Summary
Cell-autonoma funktioner av gener i hjärnan kan studeras genom att inducera förlust eller vinst på funktion i glesa populationer av celler. Här beskriver vi i livmodern elektroporation för att leverera Cre recombinase i glesa populationer av utveckla kortikala nervceller med floxed gener att orsaka förlust av funktion i vivo.
Abstract
Cell-autonoma neuronala funktioner av gener kan avslöjas genom orsakar förlust eller vinst på funktionen av en gen i en liten och gles befolkning av nervceller. För att göra detta kräver genererar en mosaik där nervceller med förlust eller vinst av funktionen av en gen omges av genetiskt oberörd vävnad. Här kombinerar vi Cre-lox rekombination systemet med Utero elektroporation för att generera mosaik hjärnvävnaden som kan användas för att studera cell-autonom funktion av gener i nervceller. DNA-konstruktioner (tillgängligt via databaser), som kodar för en fluorescerande etikett och Cre recombinase, införs i utveckla kortikala nervceller som innehåller gener flankerad med loxP platser i hjärnan hos musembryon som använder i utero elektroporation. Dessutom beskriver vi olika anpassningar till metoden i livmodern elektroporation som ökar överlevnadsförmågan och reproducerbarhet. Metoden innebär också att upprätta en titer för Cre-medierad rekombination i en gles eller tät population av nervceller. Histologiska preparat av märkt hjärnvävnaden inte kräver (men kan anpassas till) immunohistokemi. Konstruktioner används garanterar att fluorescently märkt nervceller bära genen för Cre recombinase. Histologiska preparat kan Morfologisk analys av nervceller genom confocal avbildning av dendritiska och axonal arbors och Dendritutskotten. Eftersom förlust eller vinst av funktion uppnås i glesa mosaik vävnad, tillåter denna metod studien av cell-autonoma nödvändighet och tillräckliga gen produkter i vivo.
Introduction
Generera en genetisk mosaik är en klassisk experimentella paradigm för att förstå funktionen av en gen av intresse. För att avgöra om en gen är nödvändigt för en cellulär fenotyp, orsakar det enklaste tillvägagångssättet en förlust av funktion av genen i hela organismen (t.ex. knockout). Men för att avgöra om en gen krävs specifikt i en viss celltyp, är knockout av genen i hela organismen inte en giltig metod. I stället krävs en metod som kommer att orsaka förlust av funktion av en gen i en viss cell medan det är omgivet av vildtyp (dvs genetiskt oberörd) vävnad — med andra ord, skapa mosaik vävnad. Om den muterade cellen visar en mutant fenotyp, men omgivande vildtyp celler inte, gen funktionerna i en cell-självständigt sätt. Analys av mosaik vävnad, som muterade celler omges av vildtyp vävnad, är idealisk för att förstå cell-autonoma funktioner av gener, särskilt i hjärnan där nervceller och glia bildar ett sammanhängande nätverk av vävnad.
Flera former av mosaik hjärnvävnad har gett kraftfulla modeller för att undersöka cell-autonoma funktioner av gener. Studier inriktade på neuronal transplantation1, kvinnliga X-länkade mosaicism2,3,4, och endogena somatisk mosaicism5,6 har dragit sina slutsatser baserat på mosaik hjärnvävnaden. Villkorliga radering av en gen via systemets Cre-lox rekombination är en metod som utnyttjar stora tillgången på transgena möss linjer. Den här metoden introduceras två loxP platser på vardera sidan av en krävs sekvens av en gen (till exempel en exon), lämnar den flankerad av loxP platser att både möta i samma riktning (”floxed”). CRE recombinase punktskatter sekvensen mellan loxP platser7. CRE-medierad rekombination kan uppnås genom korsning floxed möss till en annan mus linje uttrycker Cre recombinase tillsammans med en fluorescerande markör i en delmängd av celler (”Cre reporter line”). Detta har visats i en mängd olika sätt att avslöja en gen hos grupper av celler, till exempel excitatoriska nervceller eller astrocyter8funktioner. CRE reporter linjer kan uttrycka CreERT2 för att tillåta Cre-medierad rekombination vara drog-inducerbara (singel-neuron märkning med inducerbara Cre-medierad knockout eller SLICK)9. I en annan strategi kallas mosaik analys med dubbel markörer (MADM)10,11, tillåter Cre-medierad interchromosomal rekombination en homozygot muterad skapas tillsammans med heterozygot vävnad. I dessa synsätt behöver en ny linje av möss produceras varje gång för varje kandidat gene eller cellulära subtyp som testas. Alternativt, Cre recombinase kan införas efter födseln via Jontofores12 eller virala vektorer (t.ex. adeno-associerade virus13 eller lentiviruses14 transporterar cellulära subtyp-specifika initiativtagare). Denna strategi skapar starka och postnatal märkning. För att rikta utveckla hjärnans kortikala nervceller glest och prenatalt, är en idealisk strategi i livmodern elektroporation av Cre recombinase med en fluorescerande markör.
Förutom att kombinera Cre-lox rekombination genom Utero elektroporation att producera mosaik vävnad i vivo, vi introducera flera anpassningar till förfaranden från andra publicerade protokoll15,16, 17,18,19,20,21. Vi tillhandahåller information för att förbättra framgång i avel timed-dräktiga honor. Vi beskriver också våra två strategier för att införa glesa och ljusa märkning av nervceller i kortikal vävnad: en strategi är att titrera nivåerna av en enda konstruktion som kodar för Cre recombinase och en fluorescerande markör22. En annan strategi är att använda ”Supernova” system, designad speciellt med dessa parametrar i åtanke23,24. Dessutom erbjuder vi förbättringar på producerar konsekvent Mikroskop pipetter och förenklingar till Utero elektroporation kirurgi. Slutligen beskriver vi kritiska stegen i en förenklad histologiska preparat som tillåter analys av Dendritutskotten och dendritiska och axonal arbors, utan ytterligare färgning eller immunohistokemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Metoderna som beskrivs här har godkänts av djur vård och användning kommittén (ACUC) av James Madison University och är i enlighet och alla relevanta rättsliga och institutionella riktlinjer följs.
1. mus Set-up
- Hus en ung (> P60) manliga och kvinnliga homozygot floxed mus tillsammans för att ställa in en uppfödare par25.
Obs: En bra negativ kontroll är att ställa in en ytterligare uppfödare par vildtyp möss, i vilka Cre recombinase uttryck inte kommer att orsaka en mosaik26. - Låt honan att föda och höja sin första kull med hanen. Hålla manlign tillsammans med honan att öka kullens överlevnad. Efter avvänjning kullen, e.g. vid postnatal dag (P) 21, separera hona och hane.
-
Murina avel
- Ställa in en tidsinställd parning mellan de kvinnliga och manliga25. Använda visuella ledtrådar att bestämma brunst cykeln av de kvinnliga27, och kontrollera för vaginal pluggar på morgonen efter parning25.
- Om en kontakt är grunda, separera, och väga honan. Räkna dagen som embryonala dag (E) 0,5.
- Fortsätt väger honan var 3-5 dagar för att avgöra om hon är gravid. Gravida kvinnor har en 10-20% ökning i kroppsvikt 7-10 dagar efter befruktningen (E0).
Obs: Det här steget bekräftar graviditeten tidigare och mer tillförlitligt än okulärbesiktning25. - Om honan inte är gravid, upprepa steg 1.3.1-1.3.3.
- När graviditeten är bekräftad, välja datum för den i livmodern elektroporation. För att rikta layer II/III kortikala pyramidala neuronala stamfäder, utföra elektroporation på E15.5.
2. DNA set-up
- Välja en enda DNA konstruera de koderna för Cre recombinase samt en fluorescerande markör, såsom grönt fluorescerande protein (GFP)28,29. Alternativt kan du använda systemets ”Supernova”, beskrivs i detalj i tidigare publikationer23,24. Se lista över material till exempel konstruerar.
- Förstärka den DNA construct(s) från steg 2.1 i E. coli använder standard mikrobiologiska tekniker30.
- Rena den DNA konstruktionen med ett kit för rening av endotoxinfria plasmid följa tillverkarens instruktioner. Eluera konstruera med endotoxinfria vatten.
Obs: Att välja ett endotoxinfria rening kit över en standard rening kit är kritisk. - Koncentrera sig DNA eluatet 1-3 mg/ml beroende på önskad märkning densitet26.
Obs: En titer måste alltid upprättas när du arbetar med en ny DNA-konstruktion, med tanke på att de har olika längder och initiativtagare. Överväga att injicera en konstruktion på flera olika koncentrationer och/eller belopp att bedöma uttryck. Till exempel injektion av 1 µL eller 1,5 µL av 2,0 mg/mL GFP. CRE är kunna orsaka sparse (1 µL) eller tät (1,5 µL) märkning av lager II/III visuella kortikala pyramidala nervceller26. - Lägg till 0,4% trypan blå 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 i H2O, justerad till pH 7,4 med HCl) 1:10 till DNA stamlösning.
- Lägga till 10 x PBS 1:10 DNA stamlösning.
- Lagra DNA stamlösning vid 4 ° C. Lösningen kan förvaras på obestämd tid.
3. Pipettera Set-up
-
Med hjälp av glas kapillär avdragare, dra en pipett med en mycket lång (10-15 mm) kona och mycket fin spets, typiska pipettstorlekar för embryonala stamceller injektion eller kärnöverföring31.
Obs: För att förhindra skräp från att förorena pipetterna, de bör göras inom 2 dagar efter operationen.- Kalibrera den glas kapillär avdragare genom att utföra en ramp test, efter tillverkarens anvisningar. Använd värme resultatvärdet programmera ett drag-protokoll med följande parametrar: värme = (ramp testvärde + 15), dra = 30, vel = 120, tid = 100, tryck = 200. Infoga glas kapillären, fästa klämmorna på avdragare och aktivera programmerade dragande protokollet, att skapa en Kona på glas kapillären.
- Säkerställa att Kona längd är mellan 10-15 mm med en förening ljusmikroskop (t.ex. 10 X mål)31.
-
Bryta tillbaka pipetten för att bilda ett grov-edged tips till 20-25 µm diameter.
- Centrera ett enkeltvinnat uppgift torka (se lista över material) över en 50 mL bägare och stretch torka spänd med ena handen. Med den andra handen, håll och tryck pipett (Kona sida ner) vinkelrätt och fullt genom centrum av det torka, orsakar en clean break i Kona31.
Obs: Driver pipetten helt genom torka kommer att producera en 20-25 µm diameter spets ca 70% av tiden. - Bekräfta i sammansatta ljus Mikroskop (t.ex. 20 x mål).
Varning: Använd ögonskydd samtidigt bryta glaset.
- Centrera ett enkeltvinnat uppgift torka (se lista över material) över en 50 mL bägare och stretch torka spänd med ena handen. Med den andra handen, håll och tryck pipett (Kona sida ner) vinkelrätt och fullt genom centrum av det torka, orsakar en clean break i Kona31.
- Kalibrera en pipett av utvärderingsenheten 1 µL 0,4% trypan blå i 1 x PBS i en delvis fyllda piptte, sedan examen pipetten med 1 µL markeringar baserat på höjden av 1 µL i pipetten, med en spetsig alkoholbeständigt markör. Använda kalibrerade pipetten för att ta examen andra pipetterna innan kasta. Hålla pipetter i en pipett innehavaren fri från damm och andra partiklar.
4. in Utero elektroporation
- Placera Graefe pincett, iris sax, Hartman mygga pincett, non-woven kompress svampar, ring-tipped pincett och petriskålar på en rostfri bricka, och vira med aluminiumfolie. Placera magasinet och 1 L 0,9% koksaltlösning (0,9% wt/vol NaCl i vatten) i autoklav. Autoklav vid 121 ° C och 3,5 kPa för 40 min. ta bort från autoklav och placera i en desinficerad kirurgiska området.
Obs: Det är viktigt att upprätthålla sterila förhållanden under operationen. - Värm 1 L Ånghärdad saltlösning flaskan i ett litet vattenbad till 38 ° C minst 2 h innan operationen.
- Anslut tweezer-typ elektroderna och fotpedalen till generatorn (se lista över material). Efter tillverkarens instruktioner, ställa in generatorn att leverera fem 50 ms pulser av 50 V (med 950 ms intervall) när utlöses av fotpedalen. Desinficera tweezer-typ elektroderna och placera på desinficeras kirurgiska området.
- Göra en anestesi näsan konen som tidigare publicerade32, men använder i slutet av en Nitril eller latexhandske finger för att bilda en membran som passar säkert över näsan konen öppning. Skär ett hål i mellangärdet tillräckligt stor för att passa över musens nos.
- Djupt söva dräktiga möss på E15.5 i en induktion kammare fylld med isofluran (2-4%) i rent syre flyter på 1 L/min. Efter ~ 1 min, testa den rätande reflexen (försiktigt luta induktion kammaren och säkerställa att musen inte gör rätt själv). Väga musen för att fastställa doser av smärtlindring ges senare under operationen.
- Flytta musen till det kirurgiska området och administrera inhalerade isofluran (1-2%) i rent syre flyter på 1 L/min via en Kona att upprätthålla mus i kirurgiska plan. Använd tången för att testa pedal reflexen (Nyp tass försiktigt och se till att musen inte återvänder en reflex) att verifiera anesthetization. Övervaka andningsfrekvens och ansträngning, letar djup, regelbunden andning (~ 70-100 andetag/min), och att slemhinnor är rosa i färg och fuktig.
- Applicera tillräckligt veterinärmedicinska oftalmologiska salva över ögonen för att täcka dem helt för skydd mot uttorkning under förfarandet.
- Flex metall aktivator skivan av en förseglad påse fylld med övermättad salt lösning (se lista över material), aktivera en exoterm kristallisation av salt. Låg 2 enkeltvinnat uppgift våtservetter ovanpå påsen och Placera musen på påsen att upprätthålla kroppstemperaturen.
- Massera hårborttagningsprodukter grädde på buken med bomullspinnar tills buken päls upplöser (cirka 20-40 s), sedan torka av buken päls. Ren försiktigt bort all kvarvarande rester och hårborttagningsprodukter kräm med 70% etanol och bomull svabb. Placera en fenestrated sterila kirurgiska draperi över buken.
- Med aseptisk teknik, dra huden upp och bort från buken med Graefe pincett, och gör en ~ 2 cm ventrala mittlinjen snitt på huden med hjälp av iris sax, säkerställa att underliggande muskel inte klipps.
Obs: Ett godtagbart alternativ till att göra ett snitt med Graefe pincett och iris sax är att använda en skalpell, som tidigare publicerade17. - Hitta linea alba att visualisera mittlinjen av den rectus abdominis. Dra muskler upp och bort från buken med Graefe pincett, och göra en annan ~ 2 cm mittlinjen snitt det med iris sax, utsätta bukhålan (livmodern är genomskinlig och embryon kommer att synas under). Se till att underliggande uterin och intestinal vävnad inte skärs. Gör i snitt endast tillräckligt stora (vanligtvis ~ 2 cm) att dra ut och exponera livmodern bekvämt.
Obs: Ett godtagbart alternativ till att göra ett snitt med Graefe pincett och iris sax är att använda en skalpell, som tidigare publicerade17. - Med hjälp av en steril 10 µL mikropipett spets, fördela karprofen (upplöst i steril 0,9% koksaltlösning) 4 mg/kg i bukhålan för analgesi.
- Klämma en Hartman mygga tången på den vänstra kanten av rectus abdominis snittet. Vila tången på välte petriskål till vänster om snittet, att hålla till vänster om snittet öppna. Klämma en annan Hartman mygga tången på den högra kanten av rectus abdominis snittet och vila tången på en välte petriskål till höger om snittet, att hålla till höger i snitt öppna. Placera gasväv svamp runt området i snittet.
- Använda ringen pincett (utan en bifogad gräns skruv), dra på livmodern mellan vilka två angränsande embryon utan krossning eller skadar någon vävnad. Börja att dra ut alla embryon genom snittet, lägga dem ovanpå gasväv svamp. När du drar ut de sista embryona från bukhålan, se till att inte dra på äggstockarna eller livmoderhalsen. När utsatta, är det viktigt att hålla livmodern fuktig med varm saltlösning. Livmodern består vanligtvis av mellan 5 och 8 embryon.
Obs: Det är möjligt att lägga till penicillin och streptomycin till saltlösning17. - Ansluta en kalibrerad pipett till församlingens hygienfilter tube (se lista över material), och injicera exakt 1 µL av DNA lösningen bereddes i steg 2 genom livmoderväggen in en laterala ventrikeln av varje embryo. Laterala ventriklarna visas som två fläckar på den dorsala telencephalon av embryot (patchar är mörkare än omgivande vävnad av telencephalon). Använd tummen och pekfingret under mikroskop och elektroporation för att manipulera de embryon, avslöjar de laterala ventriklarna och låta embryona som pressas försiktigt mot livmoderväggen under injektionen. Bekräfta lyckad injektion genom att observera trypan blå fyllning den laterala ventrikeln.
- Placera katoden tweezer-typ elektroder (se lista över material) på livmodern, direkt över den mediala och stjärtfenan cortexen att rikta syncentrum (inriktning alternativa områden av hjärnan kommer att kräva olika elektrodplacering)16, 26. Placera anoden på livmodern, bara underlägsen och anterior embryots huvud.
- Bekräfta att anoden och katoden vidrör livmodern kring embryot på lämpliga platser. Med en fotpedal, utlösa leverans av fem 50 ms pulser av 50 V (med 950 ms intervall) över elektroderna.
Obs: Den injicerade, negativt laddade DNA flyttas mot katoden och kommer att införlivas i ventrikulära zon cellerna närmast katoden. - Tillbaka i livmodern till bukhålan i samma riktning konstaterades. Använd saltlösning för att smörja livmodern medan leder det manuellt och extremt försiktigt, noga med att inte förskjuta embryon från sin position i livmodern.
- Stäng magmusklerna med resorberbara suturer (se lista över material) med en enkel avbrutna söm, knyta ändarna med en kirurg 's Knut. Gör inte klipp ändarna för nära knuten eller Knut blir knäppte.
Obs: Det är kritiska till suturen magmusklerna så att kanterna på såret helt stängd stänga, men utan orsakar blanchering av muskeln. Knop bör vara tätt så att de inte kan vara knäppte. - Stäng hudlagret med resorberbara suturer (enkel avbrutna stygn, kirurgen 's knot, som i steg 4.19). Applicera en liten mängd vävnad lim som förseglar såret. Applicera adhesiv i vävnad på knutar att förhindra lossa. Använd en mikropipett för att avlägsna häftmassa vävnad som omger såret som kan vara aspirerade av en mikropipett.
- Lägre isofluran nivåer att 0,5-1,5%. När vävnad limmet är torrt (test genom att trycka på handsken som lim), bort från isofluran och låt kvinnliga återhämta sig ensam i en varm bur. Administrerar buprenorfin intraperitonealt 0,03 mg/kg med en 1 mL spruta med en 26G, ½ ”nål.
- Fortsätta att övervaka musen tills musen är helt återhämtat sig och beter sig normalt (dvs grooming, utforskar buren, äta eller dricka). När återvunna, placera kvinnliga tillbaka i buren med manliga.
Obs: Om alla steg följs, kommer musen vanligtvis återfår medvetandet inom 2 min och omedelbart börja röra sig om buren, visar inga tecken på obehag. - Om musen uppvisar tecken på obehag (t.ex. böjd kroppshållning, porphyrin sekret)33, administrera karprofen vid 0,1 mg/mL i vattenförsörjning. Om flera tecken på obehag är närvarande, eller om besvär kvarstår i mer än 4 h trots karprofen administration, omedelbart avliva musen genom att administrera en intraperitoneal giftinjektion av ketamin (240 mg/kg) - xylazin (48 mg/kg)- Acepromazin (1.85 mg/kg) cocktail med en 1 mL spruta med en 26 G, ½ ”nål, och följa med en godkänd sekundär form av dödshjälp33.
- För att öka överlevnaden av electroporated embryon efter födseln, hålla buren i ett lugnt hålla rummet, fri från ljud och vibrationer. Berika miljön med plast igloos, häckande material och kosttillskott såsom solrosfrön (se lista över material). Inte flytta eller störa buren, särskilt under de första 3 dagarna efter förlossning.
5. histological förberedelser för fluorescensmikroskopi
Obs: Detta histologi protokoll är optimerad för att förbereda vävnad från djur äldre än postnatal dag (P) 13 som var electroporated i livmodern. För att förbereda vävnad från yngre postnatal djur (P0-P13), rekommenderas det att följa alla steg (inklusive transcardial perfusion), även om hjärnan ska bäddas in agar före förbereda sektioner (steg 5,9). Vävnaden kan även framställas från embryon inom 1-2 dagar efter elektroporation, använda metoder beskrivs tidigare18,20.
-
Bered PARAFORMALDEHYD (PFA).
Obs: Det är absolut nödvändigt att förbereda färska PFA, inom en dag av experimentet.
Försiktighet: PARAFORMALDEHYD är giftig och bör hanteras i dragskåp med lämplig personlig skyddsutrustning.- Att göra 50 mL 4% PFA, värme 40 mL vatten till 60 ° C. Tillsätt 2 g PFA omröring med glasbar stav eller omrörning. Tillsätt 10 µL 10 M NaOH varje 2 min tills PFA upplöser.
- Tillsätt 5 mL 10 x PBS och lösning till en slutlig volym 50 ml med vatten.
- Efter att 50 mL lösning, justera pH till 7,4 som behövs med 10 M HCl. Tillåt lösning svalna och förvaras vid 4 ° C.
- Avliva musen med en intraperitoneal injektion av ketamin (240 mg/kg) - xylazin (48 mg/kg) - Acepromazin (1.85 mg/kg) cocktail med en 1 mL spruta med en 26G, ½ ”nål. Transcardially BEGJUTA 10 eller 20 mL iskallt 1 x PBS, följt av 25 eller 40 mL nygjord, iskall 4% PFA17. Använda lägre volymer för unga postnatal (P0-P13) möss och högre volymer för äldre möss (P14 och ovan).
- Omedelbart efter perfusion, halshugga mus slaktkroppen mellan Nackknölen och C1 kotan med en stor sax och skala bort och kassera de flesta av huden runt skallen med iris sax, särskilt huden omgivande frontal, parietala och occipital ben. Håll skallen och hjärnan intakt.
- Placera skallen och hjärnan i 10 mL 4% PFA i en 50 mL konisk tub för 24 h vid 4 ° C fixar efter vävnad. Lägg sedan till 30 mL 1 x PBS koniska tube att späda lösningen på 1% PFA för lagring vid 4 ° C.
Obs: Använd en separat konisk slang för varje skallen och hjärnan skall fastställas efter. Inte Inkubera hjärnan i 1% PFA längre än 2 veckor eller fluorescens börjar blekna. - Plats hjärnan och skalle på en plan yta med enkeltvinnat uppgift våtservetter fuktad med 1 x PBS. Använda ett par pincett (se lista över material) för att ta bort alla återstående hud eller membranet som omger skallen.
- Använda pincett, först ta bort Nackknölen, sedan försiktigt bort de parietala ben, flytta pincetten ut och bort från ytan av hjärnan. Ta försiktigt bort eventuella hjärnhinnorna för att förhindra skador till cortex.
- Kil baksidan av pincetten under hjärnan längs skallen att bryta alla kranialnerver och ta bort hjärnan.
-
För unga postnatal (P0-P13) hjärnor
- Gör 25 mL 4% agar genom värme 25 mL 1 x PBS till 80 ° C. Rör om och lös upp 1 g agar med glas stav eller omrörning bar).
- Cool lösning till 35 ° C samtidigt som du rör om. Placera hjärnan i en liten behållare (t.ex. den gemensamma jordbrukspolitiken i en 50 mL konisk tub) och häll agar lösningen över hjärnan. Tillåta agar härda.
- Göra ett koronalt snitt manuellt med en singel-rakblad genom hjärnan, ca 0,5 mm rostralt om bregma. Gör en annan koronalt snitt genom hjärnans cirka 0,5 mm kaudalt till syncentrum. Placera en pool av cyanoakrylat lim med samma diameter som det rostralt slutet av hjärnan på mitten av vibrerande mikrotomen Preparatskivan. Placera i rostralt slutet av hjärnan ovanpå poolen av lim, att säkerställa att hela rostralt ytan av vävnad är bundet till Preparatskivan med lim.
- Montera buffertbrickan på vibrerande mikrotomen och säkra med inbyggda spännspaken. Infoga bladet i knivhållaren och Montera knivhållare till vibrerande mikrotom med inbyggda klämskruven. Säkra objektbrickan med hjärnan på buffertbrickan med inbyggda fastspänningsanordning. Inställda hastighetsinställning till 5,70 (= 0,285 mm/s), och frekvens inställning till 5,33 (53,3 Hz).
- Fyll i kammaren över nivån av hjärnan med 1 x PBS och sänka bladet i PBS. Börja ta 100 µm koronalt avsnitt genom vävnaden.
-
Om inte kräver ytterligare bearbetning, såsom 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) nukleär färgning eller immunohistokemi.
- Använd en fin lutad pensel för att överföra sektioner direkt från vibrerande mikrotomen på ett objektglas, passande 4-6 sektioner på varje bild.
- Tillåta avsnitten torka av fuktspridande bort lösning med en fin lutad pensel, så att hjärnan skivor längre glida på bilderna.
- Sedan placera en droppe av monteringsmedel (se lista över material) på varje avsnitt på bilden.
- Försiktigt lägga ett 24 x 50 mm täckglas på toppen, att 1) inga luftbubblor form på avsnitten, 2) avsnitten inte flytta, och 3) monteringsmedel helt täcker området mellan bild- och täckglas. Låt den monteringsmedel att bota för minst 24-48 h.
-
Att färga atomkärnor med DAPI för Histologisk undersökning av kortikala bladskivan
- Använd en fin lutad pensel för att överföra varje avsnitt till en lösning som innehåller 10 µg/mL DAPI (se lista över material) utspätt i 1 x PBS från stamlösning (20 mg/mL DAPI i vatten).
- Inkubera i DAPI lösning för 5 min i rumstemperatur och sedan använda en fin lutad pensel att överföra avsnitt från DAPI lösning till 1 x PBS och inkubera i 1 x PBS för 5 min i rumstemperatur. Överföra avsnitt två gånger till färska 1 x PBS för 5 min varje. Sedan använda en fin lutad pensel, överföring avsnittet på ett objektglas, Följ steg 5.11.2-5.11.4 och fortsätta med steg 5.13.
- Värm en glas Petri maträtt som innehåller Valap (lika delar vaselin, lanolin och paraffin) på en värmeplatta med en låg värme inställning tills helt smält. Seal utsatta kanterna på bilder genom att borsta på smält Valap.
- För att inspektera fluorescens i vävnad, använda ett ljusmikroskop eller confocal Mikroskop (se lista över material) och ett filter lämpligt för visning av fluorophore (e.g. DAPI: excitation 325-375 nm, emission 435-485 nm. GFP: excitation 450-490 nm, emission 500-550 nm)17. Confocal bilder kan tas med låg - (4 X, numerisk bländare, NA = 0,20), medium-(20 X, NA = 0,75), och hög effekt (60 X, NA = 1,40) mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Enda konstruera GFP. CRE (se lista över material) var electroporated på E15.5 och visualiseras på P14. Beroende på koncentrationen av konstruera och volymen av injektion, kan en gles eller tät följd erhållas22,26. Till exempel injektion av 1 µL av 2 mg/mL GFP. CRE resultat i en gles fördelning av märkta celler, av vilka några kan vara ljusa (figur 1A) och lokaliserad i layer II/III (figur 1B). Eftersom vävnaden är 100 µm tjocka, bevaras de flesta av de dendritiska arbors (figur 1 c). Dendritutskotten kan observeras vid höga förstoringar (60 X; Figur 1 d). Injektion av 1,5 µL vid samma koncentration resulterar i mycket tät märkning (figur 2A) i layer II/III (figur 2B), som kan vara suboptimal eftersom det är svårt att spåra källan till neuriter och Dendritutskotten (figur 2 c). Dock är det fortfarande möjligt att avbilda en neuron (figur 2D) och dess processer (figur 2E) genom att välja en ljus cell i peripheryen av märkta området (figur 2D).
Slutligen är det möjligt att maximera nervceller ljusstyrka samtidigt som en gles fördelning av märkta celler. Supernova-GFP var här, (se lista över material) electroporated på E15.5 och visualiseras på P23. Observera att, baserat på observationer av hjärnvävnaden som tas vid olika postnatal ålder, det verkar inte vara en effekt av ålder på ljusstyrkan på alla fluorescerande konstruktioner används här23,24,26. Injektion av 1 µL av en blandning som innehåller 1 mg/mL Sn-GFP (CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE) och 10 µg/mL TRE-Cre resultat i en gles fördelning av mestadels ljusa celler (figur 3A) i layer II/III (figur 3B). Dendritiska och axonal processer (figur 3B) och Dendritutskotten (figur 3 c) kan visualiseras. Vår erfarenhet, inriktning med antingen en enda konstruktion såsom god Jordbrukarsed. CRE eller med ”Supernova” konstruktioner reproducibly ger uttryck i minst 75% av electroporated embryon.
Figur 1: Sparse och ljusa uttryck efter Utero elektroporation med en enda konstruera innehållande GFP och Cre recombinase. (A) låg förstoring (4 X) fluorescens Mikrograf av hjärnbarken på P23, efter elektroporation på E15.5. (B) Medium förstoring (20 X) fluorescens Mikrograf av DAPI nukleära fläcken, avslöjar kortikala laminering (lager I, II/III, IV och lager djupt till IV). (C) Medium förstoring (20 X) fluorescens Mikrograf av en enda neuron. (D) hög förstoring (X 60) fluorescens Mikrograf av Dendritutskotten. Skala barer = 200 µm (A). 100 µm (B, C); och 5 µm (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Tät och ljusa uttryck efter Utero elektroporation med en enda konstruera innehållande GFP och Cre recombinase. (A) låg förstoring (4 X) fluorescens Mikrograf av hjärnbarken på P14, efter elektroporation på E15.5. (B) Medium förstoring (20 X) fluorescens Mikrograf av DAPI nukleära fläcken, avslöjar kortikala laminering (lager I, II/III, IV och lager djupt till IV). (C) Medium förstoring (20 X) fluorescens Mikrograf av nervceller i området i tätaste märkning. (D) Medium förstoring (20 X) fluorescens Mikrograf av nervceller som tagit i utkanten av området i tätaste märkning. (E) hög förstoring (X 60) fluorescens Mikrograf av Dendritutskotten. Skala barer = 200 µm (A). 100 µm (B, C, D); och 5 µm (E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Sparse och ljusa uttryck efter Utero elektroporation med Supernova-GFP konstruktioner som innehåller GFP och Cre recombinase. (A) låg förstoring (4 X) fluorescens Mikrograf av hjärnbarken på P14, efter elektroporation på E15.5. (B) Medium förstoring (20 X) fluorescens Mikrograf av DAPI nukleära fläcken, avslöjar kortikala laminering (lager I, II/III, IV och lager djupt till IV). (C) Medium förstoring (20 X) fluorescens Mikrograf av en enda neuron. (D) hög förstoring (X 60) fluorescens Mikrograf av Dendritutskotten. Skala barer = 200 µm (A). 100 µm (B, C); och 5 µm (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här introducerar vi kombinationen av Utero elektroporation med Cre recombinase i floxed möss att generera mosaik hjärnvävnad. En fördel med detta tillvägagångssätt är att en ny mus rad inte behöver genereras varje gång en annan cellulär undertyp ska riktas: Utero elektroporation kan användas för att rikta excitatoriska nervceller, hämmande nervceller eller glia beroende på tid och plats för elektroporation15,16,17,18,19,20,21,34. I vår strategi är inriktning hjärnbarken konsekvent och reproducerbart eftersom vi använder 5 mm diameter elektroporation elektroder som kan placeras över ett stort område av den framkallande telencephalon. För att rikta alternativa platser i hjärnan (t.ex. diencephalon, näthinnan), eller för mer specifik inriktning på regioner inom hjärnbarken, förfaranden och elektroder utformat uttryckligen för detta ändamål kan vara begagnade15, 16. Vi tillhandahåller även en enkel konstruktion som ger ljusa märkning och garanterar att varje fluorescently-märkt neuron innehåller Cre recombinase. En nackdel med att använda en enda konstruktion för att uppnå ljusa märkning är att märkt befolkningen kan vara alltför tät (figur 2 c), men detta kan lösas genom imaging celler i periferin av märkta området (figur 2D). Alternativt, uttryck av en fluorescerande konstruktion kan utformas beror på Cre recombinase uttryck17, men låga nivåer kan kräva immunfärgning för den fluorescerande markören. Denna begränsning tas upp av systemet ”Supernova” Cre-beroende fluorescerande markör uttryck (figur 3A)23,24.
Förutom att kombinera Cre-lox rekombination med Utero elektroporation, erbjuder vi flera förbättringar för optimal avel av timed-dräktiga honor. Det är viktigt att hålla mössen i en anläggning-rum som är fri från ljud och vibrationer som orsakas av utrustning såsom laminär huvor. Berika miljön med plast igloos, häckande material, och kosttillskott som solrosfrön (se lista över material). Utöver miljöhänsyn, har vi märkt att den första kullen av en kvinna vanligtvis har lägsta överlevnaden. Således föreslår våra protokoll vänta tills den andra graviditeten av honan att utföra i livmodern elektroporation. Medan denna strategi ökar överlevnaden av kullen, tenderar det också att öka kullstorlek, vilket kan förlänga kirurgisk tid och därmed sänka framgången för operationen. Därför, om stöter ett särskilt stort antal embryon (t.ex. fler än 8), föreslår vi hoppa över elektroporation på några av embryona, särskilt embryon närmast äggstockarna och livmoderhalsen, där vävnaden är mest benägna att skada. Dessutom tenderar använder samma miljö anrikning strategi nämns ovan (plast igloos, häckande material, kost kosttillskott) att öka överlevnaden av valpkullar efter födseln. Det är också viktigt att notera att brunst kan uppstå i honan några timmar efter förlossning av första kullen. I det här fallet kan honan föda sin andra kull, sedan separera efter avvänjning för att försöka tidsinställda parning. När du letar vaginal pluggar, är det god praxis att separera honan även om en kontakt inte hittas, särskilt om honan var i brunst kvällen innan. Pluggar i vissa stammar är svåra att upptäcka och befruktningen kan ha redan inträffat.
En annan är förbättring producera adekvat Mikroskop pipetter för i livmodern elektroporation. Dra pipetter DNA injektionsvätska i laterala ventriklarna är ett viktigt steg. Här, tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att ställa in pipetter med en konsekvent storlek och grov spets kant. Andra metoder inkluderar att bryta tillbaka spetsen med en skalpell blad15 eller nyper bort spetsen med peang16,17. Observera att om pipettspetsar är för små, de kommer korrekt punktera livmoderväggen men injektion flöden blir för låg, förlänger den tid där pipetten lämnas i embryonala hjärnan. Om pipettspetsar är alltför stora, kan de skada livmoderväggen och embryonala hjärnan. Om pipettspetsar är alltför släta, kommer de orsaka en stor divot i livmoderväggen eller embryonala skalle innan bryta igenom, möjligen skada embryot. Praxis att skapa en grov paus för att producera en 20-25 µm spets och inspektera tips under en enkel ljusmikroskop (t.ex. med ett 10 X-objektiv) tills ett konsekvent resultat uppnås. Testa att vätska kan vara är pipetteras i rimlig takt (e.g. ~0.5 µL/s) med en insugningsventil tube församling en annan metod för att säkerställa att storlek är inom ett godtagbart intervall. Eftersom injektion pipetterna är kalibrerade och examen, är den exakta mängden DNA som levereras till den laterala ventrikeln känd. Detta är det mest kritiska steget för att uppnå en önskad gleshet reproducibly till en storleksordning. Med andra ord, bör en viss koncentration ge märkning inom ett visst intervall, t ex 10 till 100 märkta nervceller.
Det viktigaste steget i protokollet är det i livmodern elektroporation förfarandet. Vara extremt skonsam samtidigt exponera livmodern. När du drar ut de sista embryona från bukhålan, se till att inte dra på äggstockarna eller livmoderhalsen. Med hjälp av tummen och pekfingret under mikroskop och elektroporation tillåter mild, händiga manipulation av embryon att avslöja den laterala ventrikeln och gör att embryon som pressas försiktigt mot livmoderväggen. En extremt lätt beröring är viktigt vid hantering av livmodern och embryon. Om det är svårt att uppnå en lätt beröring, använda ringen pincett med inbyggd gräns skruv att förhindra att tången spärrar på ett embryo eller livmodern, orsakar vävnadsskada. En ytterligare faktor är att administrera både karprofen och buprenorfin omedelbart före operationen, en praxis som förefaller ge effektiv smärtlindring under Utero operation utan att påverka embryonala överlevnad priser35 .
Efter vår förenklade histologiska förfarandet, är flera steg kritiska. Efter startas experimentella hjärnor med fixativ, hålla hjärnan intakt i skallen att skydda hjärnvävnad från skador under efter fixering. Det är möjligt att lagra hjärnan i 1% PFA under dagar till veckor, Observera att fluorescens kommer att minska när PFA lösningen polymerizes. Skivning 100 µm koronalt avsnitt är vanligtvis tillräckligt tunn för att tillåta konfokalmikroskopi genom hela avsnittet samtidigt som mycket av dendritiska och axonal morfologi. Om fixering uppstod ordentligt, kan hjärnor från djur äldre än P13 monteras på vibrerande mikrotomen enkelt med cyanoakrylat lim. Dock om hjärnan är alltför följsamma samtidigt skärs av vibrerande mikrotomen, limma ner en liten agar eller agaros block bakom hjärnan för att hindra den från att böja medan det är att vara sektioneras. Om problemet inte är löst, bädda in hjärnan i agar bildar ett block att skära med vibrerande mikrotomen, som föreslagits för yngre postnatal hjärnor (steg 5,8).
Denna metod kombinerar Cre-lox rekombination systemet med Utero elektroporation för att generera mosaiker som kan användas för att studera cell-autonom funktion av gener i nervceller. Denna metod kan också konfigureras för att stödja Utero elektroporation av genen redigering konstruktioner (t.ex. CRISPR/Cas9)6eller andra platsspecifika rekombinaser (t.ex. Flp/FRT eller Dre/rox24), som kunde alla vara utformad för att producera mosaik hjärnvävnad. En lovande alternativ teknik som kan användas för att producera mosaik vävnad är viral leverans via intraventrikulär injektion till neonatala möss36. Kombinerat med intraventrikulär injektion på embryonala åldrar som visats här och annorstädes15,16,17,18,19,20, 21,22,37, virala vektorer kodning för Cre recombinase kunde levereras före födseln att infektera floxed stamceller vid ventrikulära zonen. En kritisk fråga skulle vara att säkerställa att de virala vektorerna späds ut tillräckligt för att uppnå glesa excision och märkning. Dock skulle detta också resultera i lägre Kopiera nummer av den konstruktion som levereras, inklusive fluorescerande markörer väsentliga för neuroanatomiska observationer (t.ex. Dendritutskotten eller arborization)24. Att motverka denna fallgrop, nya konstruktioner med samma strategi som ”Supernova” konstruktioner visat här kunde användas för att uppnå glesa märkning utan en motsvarande minskning av ljusstyrkan på märkta celler24. En annan kritisk faktor med viral leverans är att säkerställa att levererade konstruktioner har initiativtagarna specifika för cell befolkningen som studeras (e.g. excitatoriska pyramidal nervceller). Intraventrikulär injektion av virala vektorer orsakar infektion av alla vävnaden som omger ventriklarna, inklusive inte bara ventrikulära zonplanera av den dorsala telencephalon där kortikala och Hippocampus excitatoriska nervceller genereras, men också mediala och laterala ganglieblockerande eminenser där många kortikala interneuroner föds34. En annan huvudnummer av Utero elektroporation jämfört med viral leverans av konstruktioner är dess relativt smala tidsfönstret för leverans. Virus injiceras i de laterala ventriklarna kan kvarstå efter operationen, fortsätter att infektera celler som kantar den ventrikulära zonen. Däremot uppstår elektroporation i sekunder, inriktning en betydligt mer specifik uppsättning celler. Detta kan vara en fördel eller nackdel att utredaren, beroende på subpopulationen av celler studeras.
Vår strategi stöder Cre-lox rekombination genom införandet av antingen en enda konstruktion eller ”Supernova” konstruktioner. När det gäller ”Supernova” konstruktioner uppmanar vi utredarna att bli bekant med de fördelar och begränsningar med att använda denna strategi. Till exempel har tidpunkten för Cre radering visats ske inom 2 dagar i layer II/III excitatoriska nervceller i hjärnbarken24. Det är således rimligt att Cre excision kunde ske över 48 h efter elektroporation, i stället för att omedelbart efter elektroporation. Därför, andra former av bekräftar tidpunkten och platsen för Cre excision (t.ex. en Cre reporter mus:) bör användas som komplement till användningen av denna nya teknik, särskilt i studier där Cre excision inom en liten tidsram är en kritisk övervägande. En annan potentiell fallgrop är att en liten andel av omärkta celler i en ”Supernova” experiment kunde uttrycka Cre recombinase. Till exempel i figur 3, vi co-electroporated två plasmider: en hög koncentration av CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE och en låg koncentration av TRE-Cre. Eftersom TRE är en läckande promotor, kunde Cre recombinase uttryckas i celler som fått TRE-Cre plasmiden men inte loxP-stopp-loxP-andra-tTA plasmiden, även om detta skulle vara en sällsynt företeelse. I ett experiment där det är nödvändigt att alla omärkta celler har ingen som helst Cre-medierad excision, en ”Supernova” experiment kan behöva kompletteras med en kontroll experiment i vilka Cre recombinase uttryck utanför märkt nervceller bedöms på andra sätt (t.ex. Cre recombinase immunohistokemi).
Sammanfattningsvis är vårt protokoll enkelt ändras för att rymma dessa nya konstruktioner, att göra i livmodern elektroporation en ännu mer användbar och flexibel metod för mosaic analys. Således, i livmodern elektroporation kan kombineras med kraften av genetisk rekombination på flera olika sätt att studera mosaik hjärnans vävnad i vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar generöst stöd av James Madison University Institutionen för biologi och James Madison University ljus Microscopy och Imaging anläggning. Dr. Mark L. Gabriele för hjälpsamma råd angående unga postnatal vävnad förberedelse, och Drs. Justin W. Brown och Corey L. Cleland för generösa samordning av kirurgiska material och utrymme. Denna forskning finansierades delvis av en kollaborativ forskningsbidrag av 4-VA, ett samarbete för att främja det Commonwealth av Virginia (G.S.V.), och av Virginia akademin av vetenskap små projekt forskningsbidrag (G.S.V.). Har varit generöst stöd av en Betty Jo kärleksfull Butler ' 58 Endowment för grundutbildning forskning Scholarship (till K.M.B.), en Farrell sommaren forskning Scholarship (till K.M.B.), James Madison University andra talet stipendium (till K.M.B.), en James Madison University Centennial stipendium (till C.J.H.), James Madison University Lucy Robinson Sök ' 30 Memorial stipendium (till Z.L.H.) och en James Madison University College vetenskap och matematik fakultet stöd Grant (till G.S.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000664 | See "1. Mouse set-up" (step 1.1, "wildtype mice") |
| GFP.Cre empty vector | AddGene | #20781 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "single DNA construct that codes for Cre recombinase as well as a fluorescent marker"). GFP.Cre empty vector was a gift from Tyler Jacks. |
| pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #69138 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK029.CAG-loxP-stop-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| pK031.TRE-Cre (Supernova) | AddGene | #69136 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK031.TRE-Cre (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) | AddGene | #85006 | See "2. DNA set-up" (step 2.1 "Supernova" system) and http://snsupport.webcrow.jp/. pK038.CAG-loxP-stop-loxP-EGFP-ires-tTA-WPRE (Supernova) was a gift from Takuji Iwasato. |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit (10) | Qiagen | #12362 | See "2. DNA set-up" (step 2.3 "endotoxin-free plasmid purification kit") |
| Trypan Blue powder, BioReagent grade | Sigma | T6146-5G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "trypan blue") |
| Sodium Chloride, ACS, 2.5 kg | VWR | BDH9286-2.5KG | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "NaCl") |
| Potassium Chloride, ACS, 500 g | VWR | #97061-566 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KCl") |
| Sodium phosphate dibasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | S0876-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "Na2HPO4") |
| Potassium phosphate monobasic, ReagentPlus, 100 g | Sigma-Aldrich | P5379-100G | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "KH2PO4") |
| Hydrochloric acid, ACS reagent, 500 mL | Fisher Scientific | A144-500 | See "2. DNA set-up" (step 2.5 "HCl") |
| P-97 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
| 3.0 mm wide trough filament | Sutter Instrument | FT330B | See "3. Pipette set-up" (step 3.1 "glass capillary puller") |
| Thin Wall Glass Capillaries, 4", 1 / 0.75 OD/ID | World Precision Instruments | TW100-4 | See "3. Pipette set-up" (step 3.1.1 "glass capillary") |
| Single Ply Soft-Tech Wipes, 4.5" | Phenix | LW-8148 | See "3. Pipette set-up" (step 3.2.1 "single-ply task wipe"); other single-ply wipes (e.g. Kimwipes) can be used. |
| Graefe Forceps, 7 cm, Straight, 0.7 mm 1x2 Teeth | World Precision Instruments | #14140 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Graefe forceps") |
| Iris Scissors, 11.5 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503708-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "iris scissors") |
| Hartman Mosquito Forceps, 9 cm, Straight, 12-pack | World Precision Instruments | #503728-12 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Hartman mosquito forceps") |
| General Purpose Non-Woven Sponges, 2" x 2", 4-ply | Medrepexpress | #2204-c | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "non-woven gauze sponges") |
| Ring Tipped Forceps, 10 cm, Straight, 2.2mm ID | World Precision Instruments | #503203 | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "ring-tipped forceps") |
| Pyrex petri dishes complete, O.D. × H 100 mm × 20 mm | Sigma-Aldrich | CLS3160102-12EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "Petri dishes") |
| Flat Type Instrument Tray, Stainless Steel, 13-5/8" x 9-3/4" x 5/8" | Amazon | B007SHGAHA | See "4. In utero electroporation" (step 4.1 "stainless steel tray") |
| Platinum Tweezertrode, 5 mm | BTX | #45-0489 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.16 "tweezer-type electrodes") |
| ECM 830 Foot Pedal | BTX | #45-0211 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 and 4.17 "foot pedal") |
| ECM 830 Generator | BTX | #45-0052 | See "4. In utero electroporation" (step 4.3 "generator") |
| Single Animal Isoflurane Anesthesia System with Small Induction Box | Harvard Apparatus | #72-6468 | See "4. In utero electroporation" (step 4.4 and 4.6 "nose cone", step 4.4 "induction chamber") |
| Ophthalmic ointment | Hanna Pharmaceutical Supply Co | #0536108691 | See "4. In utero electroporation" (step 4.7 "veterinary ophthalmic ointment") |
| Space Gel (AIMS) | VWR | #95059-640 | See "4. In utero electroporation" (step 4.8 "sealed pouch filled with supersaturated salt solution") |
| Hair Remover Gel Cream, Sensitive Formula | Veet | #062200809951 | See "4. In utero electroporation" (step 4.9 "depilatory cream") |
| 10ul Low Retention Tip Starter (960 tips/pk) | Phenix Research Products | TSP-10LKIT | See "4. In utero electroporation" (step 4.12 "sterile 10 µL micropipette tip") |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | See "4. In utero electroporation" (step 4.15 "aspirator tube assembly") |
| Braided Absorbable Suture, 4-0, Needle NFS-2(FS-2), 27" | Medrepexpress | MV-J397 | See "4. In utero electroporation" (step 4.19 "absorbable sutures") |
| “LiquiVet Rapid” Tissue Adhesive | Medrepexpress | VG3 | See "4. In utero electroporation" (step 4.20 "tissue adhesive") |
| Hypodermic syringes, polypropylene, Luer lock tip, capacity 1.0 mL | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "1 mL syringe") |
| BD Precisionglide syringe needles gauge 26, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192392-100EA | See "4. In utero electroporation" (step 4.21 "26G, ½” needle") |
| Nestlets Nesting Material | Ancare | NES3600 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "nesting materials") |
| Sunflower Seeds, Black Oil, Sterile | Bio-Serv | S5137 | See "4. In utero electroporation" (step 4.24 "sunflower seeds") |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | See "5. Histology" (step 5.1.1 "PFA") |
| Economy Tweezers #3, 11 cm, 0.2 x 0.4 mm tips | World Precision Instruments | #501976 | See "5. Histology" (step 5.5 "tweezers") |
| Agar powder | Alfa Aesar | #10752 | See "5. Histology" (step 5.8.1 "agar") |
| Single-edge razor blades, #9 blade | Stanley Tools | #11-515 | See "5. Histology" (step 5.9 "single-edge razor blade") |
| Specimen disc S D 50 mm | Leica | #14046327404 | See "5. Histology" (step 5.9 "vibrating microtome specimen disc") |
| Buffer tray S assembly | Leica | #1404630132 | See "5. Histology" (step 5.10 "buffer tray") |
| VT1000 S Vibratome | Leica | #14047235612 | See "5. Histology" (step 5.10 "vibrating microtome") |
| Double Edge Razor Blades | Personna | BP9020 | See "5. Histology" (step 5.10 "blade") |
| Knife Holder S | Leica | #14046230131 | See "5. Histology" (step 5.10 "knife holder") |
| Studio Elements Golden Taklon Short Handle Round Brush Set | Amazon | B0089KU6XE | See "5. Histology" (step 5.12.1 "fine tipped paintbrush") |
| Superfrost Plus Slides | Electron Microscopy Services | #71869-11 | See "5. Histology" (step 5.12.1 "microscope slide") |
| ProLong Diamond Antifade Mountant, 10 ml | Thermofisher | P36970 | See "5. Histology" (step 5.12.3-5.12.4 "mountant") |
| Cover Glass, 24 x 50 mm, No. 1 | Phenix Research Products | MS1415-10 | See "5. Histology" (step 5.12.4 "coverslip") |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | See "5. Histology" (step 5.13.1 "DAPI") |
| Fixed Stage Upright Microscope | Olympus | BX51WI | See "5. Histology" (step 5.15 "light microscope") |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | TE2000/C2si | See "5. Histology" (step 5.15 "confocal microscope") |
| 4x objective, NA = 0.20 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 4X | See "5. Histology" (step 5.15 "low-power objective") |
| 20x objective, NA = 0.75 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 20X | See "5. Histology" (step 5.15 "medium-power objective") |
| 60x objective, NA = 1.40 | Nikon | CFI Plan Apo VC 60X Oil | See "5. Histology" (step 5.15 "high-power objective") |
References
- Southwell, D. G., Froemke, R. C., Alvarez-Buylla, A., Stryker, M. P., Gandhi, S. P. Cortical plasticity induced by inhibitory neuron transplantation. Science. 327 (5969), 1145-1148 (2010).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. J. Neurosci. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A Target Cell-Specific Role for Presynaptic Fmr1 in Regulating Glutamate Release onto Neocortical Fast-Spiking Inhibitory Neurons. J. Neurosci. 33 (6), 2593-2604 (2013).
- Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. J. Neurosci. 34 (9), 3413-3418 (2014).
- McConnell, M. J., et al. Mosaic Copy Number Variation in Human Neurons. Science. 342 (6158), 632-637 (2013).
- McConnell, M. J., et al. Intersection of diverse neuronal genomes and neuropsychiatric disease: The Brain Somatic Mosaicism Network. Science. 356 (6336), eaal1641 (2017).
- Gu, H., Marth, J. D., Orban, P. C., Mossmann, H., Rajewsky, K. Deletion of a DNA polymerase beta gene segment in T cells using cell type-specific gene targeting. Science. 265 (5168), 103-106 (1994).
- Hodges, J. L., et al. Astrocytic Contributions to Synaptic and Learning Abnormalities in a Mouse Model of Fragile X Syndrome. Biol. Psychiatry. (17), 1-11 (2016).
- Young, P., Qiu, L., Wang, D., Zhao, S., Gross, J. Single-neuron labeling with inducible cre-mediated knockout in transgenic mice. Nat. Neurosci. 11 (6), 721-728 (2011).
- Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic Analysis with Double Markers in Mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
- Hippenmeyer, S., et al. Genetic mosaic dissection of Lis1 and Ndel1 in neuronal migration. Neuron. 68 (4), 695-709 (2010).
- De la Rossa, A., Jabaudon, D. In vivo rapid gene delivery into postmitotic neocortical neurons using iontoporation. Nat. Protoc. 10 (1), 25-32 (2015).
- Lu, W., Bushong, E. A., Shih, T. P., Ellisman, M. H., Nicoll, R. A. The cell-autonomous role of excitatory synaptic transmission in the regulation of neuronal structure and function. Neuron. 78 (3), 433-439 (2013).
- Duan, Y., et al. Semaphorin 5A inhibits synaptogenesis in early postnatal- and adult-born hippocampal dentate granule cells. eLife. 3, 1-24 (2014).
- Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957 (2011).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024 (2011).
- Briz, C. G., Navarrete, M., Esteban, J. A., Nieto, M. In utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity. J. Vis. Exp. (120), (2017).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nature protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10 (3), 1027-1032 (2007).
- Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation. J. Vis. Exp. (65), e4163 (2012).
- Mizuno, H., et al. NMDAR-Regulated Dynamics of Layer 4 Neuronal Dendrites during Thalamocortical Reorganization in Neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
- Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Sci. Rep. 6, 35747 (2016).
- Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab animal. 38 (9), 305-310 (2009).
- Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS ONE. 7 (4), 1-5 (2012).
- Andreu-Agullo, C., Maurin, T., Thompson, C. B., Lai, E. C. Ars2 maintains neural stem-cell identity through direct transcriptional activation of Sox2. Nature. 481, 195-198 (2011).
- Scotto-Lomassese, S., et al. Fragile X mental retardation protein regulates new neuron differentiation in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 31, 2205-2215 (2011).
- Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd ed, Addgene. Cambridge, Massachusetts. (2017).
- Pipette Cookbook. , rev. ed, Sutter Instrument Company. Novato, California. (2015).
- Cuddington, B., Verschoor, M., Mossman, K. Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses. J. Vis. Exp. (93), e52232 (2014).
- Leary, S., et al. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg, Illinois. (2013).
- Anderson, S. A., Eisenstat, D. D., Shi, L., Rubenstein, J. L. R. Interneuron Migration from Basal Forebrain to Neocortex: Dependence on Dlx Genes. Science. 28 (5337), 474-476 (1997).
- Parker, J. M., Austin, J., Wilkerson, J., Carbone, L. Effects of Multimodal Analgesia on the Success of Mouse Embryo Transfer Surgery. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 50 (4), 466-470 (2011).
- Kim, J. -Y., et al. Viral transduction of the neonatal brain delivers controllable genetic mosaicism for visualising and manipulating neuronal circuits in vivo. Eur. J. Neurosci. 37 (8), 1203-1220 (2013).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-Guided Microinjection into the Mouse Forebrain In Utero at E9.5. J. Vis. Exp. (45), e2047 (2010).
