. Sted hjernen og skallen på en flat overflate med ett lag oppgave kluter fuktet med 1 x PBS. Bruk et par pinsett (se liste over materialer) å fjerne resterende huden eller membran omgir skallen.
  6. Ved hjelp av pinsett, fjerne nakkeknølen, og fjern forsiktig parietal beina, bevegelige pinsett ut og vekk fra overflaten av hjernen. Forsiktig fjerne alle meninges forårsake skade cortex.
  7. Kile baksiden av pinsett under hjernen langs skallen bryte noen Hjernenerve og fjerne hjernen.
  8. For unge postnatal (P0-P13) hjerner
    1. Gjøre 25 mL av 4% agar ved oppvarming 25 mL 1 x PBS til 80 ° C. Rør og oppløse 1 g agar med glass stang eller omrøring bar).
    2. Avkjøle løsning til 35 ° C mens du fortsetter å røre. Plasser hjernen i en liten beholder (f.eks hetten av et 50 mL konisk rør), og hell agar løsning over hjernen. Tillate agar å stivne.
  9. Gjør et koronale kutt manuelt ved hjelp av en enkelt kant razor blad gjennom hjernen, ca 0,5 mm rostral til bregma. Gjøre et koronale kutt gjennom hjernen ca 0,5 mm caudal i hjernebarken. Plass en pool av cyanoacrylate lim med samme diameter som rostral slutten av hjernen på midten av vibrerende mikrotomen prøveplaten. Plass rostral slutten av hjernen på utvalget av lim, sikrer at hele rostral overflaten av vev er bundet til prøveplaten med lim.
  10. Montere bufferbrettet på vibrerende mikrotomen og sikre med innebygd klemhåndtaket. Sette inn blad i knivholderen, og montere knivholderen på vibrerende mikrotom med innebygd klemskruen. Sikre prøveskiven med hjernen på bufferbrettet med innebygd spennanordningen. Angi hastighetsinnstilling til 5.70 (= 0.285 mm/s) og frekvensinnstillingen til 5,33 (53.3 Hz).
  11. Fylle kammeret over nivået på hjernen med 1 x PBS og lavere bladet i PBS. Begynne å ta 100 µm framskaffet gjennom vev.
  12. Hvis ikke krever videre behandling, for eksempel 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kjernefysiske flekker eller immunohistochemistry.
    1. Bruk en fin tippet pensel til å overføre deler direkte fra vibrerende mikrotomen på et mikroskop lysbilde, passende 4-6 deler på hvert lysbilde.
    2. At avsnittene tørke ved wicking bort løsning med en fin tippet pensel, slik at hjernen skiver ikke lenger drive på lysbildene.
    3. Deretter plassere en dråpe tilstopper (se liste over materialer) på hvert element på lysbildet.
    4. Forsiktig legge en 24 x 50 mm dekkglassvæske på toppen, sikrer at 1) ingen luftbobler skjemaet på delene, 2) delene ikke flytte, og 3) på tilstopper fullt dekker området mellom lysbilder og dekkglassvæske. Tillate tilstopper å kurere minst 24-48 h.
  13. Stain kjerner med DAPI for histologiske undersøkelse av kortikale laminae
    1. Bruk en fin tippet pensel til å overføre hver inndeling til en løsning som inneholder 10 µg/mL DAPI (se liste over materialer) fortynnet i 1 x PBS fra lagerløsning (20 mg/mL DAPI i vann).
    2. Inkuber i DAPI løsning for 5 min ved romtemperatur, deretter bruke en fin tippet pensel å overføre delen fra DAPI løsning til 1 x PBS og ruge i 1 x PBS i 5 minutter ved romtemperatur. Overføre del to ganger til frisk 1 x PBS i 5 min. Deretter bruker en fin tippet pensel, overføring delen på et mikroskop lysbilde, følg trinnene 5.11.2-5.11.4, og fortsett med trinn 5.13.
  14. Varme et glass Petriskål som inneholder Valap (like deler vaselin, lanolin og parafin) på en varm plate på en lav varme innstilling til helt smeltet. Seal utsatt kantene av lysbilder av penselen på smeltet Valap.
  15. For å kontrollere fluorescens i vev, bruk en lys mikroskop eller AC confocal mikroskop (se liste over materialer) og et filter angi tilstrekkelig for visning av fluorophore (f.eks DAPI: eksitasjon 325-375 nm, utslipp 435-485 nm; GFP: eksitasjon 450-490 nm, utslipp 500-550 nm)17. AC confocal bilder kan tas med lav - (4 X, numerisk blenderåpning, NA = 0,20), medium-(20 X, NA = 0,75), og høyeffekts (60 X, NA = 1.40) mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Singelen konstruere GFP. Grobunn (se liste over materialer) var electroporated på E15.5 og visualisert på P14. Avhengig av konsentrasjonen av Konstruer og volumet av injeksjon, kan et sparsommelig eller tett resultat oppnådd22,26. For eksempel injeksjon av 1 µL av 2 mg/mL GFP. Grobunn resultater i en sparsom distribusjon av merket celler, noe som kan være lys (figur 1A), og lokalisert i layer II/III (figur 1B). Vevet er 100 µm tykk, beholdes de fleste av de dendrittiske arbors (figur 1 c). Dendrittiske spines kan observeres på høy forstørrelse (60 X; Figur 1 d). Injeksjon av 1,5 µL på samme konsentrasjonen resulterer i svært tett merking (figur 2A) i lag II/III (figur 2B), som kan være sub-optimale som det er vanskelig å spore kilden til neurites og dendrittiske spines (figur 2C). Men er det fortsatt mulig å bilde en Nevron (figur 2D) og prosessene (figur 2E) ved å velge en lyse celle i utkanten av det merkede området (figur 2D).

Til slutt, er det mulig å maksimere lysstyrke på nerveceller samtidig opprettholde en sparsom fordeling av merkede celler. Her Supernova-GFP (se liste over materialer) var electroporated på E15.5 og visualisert på P23. Merk at, basert på observasjoner av hjernevevet tatt på ulike postnatal aldre, det synes ikke å være en effekt av alder på lysstyrken på noen fluorescerende konstruksjoner brukes her23,24,26. Injeksjon av 1 µL av en blanding som inneholder 1 mg/mL Sn-GFP (CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE) og 10 µg/mL TRE-grobunn resultater i en sparsom distribusjon av hovedsakelig lys celler (figur 3A) i layer II/III (figur 3B). Dendrittiske og axonal prosesser (figur 3B) og dendrittiske spines (Figur 3 c) kan visualiseres. I vår erfaring, målretting med enten en enkel konstruksjon som GFP. Grobunn eller med "Supernova" konstruksjoner reproduserbar gir uttrykk i minst 75% av electroporated embryo.

Figure 1
Figur 1: Sparsom og lyse uttrykk etter i utero electroporation med et enkelt bygge som inneholder GFP og grobunn recombinase. (A) lav forstørrelse (4 X) fluorescens mikroskop-bilde av hjernebarken på P23, etter electroporation på E15.5. (B) Medium forstørrelse (20 X) fluorescens mikroskop-bilde av DAPI kjernefysiske flekken, avslørende kortikale laminering (lag jeg, II/III, IV, og lagene dyp IV). (C) Medium forstørrelse (20 X) fluorescens mikroskop-bilde av en enkelt Nevron. (D) høy forstørrelse (60 X) fluorescens mikroskop-bilde av dendrittiske spines. Skalere barer = 200 µm (A); 100 µm (B, C); og 5 µm (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Dense og lyse uttrykk etter i utero electroporation med et enkelt bygge som inneholder GFP og grobunn recombinase. (A) lav forstørrelse (4 X) fluorescens mikroskop-bilde av hjernebarken på P14, etter electroporation på E15.5. (B) Medium forstørrelse (20 X) fluorescens mikroskop-bilde av DAPI kjernefysiske flekken, avslørende kortikale laminering (lag jeg, II/III, IV, og lagene dyp IV). (C) Medium forstørrelse (20 X) fluorescens mikroskop-bilde av nerveceller i området tetteste merking. (D) Medium forstørrelse (20 X) fluorescens mikroskop-bilde av neurons tatt i periferien av tetteste merking. (E) høy forstørrelse (60 X) fluorescens mikroskop-bilde av dendrittiske spines. Skalere barer = 200 µm (A); 100 µm (B, C, D); og 5 µm (E). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Sparsom og lyse uttrykk etter i utero electroporation med Supernova-GFP konstruksjoner som inneholder GFP og grobunn recombinase. (A) lav forstørrelse (4 X) fluorescens mikroskop-bilde av hjernebarken på P14, etter electroporation på E15.5. (B) Medium forstørrelse (20 X) fluorescens mikroskop-bilde av DAPI kjernefysiske flekken, avslørende kortikale laminering (lag jeg, II/III, IV, og lagene dyp IV). (C) Medium forstørrelse (20 X) fluorescens mikroskop-bilde av en enkelt Nevron. (D) høy forstørrelse (60 X) fluorescens mikroskop-bilde av dendrittiske spines. Skalere barer = 200 µm (A); 100 µm (B, C); og 5 µm (D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her introduserer vi kombinasjonen av i utero electroporation med grobunn recombinase i floxed mus å generere mosaikk hjernevev. En fordel med denne tilnærmingen er at en ny mus linje ikke trenger genereres hver gang en annen mobilnettet undertype skal målrettes: i utero electroporation kan brukes til å målrette eksitatoriske nerveceller, hemmende nerveceller eller glia avhengig og plassering av electroporation15,16,17,18,19,20,21,34. I vår tilnærming er målretting hjernebarken konsekvent og reproduserbar fordi vi bruker 5 mm diameter electroporation elektroder som kan plasseres over et stort område av det utvikle telencephalon. Målrettingsland alternativ områder i hjernen (f.eks diencephalon, netthinnen), eller til mer spesifikke målretting av regioner i hjernebarken, prosedyrer og elektroder laget spesielt for dette formålet kan være brukt15, 16. vi gir også en enkel konstruksjon som gir lys merking og garanterer at alle fluorescently-merket Nevron inneholder grobunn recombinase. En ulempe med å bruke en enkelt konstruere for å oppnå lyse merking er at merket befolkningen kan være for tette (figur 2C), men dette kan løses av imaging celler i utkanten av merket området (figur 2D). Alternativt uttrykk for en fluorescerende konstruere kan utformes til å avhenge grobunn recombinase uttrykk17, men lav uttrykk nivåer kan kreve immunostaining for fluorescerende markøren. Denne begrensningen er adressert av "Supernova" systemet grobunn-avhengige fluorescerende markør uttrykk (figur 3A)23,24.

I tillegg kombinerer grobunn-lox rekombinasjon med i utero electroporation, tilbyr vi flere forbedringer for optimal formering tidsbestemte-gravide kvinner. Det er viktig å holde musene på holde rommet som er fri for støy og vibrasjoner forårsaket av utstyr som laminær strømning hetter. Berike miljøet med plast igloene, hekke materiale, og kosttilskudd som solsikkefrø (se liste over materialer). Bortsett fra miljøhensyn, har vi oppdaget at den første søppel av en kvinnelig vanligvis har lavest overlevelse. Dermed antyder våre protokollen vente til andre graviditet av den kvinnelige utføre i utero electroporation. Mens denne strategien øker overlevelse av søppel, pleier det også å øke søppel størrelse, hvilke kanne forlenge kirurgisk tid og dermed lavere suksessen til operasjonen. Derfor hvis møter et spesielt stort antall embryo (f.eks mer enn 8), foreslår vi hoppe i electroporation på noen av embryoene, spesielt embryo nærmest ovaries og cervix, der vev er mest utsatt for skade. Videre bruker samme miljømessig berikelse strategi nevnt ovenfor (plast igloene, hekke materiale, kosttilskudd kosttilskudd) tendens til å øke overlevelse av søppel etter fødselen. Det er også viktig å merke seg at estrus kan oppstå i kvinnelige noen timer etter fødsel av første søppel. I dette tilfellet, Tillat kvinnen å gi fødsel til hennes andre søppel og del etter venne for å forsøke tidsbestemt parring. Når ser for vaginal plugger, er det lurt å skille kvinnelige selv om en plugg ikke blir funnet, spesielt hvis kvinnelige var i estrus natten før. Plugger i enkelte stammer er vanskelig å oppdage oppfatning kan allerede har skjedd.

En annen er forbedring produsere tilstrekkelig microinjection Pipetter for electroporation i utero . Trekke Pipetter for DNA injeksjon i sideventriklene er en avgjørende skritt. Her gir vi en detaljert protokoll for å sette opp Pipetter konsekvent størrelsen og grov spiss kant. Andre metoder inkluderer bryte tilbake spissen med en skalpell blad15 eller knipe tipset med tang16,17. Merk at hvis pipette-spisser er for små, de vil riktig punktering livmor veggen men injeksjon strømningshastigheter blir for lav, forlenge tiden der pipette sitter fast i embryonale hjernen. Hvis pipette-spisser er for stor, kan de skade livmor veggen og embryonale hjernen. Hvis pipette-spisser for, vil de forårsake en stor divot i livmor veggen og/eller embryonale skallen brøt gjennom, noe som kan skade fosteret. Øve på oppretting av en grov pause for å produsere et 20-25 µm tips og inspisere tips under et enkelt lys mikroskop (f.eks med en 10 X-målet) til et konsekvent resultat er oppnådd. Teste at væske er kan pipetted til en rimelig pris (f.eks ~0.5 µL/s) med et aspirator rør montering en annen metode for å sikre at størrelsen er innenfor et akseptabelt område. Fordi injeksjon Pipetter er kalibrert og uteksaminert, kalles den nøyaktige mengden DNA leverte til lateral ventrikkel. Dette er det viktigste steget for å oppnå en ønsket sparseness reproduserbar til en størrelsesorden. Med andre ord, skal en gitt konsentrasjon gi merking innenfor et bestemt område, f.eks 10 til 100 merket neurons.

Viktigste i protokollen er i utero electroporation prosedyren. Vær svært forsiktig mens utsette livmoren. Når trekke ut de siste embryoene fra bukhulen, sørg for ikke å trekke på eggstokkene eller cervix. Bruke tommelen og pekefingeren under microinjection og electroporation gir mild, fingernem manipulasjon av embryo å avsløre den laterale ventrikkel og lar embryoene til skyves forsiktig mot livmor veggen. En svært skånsom touch er kritisk når du håndterer livmoren og embryo. Hvis det er vanskelig å oppnå en mild berøring, bruk ring tang med en innebygd limit-skruen for å hindre tang clamping ned på et embryo eller livmoren, forårsaker skade på vev. En annen vurdering er å administrere både carprofen og buprenorfin umiddelbart før operasjonen, en praksis til gir effektiv smertelindring under i utero operasjonen uten å påvirke embryonale overlevelse priser35 .

I følge våre forenklet histologiske fremgangsmåte, er flere trinn avgjørende. Etter perfusing eksperimentell hjernen med bindemiddel, holde hjernen intakt i skallen å beskytte hjernevevet fra skade under post fiksering. Det er mulig å lagre hjernen i 1% PFA i dager til uker, Merk at fluorescens reduseres som PFA løsningen polymerizes. Kutting 100 µm framskaffet er vanligvis tynne nok til å tillate AC confocal mikroskopi gjennom hele delen samtidig beholde mye av dendrittiske og axonal morfologi. Hvis fiksering oppstod riktig, kan hjernen fra dyr eldre enn P13 monteres på vibrerende mikrotomen med cyanoacrylate lim. Men hvis hjernen for smidig mens skjæring av vibrerende mikrotomen, festes en liten agar eller agarose blokk bak hjernen til å hindre den fra å bøye mens det er å være delt. Hvis problemet ikke er løst, bygge hjernen i agar å danne en blokk å klippe med vibrerende mikrotomen, som foreslått for yngre postnatal hjerner (trinn 5,8).

Denne metoden kombinerer grobunn-lox rekombinasjon systemet med i utero electroporation for å generere mosaikker som kan brukes til å studere funksjonen celle autonome av gener i neurons. Denne metoden kan også konfigureres til å støtte i utero electroporation av genet redigering konstruksjoner (f.eks CRISPR/Cas9)6eller andre stedsbestemte recombinases (f.eks Flp/FRT eller Dre/rox24), som kunne alle designet for å produsere mosaikk hjernevev. En lovende alternativ teknikk som kan brukes til å produsere mosaikk vev er viral levering via intraventricular injeksjon neonatal mus36. Kombinert med intraventricular injeksjon på embryonale aldre som vist her og andre steder15,16,17,18,19,20, 21,22,37, viral vektorer koding for grobunn recombinase kunne leveres før fødselen å infisere floxed progenitor celler på ventrikkel zone. En kritisk vurdering ville være å sikre at viral vektorer er utvannet tilstrekkelig for å oppnå sparsom excision og merking. Men vil dette også resultere i lavere kopi antall Konstruer leveres, inkludert fluorescerende markører avgjørende for nevroanatomi observasjoner (f.eks dendrittiske spines eller arborization)24. Å møte denne fallgruven, nye konstruksjoner med samme strategi som "Supernova" konstruksjoner demonstrert her kan brukes til å oppnå sparsom merking uten en tilsvarende nedgang lysstyrken på merket cellene24. En annen viktig vurdering med viral levering er å sikre at leverte konstruksjoner arrangører gjelder for celle befolkningen blir studert (f.eks eksitatoriske pyramidale nevroner). Intraventricular injeksjon av viral vektorer forårsaker infeksjon av alle vevet rundt ventriklene, inkludert ikke bare ventrikkel sonen av det dorsal telencephalon der kortikale og hippocampus eksitatoriske neurons er generert, men også medialt og lateral ganglionic eminences hvor mange kortikale interneurons er født34. En annen funksjon i utero electroporation forhold til viral levering av konstruksjoner er dens relativt smale vinduet for levering. Virus injisert i laterale ventriklene kan vedvare etter kirurgi, fortsetter å infisere cellene sonen ventrikkel. Derimot oppstår electroporation i sekunder, rettet mot en langt mer spesifikke sett med celler. Dette kan være en fordel eller ulempe å etterforsker, avhengig av subpopulasjon celler studier.

Vår tilnærming støtter grobunn-lox rekombinasjon ved innføring av en enkel konstruksjon eller "Supernova" konstruksjoner. I "Supernova" konstruerer oppfordrer vi etterforskerne å bli kjent med fordelene og begrensningene ved bruk av denne strategien. For eksempel har tidspunktet for grobunn sletting blitt demonstrert for å forekomme innen 2 dager i layer II/III eksitatoriske nevroner i hjernebarken24. Det er derfor sannsynlig at grobunn excision kan oppstå over 48 h etter electroporation, i stedet for umiddelbart etter electroporation. Derfor skal andre former for bekrefter timing og plasseringen av grobunn excision (f.eks bruker en grobunn reporter musen linje) brukes til å utfylle bruk av denne nye teknikken, spesielt i studier der grobunn excision innen liten tid er en kritisk vurdering. En annen potensiell fallgruve er at en liten prosentandel av umerkede celler i et "Supernova" eksperiment kunne uttrykke grobunn recombinase. For eksempel i Figur 3vi co-electroporated to plasmider: en høy konsentrasjon av CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE, og en lav konsentrasjon av TRE-grobunn. TRE er en lekk promoter, kunne grobunn recombinase uttrykkes i celler som fikk TRE-grobunn plasmider, men ikke loxP-stopp-loxP-EGFP-tTA plasmider, selv om dette ville være en sjelden forekomst. I et eksperiment der det er avgjørende at alle umerkede celler har ingen grobunn-mediert excision overhodet, en "Supernova" eksperiment må suppleres med en kontroll eksperiment i hvilket grobunn recombinase uttrykk utenfor merket neurons vurderes gjennom andre betyr (f.eks grobunn recombinase immunohistochemistry).

Oppsummert endres våre protokollen enkelt for å imøtekomme disse nye konstruksjoner, gjør i utero electroporation en enda mer nyttig og praktisk metode for mosaikk analyse. Dermed kombineres i utero electroporation med kraften av rekombinasjon på flere måter å studere mosaikk hjernen vev i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker sjenerøs støtte fra James Madison University Institutt for biologi og James Madison University lys mikroskopi og Imaging anlegg. Dr. Mark L. Gabriele for nyttige råd om unge postnatal vev forberedelse, og Dr. Justin W. Brown og Corey L. Cleland for sjenerøs koordinering av kirurgiske materialer og plass. Denne forskningen ble finansiert delvis av et samarbeidsprosjekt forskningsstipend 4-VA, et samarbeidsprosjekt samarbeid for fremme Samveldet av Virginia (G.S.V.) og av et Virginia akademiet av vitenskap liten prosjektet forskningsstipend (G.S.V.). Støtte har blitt sjenerøst gitt av en Betty Jo kjærlig Butler 58 begavelse for Undergraduate Research stipend (til K.M.B.), en Farrell sommer forskning stipend (til K.M.B.), James Madison University andre århundre stipend (til K.M.B.), en James Madison University Centennial stipend (til C.J.H.), James Madison University Lucy Robinson søk ' 30 Memorial stipend (til Z.L.H.) og en James Madison University College vitenskap og matematikk fakultetet Assistance Grant (til G.S.V.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory #000664 See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice")
GFP.Cre empty vector AddGene #20781 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks.
pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #69138 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK031.TRE-Cre (Supernova) AddGene #69136 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) AddGene #85006 See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato.
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) Qiagen #12362 See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit")
Trypan Blue powder, BioReagent grade Sigma T6146-5G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue")
Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg VWR BDH9286-2.5KG See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl")
Potassium Chloride, ACS, 500 g VWR #97061-566 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl")
Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich S0876-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4")
Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g Sigma-Aldrich P5379-100G See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4")
Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL Fisher Scientific A144-500 See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl")
P-97 Micropipette Puller Sutter Instrument P-97 See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
3.0 mm wide trough filament Sutter Instrument FT330B See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller")
Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID World Precision Instruments TW100-4 See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary")
Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" Phenix LW-8148 See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used.
Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 Teeth World Precision Instruments #14140 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps")
Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503708-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors")
Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack World Precision Instruments #503728-12 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps")
General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply Medrepexpress #2204-c See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges")
Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID World Precision Instruments #503203 See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps")
Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm Sigma-Aldrich CLS3160102-12EA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes")
Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" Amazon B007SHGAHA See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray")
Platinum Tweezertrode, 5 mm BTX #45-0489 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes")
ECM 830 Foot Pedal BTX #45-0211 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal")
ECM 830 Generator BTX #45-0052 See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator")
Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box Harvard Apparatus #72-6468 See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber")
Ophthalmic ointment Hanna Pharmaceutical Supply Co #0536108691 See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment")
Space Gel (AIMS) VWR #95059-640 See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution")
Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula Veet #062200809951 See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream")
10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) Phenix Research Products TSP-10LKIT See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip")
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177 See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly")
Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" Medrepexpress MV-J397 See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures")
“LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive Medrepexpress VG3 See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive")
Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL Sigma-Aldrich Z551546-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe")
BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. Sigma-Aldrich Z192392-100EA See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle")
Nestlets Nesting Material Ancare NES3600 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials")
Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile Bio-Serv S5137 See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds")
Paraformaldehyde, 97% Alfa Aesar A11313 See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA")
Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips World Precision Instruments #501976 See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers")
Agar powder Alfa Aesar #10752 See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar")
Single-edge razor blades, #9 blade Stanley Tools #11-515 See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade")
Specimen disc S D 50 mm Leica #14046327404 See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc")
Buffer tray S assembly Leica #1404630132 See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray")
VT1000 S Vibratome Leica #14047235612 See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome")
Double Edge Razor Blades Personna BP9020 See "5. Histology" (step 5.10 "blade")
Knife Holder S Leica #14046230131 See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder")
Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set Amazon B0089KU6XE See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush")
Superfrost Plus Slides Electron Microscopy Services #71869-11 See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide")
ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml Thermofisher P36970 See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant")
Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 Phenix Research Products MS1415-10 See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip")
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) Sigma-Aldrich D9542 See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI")
Fixed Stage Upright Microscope Olympus BX51WI See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope")
Laser Scanning Confocal Microscope Nikon TE2000/C2si See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope")
4x objective, NA = 0.20 Nikon CFI Plan Apo Lambda 4X See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective")
20x objective, NA = 0.75 Nikon CFI Plan Apo Lambda 20X See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective")
60x objective, NA = 1.40 Nikon CFI Plan Apo VC 60X Oil See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective")

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
  2. Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).
  3. Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons. J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).
  4. Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).
  5. McConnell, M. J., et al. Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons. Science. 342 (6158), 632-637 (2013).
  6. McConnell, M. J., et al. Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network. Science. 356 (6336), eaal1641 (2017).
  7. Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science. 265 (5168), 103-106 (1994).
  8. Hodges, J. L., et al. Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).
  9. Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice. Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).
  10. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic Analysis with Double Markers in Mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  11. Hippenmeyer, S., et al. Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
  12. De la Rossa, A., Jabaudon, D. In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation. Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).
  13. Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function. Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).
  14. Duan, Y., et al. Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells. eLife. 3, 1-24 (2014).
  15. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
  16. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
  17. Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity. J. Vis. Exp. (120), (2017).
  18. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
  19. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
  20. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).
  22. Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4163 (2012).
  23. Mizuno, H., et al. NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  24. Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci. Rep. 6, 35747 (2016).
  25. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).
  26. Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
  27. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).
  28. Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2. Nature. 481, 195-198 (2011).
  29. Scotto-Lomassese, S., et al. Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).
  30. Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd ed, Addgene. Cambridge, Massachusetts. (2017).
  31. Pipette Cookbook. , rev. ed, Sutter Instrument Company. Novato, California. (2015).
  32. Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232 (2014).
  33. Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois. (2013).
  34. Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes. Science. 28 (5337), 474-476 (1997).
  35. Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).
  36. Kim, J. -Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
  37. Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).

Tags

Nevrovitenskap problemet 129 utvikling hjernebarken celle autonome gen levering grobunn recombinase loxP i utero electroporation dendrittiske spines mosaicism gevinst på funksjonen tap av funksjon
Inducing grobunn-lox rekombinasjon i musen hjernebarken gjennom <em>In Utero</em> Electroporation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bland, K. M., Casey, Z. O.,… More

Bland, K. M., Casey, Z. O., Handwerk, C. J., Holley, Z. L., Vidal, G. S. Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (129), e56675, doi:10.3791/56675 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter