Summary
Forekomsten av fedme er stigende og øker risikoen for kroniske lungesykdommer. For å etablere de underliggende mekanismene og forebyggende strategier, veldefinerte dyr modeller er nødvendig. Her gir vi tre metoder (glukose toleranse test, kroppen plethysmography og lunge fiksering) å studere effekten av fedme på lunge resultater i mus.
Abstract
Fedme og respirasjonsproblemer er store helseproblemer. Fedme er blitt en fremvoksende epidemi med forventet antall over 1 milliard overvektige personer over hele verden i 2030, dermed representerer en voksende sosioøkonomiske byrde. Samtidig, er fedme-relaterte samtidige, inkludert diabetes som hjertet og kroniske lungesykdommer, kontinuerlig på vei oppover. Selv om fedme har blitt assosiert med økt risiko for astma eksaserbasjoner, forverring av respiratoriske symptomer og dårlig kontroll, funksjonelle rolle fedme og plaget metabolisme i patogenesen av kronisk lungesykdom er ofte undervurdert, og underliggende molekylære mekanismer forblir unnvikende. Denne artikkelen tar sikte på å presentere metoder for å vurdere effekten av fedme på stoffskiftet, samt lunge struktur og funksjon. Her beskriver vi tre teknikker for mus studier: (1) vurdering av intraperitoneal glukosetoleranse (ipGTT) til å analysere effekten av fedme på glukose metabolisme; (2) måling av luftveiene motstand (Res) og luftveiene samsvar (Cdyn) til å analysere effekten av fedme på lungefunksjonen; og (3) forberedelse og fiksering av lunge for påfølgende kvantitativ histologiske vurdering. Fedme-relaterte lungesykdommer er sannsynligvis multifaktoriell, stammer fra systemisk inflammatorisk og metabolske feilregulering som potensielt negativt påvirke lungefunksjonen og svaret terapi. Derfor er en standardisert metode for å studere molekylære mekanismer og effekten av romanen behandlinger viktig.
Introduction
Ifølge Verdens helseorganisasjon (WHO) i 2008, var mer enn 1,4 milliarder voksne i alderen 20 og eldre, overvektig med en kroppsmasseindeks (BMI) større enn eller lik 25; Videre, over 200 millioner menn og nærmere 300 millioner kvinner ble overvektige (BMI≥30)1. Fedme og Metabolsk syndrom er større risk faktorene for en rekke sykdommer. Mens fedme og samtidig økt hvit fettvev masse har blitt forbundet for å type 2 diabetes2,3, kardiovaskulære sykdommer, inkludert koronar hjertesykdom (CHD), hjertesvikt (HF), atrieflimmer4 og slitasjegikt5, sin funksjonelle rolle i patogenesen av respirasjonsproblemer fortsatt dårlig forstått. Imidlertid har Epidemiologiske studier vist at fedme er sterkt assosiert med kroniske luftveissykdommer forhold, herunder exertional dyspné, obstruktiv søvnapné syndrom (OSAS), fedme hypoventilasjon syndrom (OHS), kronisk hindrende lunge sykdom (COPD), lunge embolism, aspirasjon lungebetennelse og bronkial astma6,7,8,9. Potensielle mekanismer kobler fedme og plaget metabolisme, f.eks, insulinresistens og type II diabetes, til patogenesen av kronisk lungesykdom ikke bare omfatter mekanisk og fysisk konsekvensene av vekt gevinst på ventilasjon men også indusere en kronisk subakutt inflammatorisk stat10,11. Fedme og lungesykdommer i løpet av det siste tiåret, kombinert med mangel på effektive forebyggende strategier og terapeutiske metoder, fremhever behovet for å undersøke molekylære mekanismer for å definere nye veier for å behandle fedme-relaterte lunge sykdommer.
Her beskriver vi tre standard tester, som er viktig grunnleggende undersøke fedme og dens innvirkning på lunge struktur og funksjon i musen modeller: (1) intraperitoneal glukose toleranse (ipGTT) (2) måling av luftveiene motstand (Res) og luftveier systemkompatibiliteten (Cdyn); og (3) forberedelse og fiksering av lunge for påfølgende kvantitativ histologiske vurdering. IpGTT er en robust screening test for å måle glukose opptak, og dermed effekten av fedme på stoffskiftet. Enkelheten av metoden kan godt standardisering, og derfor sammenlignbarheten resultater mellom laboratorier. Mer avanserte metoder, for eksempel hyperglycemic klemmer eller studier på isolerte småøyer, kan brukes for detaljert analyse av metabolske fenotypen12. Her vurderer vi glukosetoleranse for å definere en fedme-assosiert stat systemisk og metabolske lidelse som grunnlag for videre studier på en lunge utfall. For å vurdere effekten av fedme og stoffskiftesykdom på lungefunksjonen, målt vi airway motstand (Res) og luftveiene samsvar (Cdyn). Betegner lungesykdom, er uhemmet samt behersket metoder for vurdering av lungefunksjonen tilgjengelig. Uhemmet plethysmography i fritt flytte dyrene etterligner en naturlig tilstand, reflekterer pusting mønstre; invasive metoder, for eksempel inngangsimpedans måling av Res og cDyn i dypt bedøvet mus å vurdere dynamisk lunge mekanikere, er mer nøyaktig13. Siden kroniske åndedrettsproblemer gjenspeiles ved histologic endringer av lungevev, er riktig lunge fiksering for videre analyse forestående. Valg av vev fiksering og forberedelse avhenger kupé av lungene som vil bli studert, for eksempel gjennomføre luftveiene eller lunge parenchyma14. Her beskriver vi en metode som tillater kvalitativ og kvantitativ vurdering av gjennomfører luftveiene å studere effekten av fedme på astma utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble utført i samsvar med protokoller godkjent av lokale myndigheter (Land NRW, AZ: 2012.A424), og var i samsvar med tysk dyrevelferd loven og forskrift om velferd av dyr som brukes for eksperimenter eller andre vitenskapelige formål. Siden lunge funksjon analyse kan påvirke lunge struktur og derfor påfølgende histologiske analyserer, skal måling av Res og Cdyn og forberedelse og fiksering av lunge for histomorphometry utføres i forskjellige dyr. Måling av Res og Cdyn etter ipGTT er imidlertid mulig. Siden stress under ipGTT kan forstyrre anestesi nødvendig for lungefunksjonen tester, en restitusjonsperiode ca 2 uker etter ipGTT anbefales å tillate mus å gjenopprette fra kroppen vekttap og endringer i blodet parametere12.
1. forberedelse til Intraperitoneal glukose toleranse Test (ipGTT)
Merk: Etter 12 timer med fasting, den komplette ipGTT tar ca 2 timer.
- Siden stress påvirker blodsukker betydelig, sørge for at både tilpasning av mus og opplæring av forskeren, utføres.
- Overføre dyrene til eksperimentelle området under rolig og stress-fri.
- Vurdere bruk av en hypercaloric diett å indusere fedme i mus. Se drøftingen for ytterligere råd.
- Rask dyr for 12t overnatting, uten å begrense tilgang til vann. Neste dag, er etter 12 timer med faste, forberede blodsukkermåler ifølge produsenten protokollen (se tabell av materialer) ved å sette inn en ny strimmel til test stripe porten.
- Incise hale spissen med sterilt saks, samtidig som forsiktig musen halen, og umiddelbart måle den fasted blodsukker ved å bruke en fri flyt blod dråpe (minimum prøven størrelsen 0,5 µL) strimmelen av blod glukose meter.
Merk: En nedtellingstidtaker starter på skjermen etter nok blodprøve. Etter 4 s, testresultatet vises på skjermen. - Etterpå veier og merke dyrene med farge merking.
- Administrere 2 g glukose/kg kroppen vekt via intraperitoneal injeksjon. Kontroller at injeksjon volumet er 0,1 mL/10 g kroppsvekt (27 G sprøytespiss 1 cc).
- Deretter måle blodsukker etter 15, 30, 60 og 120 min ved å bruke en dråpe frittflytende blod på en ny strimmel.
Merk: Blodstrøm kan økes ved mild massaging av hale tips-avdelingene. Hvis hale såret encrusts, rense den med en bakteriefri vattpinne fuktet med 0,9% sodium chloride løsning. - Tillat dyr til hvile i burene sine hjem med ubegrenset tilgang til vann mellom målinger.
2. lunge funksjon analyse måle Res og cDyn
Merk: For uforstyrret måling av Res og cDyn, mus må være ventilert under dyp anestesi. Stress-fri dyr håndtering og riktig oppfølging av anestesi er viktig. Generelle instruksjoner med sterilt teknikker, Les artikkel av Hoogstraten i Köln-Miller et al. 15
- Kalibrere plethysmograph før hvert sett av eksperimenter og forberede studie innstillingene i programvaren (se Tabell for materiale).
- Før kirurgi, dypt bedøve dyr via intraperitoneal injeksjon av Xylazine (10 mg/kg kroppsvekt) og ketamin (100 mg/kg kroppsvekt) (27 G sprøytespiss 1 cc). Kontroller at injeksjon volumet er 0,1 mL/10 g per kroppsvekt.
Merk: Siden ketamin har en riktig analgetisk effekt i mus, ingen ekstra smertebehandling er nødvendig. Invasiv tracheal kateter/plethysmograph prosedyren tar ca 5-7 minutter, deretter datainnsamling kan begynne. - Plass musen i supine posisjon på en varmeputen å opprettholde kroppstemperaturen.
- Dekk øynene med sårsalve å hindre tørrhet under narkose.
- Overvåk konstant dybden av anestesi bruker tå knip-svaret.
Merk: Ekstra administrasjon bedøvelse kan være nødvendig for å opprettholde et kirurgisk fly av anestesi. - Fukt pelsen til det kirurgiske området i regionen skjoldbrusk med 70% etanol.
- Nøye incise huden utviklet ca 1 cm mellom jugulare hakket av sternum og tuber symphyses av mentum ved å løfte det med tang og klipping huden under visuell inspeksjon med sløv saks (figur 1A).
- Visualisere underliggende subkutan fettvev og skjoldbruskkjertelen.
- Utsett luftrøret ved å nøye sløv skille både skjoldbrusk lobes på neset og Disseksjon av sternothyroideus og sternothyroideus musklene (figur 1B). Vær forsiktig med å skade alle fartøy og forårsake blødning, siden dette kan føre til uønskede virkninger på det kardiovaskulære systemet og til slutt på målinger.
- Deretter sende en 4-0 flettet kirurgisk Sutur mellom trachea og spiserør med sløv tang. Nøye incise luftrøret nær strupehode mellom tracheal cartilages med mikro saks.
- Intubate med et tracheal rør (0.04 tommer/1.02 mm diameter) under visuell kontroll (figur 1 c). Fastsette tube via ligation med det kirurgiske suture å unngå noen lekkasje i systemet.
- Deretter flytter dyret til oppvarmet sengen av kroppen kammeret og koble tracheal røret til ansikt plate (figur 1 d) og slå på ventilasjonen ved å trykke knappen ventilasjon på frontpanelet på kontrolleren (figur 1E).
- Undersøkelsen ventilasjonen ved å observere thorax bevegelsen samtidig med ventilasjon rate. For å bekrefte riktig plassering av tracheal rør, sikrer du at begge sider av thorax flytte samtidig.
- Se trykket signal på skjermen (figur 1F). Kontroller at ventilasjonen kurvene er ensartet. Hvis dette ikke er tilfelle, koble dyret og sjekk siden kirurgi. Beware av blod eller Slim blokkerer tracheal røret.
Merk: For voksen dyr med en kroppsvekt på 20-25 g, ventilator innstillingene som vist i figur 2 , foreslås i henhold til produsentens anbefalinger. - For å kontrollere endringer i trans-lunge trykket under ventilasjon, sett en esophageal tube (0.04 tommer/1.02 mm diameter) i spiserøret i dybden som tilnærmet nivåer av lungene. Se skjermen mens plassere røret. Sett røret der maksimal press nedbøyning og minimal hjertet gjenstander kan sees på skjermen.
- Forberede dyret målingen etter operasjonen. Reinject anestesi via intraperitoneal injeksjon av ketamin (100 mg/kg kroppsvekt) bruker en 27-G sprøytespiss 1 cc. Kontroller at injeksjon volumet er 0,1 mL/10 g per kroppsvekt.
Merk: For å vurdere bronkial hyperreagibility, nebulize methacholine, en ikke-selektive muscarinic reseptor Agonistiske av det parasympatiske nervesystemet, som forårsaker bronchoconstriction. Datainnsamling utføres i fire forskjellige faser (Figur 3). - Starte datainnsamling i henhold til manufacturer´s-protokollen.
Merk: Programvaren automatisk fører brukere gjennom oppkjøpet. - Bruke 10 µL av PBS (vehicle) på forstøveren, og start tåke etter 5 min av acclimation. Deretter Følg en svar fase 3 min, der Res (cmH2O/mL/s) og cDyn (mL/cmH2O) måles. På slutten, gi en utvinning FASE 3 min til dyret før den neste tåke.
- Følg programvaren ved gradvis 10 µL av økende konsentrasjoner av methacholine (2,5 µg/10 µL, 6,25 µg/10 µL og 12,5 µg/10 µL) på ventilen.
- Når alle mål er utført og registrert, ofre dyr for cervical forvridning.
3. lunge isolasjon for kvantitative Histomorphometric analyse av voksen mus
- Dypt bedøve dyr via intraperitoneal injeksjon av Xylazine (10 mg/kg kroppsvekt) og ketamin (100 mg/kg kroppsvekt) (27 G sprøytespiss 1 cc). Injeksjon volumet skal 0,1 mL/10 g per kroppsvekt.
Merk: Etter å ha nådd delstaten kirurgisk toleranse, utarbeidelse tar ca 5 min etterfulgt av organ perfusjon og 30 min for fiksering. - Når Dyret har nådd delstaten kirurgisk toleranse (negativ tå knip-svar), desinfisere dyret med 70% etanol og fikse dyr på en pute med kirurgisk tape.
- Ofre dyr med hjerte punktering og blødninger. Kort, åpne magen med en mediale snitt gjennom huden og peritoneum med sløv saks.
- Finn membran hodet avdelingene i leveren, og forsiktig skille leveren fra membranen.
- Lag et lite innsnitt i mellomgulvet med sløv saks, og vises punctate venstre ventrikkel hjertet med en 20 G nål knyttet til en 2 mL sprøyte. Sakte exsanguinate dyr.
Merk: Sakte og forsiktig exsanguination er viktig å unngå ventriklene kollapset på grunn av den negative trykket, begrenser en uforstyrret blodstrøm. - Dissekere lungene ved å åpne thorax forsiktig gjennom et parasternal snitt langs hele lengden av ribbe buret med buet, sløv saks.
- Etterpå løft ribbe buret for å avsløre pleural hulrommet (Figur 3 c). Fjerne thymus du hjertet og lungene.
Merk: Valgfri injeksjon av høyre hjertekammer, etterfulgt av perfusjon av lunge vaskulære system med iskald PBS og deretter med en etappe, den stabiliserende løsning [f.eks4% (masse/volum) paraformaldehyde (PFA)] er mulig. Vær oppmerksom på at det er økt risiko ruptur alveolar septae og påvirke lunge struktur med denne metoden. - Dissekere lungene ved første nøye fjerne hjertet.
- Deretter sende en 4-0 flettet kirurgisk Sutur mellom trachea og spiserør med sløv tang.
- Deretter forsiktig incise luftrøret nær strupehode mellom tracheal cartilages, intubate med en intravenøs kanyle (26 G) og blåse lungene ved press fiksering ved konstant trykk av 20 cm H2O bruke etappe, den stabiliserende agent [f.eks4% (mass /Volume) av PFA].
- PFA fiksering, la bindemiddel i 30 min ved romtemperatur. Etterpå ligate luftrøret og fjerne kanyle. Deretter avgiftsdirektoratet lungene forsiktig uten å skade vev, og lagre den i etappe, den stabiliserende agent på 4 ° C over natten.
Merk: Alternativt, i henhold til ATS/ETS konsensus papir 2,5% GA bufret OsO4, Uracil løsningen brukes for riktig vev stabilisering. For ytterligere vev forberedelse, se konsensus av Hsia et al. 14
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representant resultatene av intraperitoneal glukose toleranse test (ipGTT) (Figur 4), lunge funksjon test (figur 5) og representant bilder illustrerer hematoxylin og eosin farget lungene (figur 6).
IpGTT ble utført i overvektige mus (blå) etter 7 uker med høy-fett-diett (HFD). Standard diett-matet mus som kontroller (svart). Overvektige mus viste økt serum glukose nivå 15 og 30 min etter intraperitoneal glukose injeksjon, indikerer nedsatt mobilnettet glukose opptak (Figur 4).
For å undersøke effekten av fedme på lungefunksjonen, ble invasiv lunge funksjonen analyse gjennomført i overvektige mus (blå) etter 7 uker med høy-fett-diett (HFD). Overvektige mus viste en opptil 1.5-fold økning airway motstand sammenlignet kontroll mus (svart) (figur 5).
For å se effekten av press fiksering under intratracheal instillasjon av fiksativene på lunge parenchyma, vises representant bilder av hematoxylin og eosin farget lunge deler (figur 6). For lite press fører til flere un oppblåst områder, tykk alveolar septae og mangekantede formet alveoler (A), mens mye press resultater i over-oppblåst emfysem-lignende områder med destrueres alveolar septae (C). Anvendelsen av riktig trykket under lunge fiksering fører til en fullstendig oppblåst lunge med rund formet alveoler (B).
Figur 1: skjematisk fremstilling av invasiv lungefunksjon. (A-C) Trinnene i trakeotomi. (D) tilkoblingen på dyret til ansikt plate av plethysmograph. (E) Hardware oppsett for invasiv lungefunksjon. (F) skjermbilde av datainnsamling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: ordningen med datainnsamling å vurdere bronkial hyperreagibility. Datainnsamling inkluderer en innledende Akklimatisering periode (5 min), etterfulgt av 30 s stoff tåke, 3 min svar fase og 3 min av utvinning fase tidligere tåke neste stoff konsentrasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: skjematisk fremstilling av forberedelsene. (A-D) Trinnene i trakeotomi. (A) snitt i huden. (B) Situs av bryst hulrom. (C) Vis etter fjerning av ribbe buret. (D) Vis etter fjerning av hjertet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representative intraperitoneal glukose toleranse test (ipGTT). C57Bl/6N mus ble matet en høy-fett diett for 6-8 ukens; kontroll mus fikk en standard diett. n = 3; Mener ± SEM; statistiske analyser utført var toveis ANOVA test og Bonferroni posttest. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representant lunge funksjon test C57Bl/6N mus ble matet en høy-fett diett for 6-8 ukens; kontroll mus fikk standard diett. n = 3; Mener ± SEM; statistiske analyser utført var toveis ANOVA test og Bonferroni posttest. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: representant bilder illustrerer hematoxylin & eosin farget lungene. Tre forskjellige grader av intratracheal inflasjon: (A) for lite press, (B) riktig press og (C) for mye trykk. UIA; skjult område, OIA; over oppblåst området; Bildene ble tatt under 20 X forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Ventilator innstillinger | Spalte1 |
| Max. Slagvolum | 0,25 ml |
| Max. munnen press | 30cmH2O |
| Dyp inflasjon maks. volum | 0,5 ml |
| Dyp inflasjon maks. Trykk | 30cmH2O |
| Rate | 160 pusten per minutt |
Tabell 1: Ventilator innstillinger for voksne mus. For mindre dyr må ventilasjon parameterne justeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapporten gir tre protokoller for tre forskjellige metoder for å analysere virkningen av fedme på glukose metabolisme og lunge resultater. Først glukose toleranse test tilbyr muligheten til å analysere intracellulær glukose opptak og kan være indikativ av insulinresistens. Andre, hele kroppen plethysmography er en teknikk for å måle lungefunksjonen og dermed nyttig å teste effekten av romanen behandlinger. Tredje er en standardisert fiksering protokoll viktig for kvantitative morphometric analyse for å vurdere virkningen av fedme på strukturelle endringer.
Diett-indusert fedme i Forsøksdyrutvalget
Betydning når det gjelder eksisterende metoder og framtidige applikasjoner: for å etterligne menneskelige spisevaner, som føre til fedme, kosthold-indusert fedme (DIO) modeller er mye brukt i gnagere. Sammenlignet med bruk av genmodifiserte mus mimicking metabolsk sykdom, aktivere DIO modeller analyse av etiologi, patologi og fremtidige behandlingstilbud. En fersk gjennomgang av Heydemann et al., gir en oversikt over ulike murine fettrikt kosthold modeller i diabetes research16. Endringer av næringsstoffer komponenter gir muligheten for fremtidige studier av effekten av mikro - og makro-næringsstoffer molekylære mekanismer av fedme, og dermed på lunge struktur og funksjon.
Endringer og feilsøking: ulike rapporter viser at fedme kan være forårsaket av ulike endringer i sammensetningen av kosten næringsstoffer16, kunnskap som har, i sin tur førte til utviklingen av en rekke dietter de siste årene, for eksempel diett høy i fett eller karbohydratholdige innhold eller en kombinasjon av begge dietter, som er den såkalte vestlige kosthold16. Til slutt avhenger valg av kosthold for en studie problemstillingen og målene av studien. I tillegg til å kontrollere for disse viktige faktorer, er valg av et riktig kosthold av største betydning; ellers er tolkning av resultatene begrenset. Likevel fenotypen er ikke bare forårsaket av kosthold, men er også et resultat av fôring periode, kjønn og mus belastning17.
Begrensninger av teknikken: ved sammensetningen av ulike næringsstoffer i dietten, responsen av dyr og bakgrunn belastningen kunne redegjøre for resultatene og fenotypen observert av induksjon av fedme. For eksempel har det vist, at BALB/C mus er mer utsatt for leveren Steatose sammenlignet med C57Bl/6 mus18. Små genetisk variasjoner, f.ekspå grunn av genetisk drift (C57Bl/6J mot C57Bl/6N), kan også påvirke mottakelighet for fedme19. Dette understreker begrensningene av teknikken arbeider med genmodifiserte mus med annen genetisk bakgrunn stammer, siden selv belastning og leverandøren som mus ble innhentet kan påvirke resultatene.
Avgjørende skritt i protokollen: pålitelig, reproduserbare og sammenlignbare resultater mellom den eksperimentelle og kontroll grupper, fortrinnsvis littermates skal brukes til å generere kontroll og eksperimentelle mus, miljøfaktorer og stress bør være unngås, og kontroll mus bør studeres parallelt med eksperimentelle mus12.
Intraperitoneal glukose toleranse tester (ipGTT)
Betydning når det gjelder eksisterende metoder og framtidige applikasjoner: for å bestemme effekten av DIO på murine metabolisme, ulike screening tester finnes. Musen metabolske Phenotyping Center (MMPC) konsortiet ble etablert for å foreslå standard metoder for å vurdere metabolske fenotyper i mus og har publisert standard operasjonsprosedyrer for å beskrive og utføre metabolsk tester av glukose homeostase i mus12. En GTT er å måle hvor godt kroppens celler er i stand til opptak glukose etter inntak av en gitt mengde sukker, som igjen er tegn på insulinsekresjon og insulin effekt. Forskjeller i serum insulin nivåer hensyn ofte endret glukose toleranse. Derfor har GTT blitt en av de mest brukte fysiologiske testene som karakteriserer musen modeller av diabetes og fedme. Siden ipGTT er en rask og enkel tilnærming, kan det brukes i fremtidige studier som en standardisert metode for å analysere effekten av kosthold og/eller behandling på metabolismen.
Endringer og feilsøking: The GTT utføres rutinemessig etter en natts rask å utjevne blodsukkernivået i mus20. Siden varigheten av faste perioden har sterke effekter på undersøkte parametere og er skal derfor av stor betydning for sammenligning og tolkning av resultatene, faste perioden tilpasses til alder og kroppen vekt av mus. Tatt i betraktning at mus er nattdyr dyr og to tredeler av totalt daglige matinntaket brukes over natten, provoserer natten faste en catabolic stat. Dermed tidspunktet for initiering og varigheten av faste har en svært relevante innvirkning på resultatene, og dermed disse parameterne bør være standardisert12. Videre langvarig faste reduserer leveren glykogen butikker og dermed reduserer variasjonen i planlagte blodsukker. Som konklusjon, siden insulin-stimulert glukose utnyttelse i mus forsterkes etter langvarig faste periodene21, en 5-6 timer faste varighet anbefales å vurdere insulin handling. mens natten faste er tilstrekkelig til å teste glukose utnyttelse12,20,22. Glukose er vanligvis administreres via IP injeksjon dosen av glukose justeres til kroppen vekt (vanligvis 1 eller 2 g/kg kroppsvekt)20,22. DIO modeller, er kroppsvekt økt, hovedsakelig grunnet en høyere fettmasse; glukose opptak, men skjer hovedsakelig i muskel, hjernen og leveren. Siden mengden av disse vev generelt ikke endres av DIO, motta overvektige mus en uforholdsmessig stor mengde glukose sammenlignet med magre mus, som igjen kan påvirke tolkningen av dataene og føre til en feildiagnostisert glukose intoleranse22 . Derfor faste perioder må være standardisert og kroppssammensetning må vurderes under tolkning av GTT resultater23. Derfor er konstatere (CT) eller magnetisk resonans imaging(MRI) skanner gjeldende. For eksempel, glukose målinger tatt av håndholdt hele-blodsukker skjermer (se Tabell for materiale) er tilgjengelige, og disse skjermene er mer vanlig enn plasma glukose analyserer. På grunn av liten blodet volumer kreves - vanligvis 5 µL eller mindre - de er mer praktisk enn plasma analyserer.
Begrensninger av teknikken: Fasted mus utstilling avhengighet av varigheten av faste og viser en betydelig tap i kroppsvekt, kroppstemperatur, blodvolum, og hjertefrekvens samt endringer i serum parametere, som frie fettsyrer samt keton organer 24. denne metabolske stress er utløst av at bolig temperaturen på mus i dyr anlegg er standardisert til ca 23 ° C, og er derfor under thermo-nøytral temperaturen på 30 ° C25. Langvarig faste ved subthermo-nøytral temperaturer kan resultere i dvale, preget av en nedgang på metabolske26,27.
Avgjørende skritt i protokollen: som nevnt ovenfor, pålitelige resultater mellom den eksperimentelle og kontroll grupper, littermates skal helst brukes under studiet og faste periodene, og tidspunkt må være standardisert.
Lunge funksjon analyse
I denne protokollen måler plethysmograph direkte trykkendringer som kjører åndedrett, og den resulterende strømmer av luftveiene. Renn er målt ved en pneumotachograph i veggen av plethysmograph. For å utelukke motstand fra brystveggen, airway Press (munn trykk) og transpulmonary (esophageal tube) Trykk måles og luftveier motstand og dynamisk samsvar beregnes. Dynamisk etterlevelse er beregnet via forskjellen av minimum og maksimum lunge delt gjennom flyten.
Betydning når det gjelder eksisterende metoder og fremtidige applikasjoner: Plethysmography er standard prosedyre å analysere mekaniske egenskaper i lungene, og kan derfor brukes i fremtidige studier til å analysere alternativer for patologi og behandling av lungekreft. Hvis du vil sammenligne grupper og studier, er en standardisert tilnærming uunnværlig.
Endringer og feilsøking: Generelt, denne teknikken kan klassifiseres som uhemmet og behersket hele kroppen plethysmography. Hemningsløs metoder bestemme forbedret pause (Penh) og aktiverer analyse av normal pusting mønstre, mens behersket, invasive metoder måle direkte press, flyt eller volum. Lunge mekaniske egenskaper bestemmes av motstand og elastance; mens motstanden beregnes som forholdet mellom trykket til flyt, gjenspeiler elastance forholdet mellom trykket for volum28. Derimot hemningsløs hele kroppen plethysmography bare måle trykk inne plethysmograph, og derfor en beregning av motstand og elastance er umulig. I 2007, har Lundblad et al. uttalt at Penh er ikke parameteren rett å måle airway motstand, men representerer en uspesifisert refleksjon av de puste mønster29. Dermed er riktig estimering av lunge mekanikk, invasiv plethysmography uunnværlig29,30,31.
Siden puste parametere avhenger av alder og størrelsen på mus, må ventilasjon justeres. For eksempel Tidalvolum gjelder kroppsvekt og bør settes til 10 µL/g kroppsvekt med en puste frekvens på 120-250 åndedrag per minutt. Når du justerer disse parameterne, bør etterforskeren ta hensyn til at de mener Tidalvolum er omvendt relatert til åndedretts frekvens32. Siden spontan pusting påvirker trykket, flyt og volum, dybden av anestesi har overvåkes og ventilasjon kurver må være under konstant overvåking. Imidlertid kan anestesi selv direkte påvirke lungefunksjon. For eksempel beskytte Propofol og ketamin delvis mot indusert luftveier innsnevring sammenlignet Thiopental33. Videre har kliniske studier vist at ketamin har en antikolinergisk effekt og kan brukes som en potensiell bronkodilatator i alvorlig astma34. Inhalasjon-anestesimiddel bedøvelse, som isoflurane i forbindelse med smertebehandling, regnes som en kontrollerbar alternativ til injeksjon anesthesia; imidlertid luftveier irritasjon etter flyktige bedøvelse rapporteres og derfor utelukker innånding bedøvelse som en alternativ35.
Begrensninger av teknikken: behersket invasiv metoden å måle lunge mekaniske egenskaper av den nødvendige trakeotomi, en siste prosedyre, og dermed begrenser studien en ett-punkts analyse, uten mulighet til å undersøke sykdom progresjon. For å redusere nivået av invasiveness, kan måling av overføring impedans i bevisst dyr utføres, og som gir dermed longitudinelle studier. Men når måle åndedretts mekanikken i ikke-tracheotomized dyr, motstanden av nesen bidrar til totalt åndedretts motstanden kompliserer dermed mål etter methacholine provokasjon13
Avgjørende skritt i protokollen: her viser vi bare én metode for invasiv lungefunksjon. Siden flere etablerte invasiv lunge funksjonen metoder finnes, standardisering i studiene og en detaljert beskrivelse av metoden brukes, grupper, og en anesthetic regime i publikasjoner er nødvendig å sammenligne studier.
Lunge excision for histomorphometric analyse
Betydning når det gjelder eksisterende metoder og framtidige applikasjoner: kvantitative histomorphometric analyse kan brukes til å undersøke virkningen av fedme lunge struktur (bronchi og alveoler), å tolke resultatene av invasiv plethysmography, og å studere mulige behandlingstilbud på lunge utfall. Data fra histologiske vurderinger kan variere avhengig av etappe, den stabiliserende agenter og brukte fiksering prosedyren. Siden har det vært vist at fedme har en effekt på alveolar og bronkial struktur, som vel som ekstracellulær matrix og cellular komposisjon, er det nødvendig å finne en passende teknikk basert på problemstillingen i fremtidige studier. For upartiske kvantitative morphometry, vev behandling etter fiksering skal utføres i henhold til standarder av American Thoracic Society (ATS) / europeiske åndedretts samfunnet (ERS) for kvantitativ vurdering av lunge struktur14 .
Endringer og feilsøking: 2010 Hsia et al. presentert en offisiell uttalelse av ATS/ere innstillingen for kvantitativ vurdering av lunge, som skal tas i betraktning før lunge isolasjon og fiksering 14. ved intratracheal instillasjon fiksativene, i situ fiksering, fast volum fiksering eller vakuum inflasjon kan utføres for å blåse lunge vev36. Inflasjon, og dermed luftrom utvidelse, er avhengig av fiksering prosedyrer og karakteren press brukt under fiksering. Høytrykk, for eksempel kan føre til alveolar veggen brudd og dermed påvirke resultatene. Ligner parameterne ventilasjon, ideelle fiksering parametrene avhenger av alder, størrelse og fenotypen av mus. Fiksering kan oppnås med kjemiske eller fysiske midler, inkludert kjemiske midler og/eller kryonisk bevaring. Intratracheal instillasjon av egnet fiksativene etterligner vev inflasjon under puste, reflekterer i vivo forhold, og er derfor brukte37. 20-25 cm over det høyeste punktet av lunge anbefales for tilstrekkelig trykk, med et bredt og korte rør for å tillate rask og ensartet penetrasjon14. En viktig målsetting med fiksering er å forhindre at degenerasjon prosessen og beholde celler og vev i en "livet som stat", mens produktmerket arkitektoniske lunge parenchyma. I tillegg må vev beholde sin reaktivitet antistoffer, flekker og nukleinsyre sonder. Foruten effekten av vanlige autolyse, bivirkninger av vev behandling, herunder infiltrasjon med varm voks, kutting, og dewaxing, må være forhindret. Valg av bindemiddel og videre behandling av vev, f.eks via innebygging, kan forårsake vev krymping, hevelse og herding av ulike komponenter og føre til artefakter som økt autofluorescence38. For eksempel fiksering i 10% bufret formalin og videre behandling kan forårsake reduksjon på opp til 20% - 30% i forhold til første volum39. Derfor Hsia et al. i 2010 konsensus papir av ATS/ere anbefaler bruk av 2,5% Glutaraldehyde buffered med osmium tetroxide og uranyl acetate å unngå vev krymping. Lunge volum, interne arkitekturen, vev fine struktur og celle struktur ble bevart etter airway instillasjon denne etappe, den stabiliserende reagens14. Denaturering av proteiner og krysskobling formasjon er to viktige mekanismer som er viktig i fiksering av vev. Dehydrating forbindelser eller koaguleringsmidler, for eksempel alkohol eller aceton, forårsake denaturering av proteiner, noe som resulterer i endringer av tertiær protein av destabiliserende hydrofobe bindinger. Non-koagulere fikse agenter som paraformaldehyde eller glutaraldehyde reagerer kjemisk med proteiner og inter molekylære og intra molekylær cross-links. Siden flere flekker prosedyrer, for eksempel hematoxylin og eosin flekker, er avhengig av Inter molekylære interaksjoner, kan fargeresultatene være dårlig, avhengig av etappe, den stabiliserende agent. Antigen-henting metoder i immunohistochemistry har vist at noen av reaksjonene til fiksering er reversibel, spesielt de av formaldehyd40.
Begrensninger av teknikken: siden alveolar overflaten fôr fjernes ved intratracheal instillasjon fiksativene, tolkningen av, f.eks alveolar mikroarkitektur, Slim akkumulering, eller inflammatorisk celle migrasjon kan manipuleres 41 , 42 , 43.
Avgjørende skritt i protokollen: her viser vi intratracheal instillasjon på 4% PFA som en bred tilnærming til å visualisere effekten av fedme på lunge resultater. Som nevnt ovenfor, må protokollen endres avhengig av problemet, i henhold til ATS/ere anbefalinger14.
I tillegg til tidligere nevnte parameterne er stress en stor faktor som påvirker forskningsresultater. Derfor trening både mus og forskeren er uunnværlig. Mus bør være tilpasset påbud og skal overføres til eksperimentelle området under rolig forhold44. Stress påvirker metabolismen, f.eks av stress hormon utgivelse, utgitt blodsukkeret er økt, en effekt som kan feiltolkes som nedsatt glukosetoleranse. Stress hormon utgivelse også endrer mottakelighet for anestesi narkotika, spesielt, dosen av anestesi er økt og tid til å nå kirurgisk toleranse er langvarig. Som nevnt, kan økt antall bedøvelse påvirke bronchoconstriction, mens stress selv kan føre bronkial dilatasjon.
I sammendraget inneholder denne artikkelen tre metoder for å vurdere virkningen av fedme og metabolisme på lunge struktur og funksjon i mus. Alle nevnte metodene kan overføres til andre sykdom modeller og gnagerarter, som fedme på grunn av genetiske modifikasjoner eller rotte modeller. Anvendelsen av disse teknikkene kan være nyttig å definere nye molekylære mekanismer i DIO modeller med bestemte genet ablasjon, eller å teste nye terapeutiske metoder for å behandle/unngå de negative effektene av fedme på kroniske lungesykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Eksperimentene ble støttet av Marga og Walter Boll-Stiftung, Kerpen, Tyskland; Prosjektet 210-02-16 (MAAA), prosjektet 210-03-15 (MAAA) og av tyske Foundation (DFG; AL1632-02; MAAA), Bonn, Tyskland; Senter for molekylær medisin Köln (CMMC; Universitetssykehuset Köln; Karriere fremme Program; MAAA), Köln formue (fakultet, Universitetet i Köln; KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GlucoMen LX | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 38969 | blood glucose meter |
| GlucoMen LX Sensor | A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy | 39765 | Test stripes |
| Glucose 20% | B. Braun, Melsung, Germany | 2356746 | |
| FinePointe Software | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-002 | |
| FinePointe RC Single Site Mouse Table | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1831-001 | |
| FPRC Controller | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1075-001 | |
| FPRC Aerosol Block | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-1106-001 | |
| Aerogen neb head-5.2-4um | DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands | 601-2306-001 | |
| Forceps | FST, British Columbia, Canada | 11065-07 | |
| Blunt scissors | FST, British Columbia, Canada | 14105-12 | |
| Micro scissors | FST, British Columbia, Canada | 15000-00 | |
| Perma-Hand 4-0 | Ethicon, Puerto Rico, USA | 736H | Surgical suture |
| Roti-Histofix 4% | Roth | P087.1 | 4% Paraformaldehyd |
| Ketaset | Zoetis, Berlin, Germany | 10013389 | Ketamine |
| Rompun 2% | Bayer, Leverkusen, Germany | 770081 | Xylazine |
References
- Kelly, T., Yang, W., Chen, C. S., Reynolds, K., He, J. Global burden of obesity in 2005 and projections to 2030. Int J Obes (Lond). 32, 1431-1437 (2008).
- Freemantle, N., Holmes, J., Hockey, A., Kumar, S. How strong is the association between abdominal obesity and the incidence of type 2 diabetes? International journal of clinical practice. 62, 1391-1396 (2008).
- Wassink, A. M. J., et al. Waist circumference and metabolic risk factors have separate and additive effects on the risk of future Type 2 diabetes in patients with vascular diseases. A cohort study. Diabetic Medicine. 28, 932-940 (2011).
- Oktay, A. A., et al. The Interaction of Cardiorespiratory Fitness with Obesity and the Obesity Paradox in Cardiovascular Disease. Progress in cardiovascular diseases. , (2017).
- Azamar-Llamas, D., Hernandez-Molina, G., Ramos-Avalos, B., Furuzawa-Carballeda, J. Adipokine Contribution to the Pathogenesis of Osteoarthritis. Mediators Inflamm. 2017, 5468023 (2017).
- Koenig, S. M. Pulmonary complications of obesity. The American journal of the medical sciences. 321, 249-279 (2001).
- Stunkard, A. J. Current views on obesity. The American journal of medicine. 100, 230-236 (1996).
- Murugan, A. T., Sharma, G. Obesity and respiratory diseases. Chron Respir Dis. 5, 233-242 (2008).
- Zammit, C., Liddicoat, H., Moonsie, I., Makker, H. Obesity and respiratory diseases. International journal of general medicine. 3, 335-343 (2010).
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
- McArdle, M. A., Finucane, O. M., Connaughton, R. M., McMorrow, A. M., Roche, H. M. Mechanisms of obesity-induced inflammation and insulin resistance: insights into the emerging role of nutritional strategies. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 52 (2013).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease models & mechanisms. 3, 525-534 (2010).
- Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (1985), 1297-1306 (2003).
- Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in aseptic rodent surgery. Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 12 11-11 12-14 (2008).
- Heydemann, A. An Overview of Murine High Fat Diet as a Model for Type 2 Diabetes Mellitus. Journal of diabetes research. 2016, 2902351 (2016).
- Asha, G. V., Raja Gopal Reddy, M., Mahesh, M., Vajreswari, A., Jeyakumar, S. M. Male mice are susceptible to high fat diet-induced hyperglycaemia and display increased circulatory retinol binding protein 4 (RBP4) levels and its expression in visceral adipose depots. Archives of physiology and biochemistry. 122, 19-26 (2016).
- Jovicic, N., et al. Differential Immunometabolic Phenotype in Th1 and Th2 Dominant Mouse Strains in Response to High-Fat Feeding. PLoS One. 10, e0134089 (2015).
- Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to Background Strain Is Essential for Metabolic Research: C57BL/6 and the International Knockout Mouse Consortium. Diabetes. 65, 25-33 (2016).
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, E15-E26 (2008).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of lipid research. 46, 582-588 (2005).
- Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Current protocols in molecular biology. Chapter 29, Unit 29B.23 (2007).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E849-E855 (2009).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
- Lodhi, I. J., Semenkovich, C. F. Why we should put clothes on mice. Cell Metab. 9, 111-112 (2009).
- Swoap, S. J., Gutilla, M. J., Liles, L. C., Smith, R. O., Weinshenker, D. The full expression of fasting-induced torpor requires beta 3-adrenergic receptor signaling. J Neurosci. 26, 241-245 (2006).
- Geiser, F. Metabolic rate and body temperature reduction during hibernation and daily torpor. Annu Rev Physiol. 66, 239-274 (2004).
- Mead, J. Mechanical properties of lungs. Physiological reviews. 41, 281-330 (1961).
- Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J Appl Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
- Lundblad, L. K., et al. Penh is not a measure of airway resistance! Eur Respir J. 30, 805 (2007).
- Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice. J Appl Physiol. 97, 286-292 (2004).
- Fairchild, G. A. Measurement of respiratory volume for virus retention studies in mice. Applied microbiology. 24, 812-818 (1972).
- Brown, R. H., Wagner, E. M. Mechanisms of bronchoprotection by anesthetic induction agents: propofol versus ketamine. Anesthesiology. 90, 822-828 (1999).
- Goyal, S., Agrawal, A. Ketamine in status asthmaticus: A review. Indian journal of critical care medicine: peer-reviewed, official publication of Indian Society of Critical Care Medicine. 17, 154-161 (2013).
- Doi, M., Ikeda, K. Airway irritation produced by volatile anaesthetics during brief inhalation: comparison of halothane, enflurane, isoflurane and sevoflurane. Canadian journal of anaesthesia = Journal canadien d'anesthesie. 40, 122-126 (1993).
- Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 299, L843-L851 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 516-527 (1982).
- Rolls, G. Process of Fixation and the Nature of Fixatives. , (2017).
- Winsor, L. Tissue processing. Laboratory histopathology. Woods, A., Ellis, R. , 4.2-1-4.2-39 (1994).
- Histochemistry, theoretical and applied. Pearse, A. , Churchill Livingstone. London. (1980).
- Weibel, E. R. Morphological basis of alveolar-capillary gas exchange. Physiological reviews. 53, 419-495 (1973).
- Bur, S., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Lung fixation by airway instillation: effects on capillary hematocrit. Experimental lung research. 9, 57-66 (1985).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 528-533 (1982).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary topics in laboratory animal science. 43, 42-51 (2004).
