Summary
항 체 기반 약물 염증 성 질병을 위한 처리를 혁명 있다. 데 뿐만 아니라 특정 대상에 대 한 직접 효과, 항 체 항 염증 되는 세포를 활성화할 수 있습니다. 이 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 항 염증 제 대 식 세포 활성화 평가 생체 외에서, 마우스 골 수 세포, 그리고 vivo에서 복 막 대 식 세포를 사용 하 여 사용 될 수 있습니다.
Abstract
대 식 세포는 phagocytic 타고 난 면역 세포는 병원 체에 대 한 면역 응답을 시작 하 고 치유와 조직 회복을. 대 식 세포는 선 동적인 응답을 해제에 동등 하 게 중요 하다. 우리 세포 정 맥 면역 글로불린 (IVIg)와 자극된의 다량 항 염증 성 사이토카인, 인터 루 킨 10 (IL-10), 그리고 세균 lipopolysaccharides (응답에서 프로 염증 성 cytokines의 저급 생산할 수 있는 것으로 나타났습니다. LPS)입니다. IVIg는 1000 명 이상의 혈액 기증자의 플라즈마에서 풀링된 다 원자가 항 체, 면역 글로불린 Gs (IgGs), 주로. 면역 결핍증 환자에서 항 체를 보완 하기 위해 또는 면역 또는 염증 성 조건 가진 환자에 있는 면역 반응 억제에 사용 됩니다. Infliximab, 치료 항 종양 괴 사 요인 알파 (TNFα) 항 체 또한 염증 성 자극에 대 한 응답에서 IL-10를 생산 하는 세포를 활성화 하기 위해 표시 되었습니다. IVIg 및 다른 항 체 기반 생물 의약품은 대 식 세포 활성화에 미치는 영향을 확인 하기 위해 테스트할 수 있습니다. 이 문서에는 파생, 자극, 및 murine 골 수 세포를 체 외에서 항 체에 의해 활성화와 murine 복 막 대 식 세포 항 체 비보와 활성화의 평가 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 항 염증 제 대 식 세포 활동 통로 신호 하는 특정 셀의 기여를 결정 하 게 더 럽 히기 서쪽의 사용을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 항 염증 제 대 식 세포 활성화에 특정 protein(s)의 효과 결정 하 유전자 변형된 생쥐와 함께 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 특정 biologics 세포 선 동적인 응답 비보를 감소 시키는 IL 10 생산 하는 항 염증 제 활성화 상태를 변경 하 여 행동 수 있습니다 여부를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 질병 모델 생쥐, 동안 생물 의약품의 효능에 대 식 세포 활성화의 역할에 대 한 정보를 제공 하 고 사람에서 행동의 잠재적인 새로운 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 반대로,이 수 주의 특정 항 체 기반 생물 의약품의 사용에 대 한 전염 성 질병을 치료 하 대 식 세포는 감염에 대 한 호스트 방어에 중요 한 역할을 재생 하는 경우에 특히.
Introduction
대 식 세포는 면역 반응에 여러 역할 감염이 나 부상에 타고 난 면역 세포. 대 식 세포는 감염이 나 조직 손상에 대 한 면역 응답을 시작, 선 동적인 응답을 중지 및 치유 응답1을 홍보 하는 일을 담당 합니다. 3 최고의 공부 대 식 세포 활성화의 예: 1) 대 식 세포 치료 인터페론 감마 (IFNγ)와 세균 lipopolysaccharide (LPS), M (IFNγ + LPS)는 염증 반응;을 지정 2) 대 식 세포와 인터 루 킨 4 (IL-4), M(IL-4), 자극된 치료 응답;과 관련 된 3) 면역성이 있는 복합물 (IC)와 자극된 세포와 LPS, M (IC + LPS)는 염증 반응2,3해제 하는 기능이 있다. M (IC + LPS) M(IL-4) 상처 치유, 세포에서 고 효소 arginase (Arg-1) 또는 FIZZ14를 표현 하지 않습니다. 이러한 염증 세포에 대 한 최고의 마커는 그들의 cytokine 생산5입니다. 세포 건강을 유지 하는 데 여러 역할 하지만 또한 염증 성 질환 및 암3에 기여. 이 때문에, 대 식 세포는 다양 한 질병의 치료에 대 한 주요 치료 대상. 그것은 질병에 대 한 대 식 세포 기반 치료를 개발 하기 위해 그들의 활성화 상태에 대 한 항 체의 효과 조사 해야 합니다.
이 문서의 초점은 파생 murine 골 수 세포 (BMDMs) 및 선 동적인 응답 생체 외 및 생체 내에서항 체 약물의 효과 테스트 하는 복 막 대 식 세포의 사용에 있습니다. 최근, 대 식 세포 활성화6,,78에 항 체의 효과 보여주는 여러 연구 되었습니다. 대 식 세포는 항 체 항 원, 및 LPS, 일반적으로 염증 성 자극 complexed 면역 단지와 활성화 공동 항 염증 성 사이토카인, IL-10와 프로-염증 성 cytokine의 매우 낮은 레벨의 매우 높은 수준의 생산 인터 루 킨 12 (IL-12)9. 또한, infliximab, TNFα에 대하여 단일 클론 항 체에 작동 하는, 부분적으로, 그것의 조각 crystallizable (Fc) 지역7염증 세포를 유도 하 여 발견 되었습니다. 우리 보고 IVIg + LPS M (IC + LPS), 공동 자극된 세포 많은 양의 IL-10과 23 p40 (또는 소 단위 프로-염증 성 사이토카인 인터 루 킨 12의 낮은 금액을 생산 하는 점에서 유사한 항 염증 제 대 식 세포 활성화 유도 IL-12/23p40), 인터 루 킨-6 (일리노이-6), 그리고 TNF8. IVIg polyclonal 항 체의 구성 하는 약 주로 IgG, 1000 명 이상의 기증자10의 혈액에서 풀링된 되는 이다. Idiopathic thrombocytopenic 혈관 등 만성 demyelinating 증, 면역 질환의 광범위 한 치료 하는 데 사용은 하지만 행동의 그것의 기계 장치는 완전히 이해11. 대 식 세포 활성화에 대 한 항 체 기반 약물의 효과 여기 설명 된 방법을 사용 하 여 평가 될 수 있다.
BMDMs 및 복 막 대 식 세포 대 식 세포 활성화에 특정 생물 의약품의 효과 테스트할 수 있습니다. 이 대 식 세포 소스를 사용 하 여 1 차 셀의 평가 허용 합니다. 예비 테스트 교양된 1 차 셀에 항 체의 적은 시간과 다른 시간이 소모 및 비싼 질병 모델 보다 통화 투자 필요 합니다. 주입 약을 건강 한 마우스에서 vivo에서, 그리고 셀을 절연 하 고 비보 전분석, 한 연구는 생물 의약품으로 치료에 영향을 미치는 질병 모델에서 대 식 세포 활성화 여부를 평가 하기 위해 보증을 확인할 수 있습니다.
대 식 세포 활성화 생체 외 및 생체 내에서 생물 학적 치료의 효과 직접 테스트 하는 몇 가지 연구, 우리의 기술을 대체 기술을 통해 이점을 제공 합니다. 현재 기술 포함 혼합된 셀 인구에서 생체 외에서주변 혈액 단 세포, 인간의 세포에는 반응 혼합된 림프 구 (미르) 또는 IVIg infliximab의 효과 같은 생물 학적 약물 효과 테스트 어디 효과 특정 세포 유형7,12에 표시 될 수 없습니다. BMDMs를 사용 하 여 복 막 대 식 세포는 유리 RAW264.7 세포, 프로-염증 성 사이토카인을 생산 하지 않습니다, 같은 셀 라인을 사용 하 여 IL-12, LPS8,13에 대 한 응답. 대 식 세포 응답 ex vivo에 는 항 체 기반 약물의 효과 테스트 cytokine 응답 대 식 세포, 직접 할당 될 수 있기 때문에 이점이 있다 보다는 혈 청 사이토카인 수준14 측정 하 여 대 식 세포 응답을 유추 . BMDMs 및 복 막 대 식 세포를 파생 하 고 항 염증 제 대 식 세포 활성화에 있는 단백질의 특정 역할을 결정 하는 유전자 변형된 쥐에서 분리 수 있습니다. 예를 들어 우리 Il10 결핍 사용(-/-) IVIg 유도 프로-염증 성 cytokine 생산의 감소는 IL-108에 부분적으로 의존을 설명 하는 BMDMs. 활동의 기계 장치는 약의 서 부 럽, 특정 단백질 및 신호 이벤트의 역할을 확인할 수 있습니다을 사용 하 여 조사 수 있습니다. 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) BMDMs 또는 복 막 대 식 세포 항 체 활성화에 기인 하는 유전자 발현의 패턴을 보여주는 것에 수행할 수 있습니다. 질병 모델 생쥐에서 모델에서 항 체 기반 생물 학적 치료의 잠재적인 효 험에 염증 성 장 질환, 류 마티스 관절염과 암15,16, 같은 질병에 대 한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나 17., 여기에 설명 된 기술 정보를 제공 합니다 이러한 생물 의약품의 행동의 메커니즘에 그들은 항 염증 제 대 식 세포 활동을 유도 하는 여부를 확인 하 여.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 브리티시 컬럼비아의 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 골 대 식 세포 유도 및 항 체와 활성화
- CO2 질을 사용 하 여 안락사를 수행 합니다.
- 유도 챔버에 장소 마우스입니다. 때까지 움직이지 하 고 호흡은 깊고 느린 60-90 s 5 %isoflurane 마 취와 함께 마우스를 안락사 하 고
- Isoflurane 마 취를 끄고 마우스 호흡 중지 될 때까지 6-8 L/분 CO2 의 관리. 두고 마우스 CO2 에 적어도 또 다른 5 분 확인을 위해 거기는 더 이상 심장 박동 또는 호흡. 죽음을 보장 하기 위해 자 궁 경부 전위를 수행 합니다.
참고: 8-12 주 오래 된 마우스 대 식 세포의 가장 높은 수익률을 제공합니다.
- 70% 에탄올, 마우스 다리를 스프레이 하 고 무기와 폼 보드 위에 부정사 위치에 밖으로 기지개 하는 다리와 그들을 핀. 가 위, 집게는 피부를 피부와 모피 뒷 다리의 각각의 표면에서 제거 하 얕은 절단 (0.2 cm)를 확인 합니다.
참고:이 절차 및 모든 조직 문화의 조작 살 균 후드에서 수행 합니다. - Tibias와 화관을 볼 수 있도록 근육을 잘라. Tibias와 화관, 뼈와 근육 고관절 바로 아래와 발목 이상 절단 하 여 제거 합니다. 가능한 많은 근육 정돈 한다.
- 70% 에탄올으로 뼈를 살포 하 고 증발, 다음 뼈 플러시 매체 (Iscove의 Dulbecco의 매체 (IMDM), 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 수정)의 6 잘 플레이트에 넣어 그것을 위해 1 분을 기다립니다.
- 0.1 cm 발목, 대 퇴 골의 상단 뼈의 뼈 구멍 노출 되도록 절단 하 여 뼈의 끝을 잘라. 골 수는 보이는 26 게이지 바늘 뼈 구멍에 놓일 수 있습니다 확인 합니다.
- 뼈와 근육 tibias와 무릎 관절에서 화관을 잘라. 캐비티에 10 mL 주사기에 부착 된 26 게이지 바늘을 삽입 합니다. 플러시 중간 뼈의 5 mL 50 mL 원뿔 튜브로 골을 플러시. 각 50 mL 튜브에 두 tibias와 하나의 마우스에서 2 개의 화관을 플러시.
- 여러 번 또는 소용돌이 위아래 플라스틱 덩어리를 부드럽게 분산을 느린 속도로 골 수 있습니다. 골 수의 골 수의 작은 (0.5 m m 미만 함) 부스러기로 깨진 해야 합니다. 플러시 중간 뼈로 50 ml 원뿔 튜브를 채우십시오. 피 펫 내용은 75 cm2 조직 문화에 원뿔 튜브의 플라스 크, 취급 하 고 37 ° C, 5% CO2 1 h에서 품 어.
참고: 성숙 세포와 중간 엽 세포 될 것입니다 플라스 크를 부착 하 고 원하는 조 혈 창시자에에서 유지 하는 동안 삭제 됩니다. - 50 mL 원뿔 관으로 조 혈 창시자와 매체를 플라스틱. 원심 5 분 삭제에 대 한 상 온에서 300 x g에 튜브는 상쾌한 고 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (MCSF) 문화 매체의 5 ml에서는 펠 릿을 resuspend (IMDM, 10 %FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL 페니실린/스, 및 150 μ M monothioglycerol (MTG))입니다.
- Hemocytometer18를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 106 셀/mL, 107 셀/플라스 크 매체, 30 mL에 x 1.5 x 0.5의 농도에 세포 resuspend를 위아래로 부드럽게 플라스틱을 매체를 추가 합니다. 새로운 75 cm2 취급 하는 조직 배양 플라스 크에 현 탁 액 30 mL를 플라스틱.
- 하루 4 일 7 단계 1.9에서에서 초기 문화 후에 세포가 부착 하 고 약간 분기는 반전된 단계 대조 밝은 분야 현미경을 사용 하 여 확인 합니다. 비 부착 한 세포를 포함 하는 매체를 버리십시오. 씻어 IMDM 셀 한 번 하 고 MCSF 문화 매체의 30 mL를 추가 합니다.
- 하루 10 세포가 성숙 때 (> F4/80 및 Mac-1에 대 한 긍정적인 95%), 셀은 다시 확인 점착 및 약간.
- 에 셀 stimulations 접시, 플라스 크에서 문화 매체를 제거 하 고 효소, EDTA 기반 셀 분리 버퍼 (자료 테이블)의 8 mL을 추가. 37 ° C, 5% CO2에서 5 분에 대 한 셀을 품 어.
- 작은 양의 압력, 멸 균 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 부드럽게, 다쳤어요. 세포를 플라스 크 표면에서 분리 된 현미경에서 확인 합니다. 50 mL 원뿔 튜브로 피 펫 해리 셀. 3 번 IMDM의 5 mL로 플라스 크를 헹 구 고 수확 했다 셀 린스 솔루션 수영장. 5 분 동안 실 온에서 300 x g에서 셀 원심
- 3 ml 50 mL 원뿔 튜브 당 MCSF 문화 매체의 셀 펠 릿을 resuspend. Hemocytometer18를 사용 하 여 가능한 셀을 계산 합니다. 1 x 106 셀/mL 및 플레이트 100 μ 셀 서 스 펜 션 (1 x 105 셀/잘)의 농도에서 세포 당 96 잘 조직 문화 취급, 평면 바닥판의 resuspend.
참고: 한 마우스에서 뼈 100 웰 스에 대 한 충분 한 세포를 생성 합니다. 원하는 경우, 셀의 1 mL 6 잘 플레이트 (조직 문화 취급, 평면 하단)에 도금 수 있습니다. 셀 (1 x 106 셀)의 많은 수는 서쪽 오 점 분석에 유용할 수 있습니다. - 일단 부착, 중복 자극 또는 3 중 각각 10 ng/mL IMDM, IVIg, 또는 IVIg + LPS의 30 mg/mL에서에서 LPS의 우물. LPS 또는 IVIg의 복용량 응답을 최적화 하기 위해 적정 될 수 있습니다. Unstimulated 컨트롤으로 중복 되거나 triplicate 우물을 둡니다. 24 시간 (37 ° C, 5% CO2)에 대 한 그들을 품 어.
참고: 다시 도금된 세포 조직 문화 웰 스 1 시간 이내에 준수 해야 합니다. - 개별 1.7 mL microcentrifuge 튜브 각 우물에서 셀 supernatants를 수집 하 고 5 분 동안 10000 x g에서 회전 하 여 어떤 미 립 자 물질을 제거.
- 표면에 뜨는 셀을 제거 하 고는 펠 렛을 방해 하지 않도록. 명확히 셀 메 마른 microcentrifuge 튜브에서 표면에 뜨는 장소.
참고: 셀 supernatants cytokines, IL-10, 및 cytokine 소 단위, 일리노이-12/23 p 40, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA), 즉시에 의해 분석 하거나 장기-80 ° C에 저장 될 수 있습니다. 상용 장비 (자료 테이블)에서 ELISA 프로토콜을 따릅니다. 다른 프로 염증 성 cytokines 수 수 분석, 일리노이-6와 TNF, 그들은 또한 공동 치료 IVIg에 의해 감소 된다 + LPS 자극에 비해 서 혼자 LPS 자극. 자극, 후 부착 세포 부 럽 또는 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (Q-PCR) 19,20같은 기법에 대 한 준비 될 수 있습니다.
2. 마우스에 도전 비보에 IVIg와 복 막 대 식 세포를 수확
- 각 마우스 무게.
참고: 예를 들어 20 g 마우스 IVIg의 500 µ L이 필요 합니다.
참고: 살 균 후드에는 절차를 수행 합니다.
참고: 장소 바늘 신중 하 게 마우스에 있도록 기관, 그러나 오히려, 복 막 공간으로 PBS 주사 하지 않습니다.
참고: 모든 5 Ml 주입 액체의, 약 3.75 mL 복구할 것 이다.
참고: 마지막 주사 후 수 있습니다 액체 축적은 마우스의 멀리 왼쪽 및 오른쪽 측면에서 액체를 추출 하기 쉬운. 장기는 바늘이 위치에 더 적은 방해를 일으킬 것입니다.
참고: 대 식 세포는 다른 복 셀 보다 약간 더 큰 것입니다. 전형적인 수확량은 5 x 105 -1 x 106 세포/야생 타입 C57BL/6 마우스를 사용 하 여 마우스입니다.
옵션: 큰 붉은 혈액 세포의 셀 펠 릿에 있으면 제조업체의 지침에 따라 1 x 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 사용 하 여 그들을 제거 하는 세포 단계를 수행 합니다.
참고: 그것은 필요할 지도 모른다 풀을 사용 하는 경우 실험에 대 한 하나 이상의 마우스에서 셀 triplicate 우물 이나 넣는 자극. 예를 들어 한 마우스 했다 5 x 105 대 식 세포, 도금 매체의 500 μ 필요한 것입니다. 5 웰 스, 또는 중복 한 LPS 복용량 1 실험에 대 한 충분 한 셀 것입니다.
참고: 자극, 후 부착 세포는 서쪽 오 점 또는 PCR 등 기술에 대 한 준비 될 수 있습니다.
3. 마우스에 도전 비보에 IVIg + LPS 및 복 막 대 식 세포를 수확
- 각 마우스 무게. IVIg (100mg/mL 재고 농도) 몸 무게 2.5 g/kg의 마지막 복용량을 제공 하는 데 필요한 볼륨을 계산 합니다. LPS (IMDM에 재고 100 μ g/mL 농도) 0.2 μ g/g 몸 무게의 마지막 복용량을 제공 하는 데 필요한 금액을 계산 합니다.
참고: 예를 들어 20 g 마우스 IVIg 재고 솔루션의 500 µ L와 LPS의 100 μ g/mL 해결책의 40 μ가 필요 합니다. - IVIg의 필요한 금액을 인출 하 고 살 균 26으로 살 균 1 mL 주사기로 LPS 게이지 바늘. 컨트롤 마우스 IVIg에는 영향을 받지 것입니다에 대 한 살 균 PBS ph 7.4 IVIg의 해당 볼륨을 교체 합니다.
- 엄지와 검지 손가락으로 목 뒤쪽의 피부를 잡아와 그것의 꼬리와 나머지 손가락으로 뒷 다리를 들고 한 손으로 마우스 아저씨. 그것의 몸을 바닥 쪽으로 기울기.
- 장소 바늘 낮은 오른쪽 사분면에서 마우스의 복 부를 기준으로 30-40 ° 각도, 경사 및 1.5 cm. 넣기는 IVIg + LPS, 또는 PBS + LPS를 삽입, 2.4 단계에서 intraperitoneally.
- 1 시간 후 2.5-2.10 단계를 수행 하 여 복 막 대 식 세포를 수확.
- 4 ° c.에서 5 분에 대 한 300 x g에서 셀 아래로 회전 복구 된 게 액체의 1 mL를 제거 및 IL-10과 IL-12/23 p 40 여 ELISA 분석에 대 한 제조업체의 지침에 따라 사용 또는 미래의 분석-80 ℃에서 동결.
참고: 정확한 비교 게 유체 cytokine 분석에 대 한 치료를 보장 하기 위해 수행 복 막 구멍의 5 mL flushs 4 번 15 mL의 최종 볼륨에 대 한. 모든 액체는 각 플러시에서 복구할 수 있습니다. - 2.11 단계에서 resuspend 및 실행 가능한 세포.
참고: 대 식 세포는 다른 복 셀 보다 약간 더 큰 것입니다.
옵션: 큰 붉은 혈액 세포의 셀 펠 릿에 있으면 세포 단계 단계 2.11에서 그들을 제거 하려면 제조업체의 지침에 따라 수행 합니다.
참고: 그것은 실험에 대 한 하나 이상의 마우스에서 수영장 셀에 필요할 수 있습니다. 예를 들어 한 마우스 했다 5 x 105 대 식 세포, 도금 매체의 500 μ 필요한 것입니다.
참고: 샘플 수 있습니다 즉시 사용 또는 동결 되며 ELISA cytokine 분석-80 ° C에 저장.
참고: 셀 단계 1.16-1.17, 2.14 서쪽 오 점 또는 PCR, 같은 기술에 대 한 준비 될 수 있습니다.
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Representative Results
Murine 뼈 골 수 유래 세포 aspirates 골 수에서에서 조 혈 세포 선구자에서 경작 될 수 있습니다. 일반적으로 화관과 tibias 한 C57BL/6 마우스의 풀링 골 aspirates 항복 107 파생 된 골 수 세포, 그들에 게 실험에 대 한 대 식 세포의 편리한 소스를 만들기. BMDMs 항 체 기반 약물 응답은 염증 성 자극에 체 외에도전 하는 경우 테스트에 사용할 수 있습니다. 그림 1 에서는 그 IVIg 브랜드 Gammunex (GX) + LPS 항 염증 성 사이토카인의 생산을 증가 하는 IL-10, 7-fold LPS 자극 혼자 (그림 1A)에 비해과 생산의 IL-12/23 p 40 (그림 1 감소 B). 그림 1 는 또한 다른 IVIg 준비 다르게 수행 하는 방법을 보여 줍니다. IVIg의 3 개의 다른 준비는 IL-12/23 p 40 크게 (그림 1B), Octagam (와)과 Gammagard를 줄일 수 있지만 액체 (GL), 크게 증가 하지 IL-10 생산 LPS (그림 1 에 대 한 응답 A). OG와 GL 응답 LPS, 하지만 GX 보다 낮은 학위 IL-12/23 p 40 생산을 크게 줄일 수 있습니다. 이러한 결과 항 체에 영향을 미치는 골 대 식 세포 활성화, 파생 그리고 응답에 변화를 일으킬 수 있는 동일한 약의 준비의 차이점을 보여 줍니다.
BMDMs 서양 blotting에 의해, IVIg의 기계적 효과 테스트를 사용할 수 있습니다. IC + LPS로 활성화 한 대 식 세포 분열 활성화 단백질 (지도) kinases, p38, Erk1/2, 증가 IL-10 생산21에 대 한 책임은의 인 산화를 증가 했다. 그림 2 에 결과 표시 자극, 또는 LPS, IVIg, 또는 IVIg + LPS 자극 되어 대 식 세포에 의해 IL-10 생산에 필요한 지도 키 니 아 제 활성화를 감지 하는 전형적인 서쪽 오 점. IVIg 자극 혼자 또는 IVIg + LPS 공동 자극 증가 활성화 지도 kinases의 LPS 혼자와 본에 비해 이전 및 장기간 인 산화와 Erk1/2. P38의 활성화는 세포 IVIg + LPS 혼자 그 자극에 비해 LPS 자극된에 이전 발생 했습니다. 이 결과 세포 신호에 BMDMs 항 체 약물의 효과 보여 서 부 럽, 같은 메서드를 사용할 수 있습니다 보여 줍니다. Cytokine 생산, 뿐만 아니라 항 염증 제 대 식 세포 활성화 되었음을 보여 지도 키 니 아 제 활성화를 사용할 수 있습니다.
성숙, 조직 주민 대 식 세포 수도 있습니다 IVIg 5.0 x 105 에 대 한 응답을 평가 하는 쥐에서 격리-1.0 x 106 복 막 대 식 세포는 하나의 건강 한 C57BL/6 마우스에서 격리 될 수 있습니다. 그림 3에서 마우스 IVIg 주사에서 복 막 세포 크게 늘리지 마십시오 자극에서 생체 외에서PBS 주입 마우스에 비해의 부재에서 IL-10 생산. IVIg에서 복 막 세포 주입 했을 때 마우스는 ex vivoLPS로 자극, 그들은 6-fold 더 IL-10 PBS를 주입 하는 쥐 보다 생산. 그러나 그들은, 감지 금액의 IL-12/23 p 40 때 비보 전LPS로 자극을 생산 하지를 않습니다. 이러한 결과 입증 비보에 약물을 주입 하 고이 방법으로 세포 전 비보 를 경작 하 여 항 체 효과 세포에 시험 될 수 있다.
대 식 세포 항 체와 염증 성 자극 응답 평가 비보수 있습니다. Cytokine 생산 게 액체에서 평가 될 수 있다 그리고 supernatants ex vivo에서 에서 복 막 대 식 세포를 자극. 그림 4 는 항 염증 성 cytokine IL-10 때에 게 액체(그림 4), 복 막 세포 (그림 4B), 그리고 복 막 대 식 세포 (그림 4C) 증가 마우스 IVIg + LPS PBS + LPS에 비해 도전입니다. 프로-염증 성 cytokine 소 단위, 일리노이-12/23 p 40의 생산에 게 액체만 교양된 복 막 대 식 세포, 상당히 절감 됩니다. 이 방법은 시험에 선 동적인 응답에 vivo에서 ex vivo항 체 의약품의 영향의 수 있습니다.
그림 1 : IVIg와 LPS의 다른 브랜드와 공동 자극 응답에서 macrophage IL-10과 IL-12/23 p 40 생산. C57BL/6 MCSF 파생 된 골 수 세포 중 unstimulated (C) 또는 LPS로 자극 (10 ng/mL), IVIg (30 mg/mL), 또는 IVIg + LPS. IVIg의 다른 브랜드의 세 가지 테스트를 했다: Gammunex (GX), Gammagard 액체 (GL)와 Octagam (와). 대 식 세포 supernatants 자극, 후 24 h를 수집 하 고 원심 분리에 의해 명백 하 게 했다. (A) IL-10과 IL-12/23 p 40 (B)에 대 한 ELISAs 수행 했다. 데이터는 대 식 세포에서 n = 3 독립적인 실험, 세포 실험, ELISAs 당 1 개별 마우스에서 중복에서 분석. 데이터는 의미 ± sd. *P < 0.05, * * P < 0.001, * * *P < LPS 자극와 IVIg 사이 비교를 위해 0.0001 + LPS 공동 자극. 단방향 분산 분석 (ANOVA) Tukey의 다중 비교 테스트 후와 통계 분석을 위해 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : IVIg 활성화 대 식 세포에서 지도 키 니 아 제 활성화의 서쪽 오 점 분석. MCSF 파생 된 골 수 세포 했다 unstimulated 또는 LPS로 자극 (10 ng/mL), GX IVIg (30 mg/mL), 또는 GX IVIg + LPS; 0, 10, 40, 또는 120 분 전체 세포 lysates (1.0 x 106 대/차선) 나트륨 라우릴 황산 염-polyacrylamide 대상이 됐다 위해 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)와 서양 p38 대 인 특정 항 체를 더 럽 히 고 세포 외 신호 통제 키 (Erk1/2), 뿐만 아니라 glyceraldehyde 3 인산 염 효소 (GAPDH), 로드 제어로. 표시 된 결과 n = 3 독립적인 실험, 세포 실험 당 1 개별 마우스에서.3 독립적인 실험에서 평균 GAPDH 정규화 pp38 및 pErk1/2 단백질 수준, Densitometry 각 밴드 아래 표시 됩니다. 이 그림은 Kozicky 외8에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : IVIg 비보와 함께 도전 하는 쥐에서 대 식 세포에 의해 IL-10 생산. 8 주 된 C57BL/6 마우스 살 균 PBS (주입 제어) 또는 GX IVIg (2.5 g/kg) intraperitoneally 부여 했다. 1 시간 후 쥐 했다 안락사 하 고 복 lavages 수행 했다. 복 막 대 식 세포 부착 선택을 사용 하 여 격리 했다입니다. 대 식 세포 중 unstimulated (C) 또는 LPS로 자극 (10 ng/mL). 셀 supernatants 수확 하 고 IL-10 ELISAs 24 h 후 명확히 했다. 데이터는 n에서 = 3 독립적인 실험, ELISAs에서에서 수행 하는 그룹 당 5 개별 마우스 중복에서 분석. 데이터는 의미 ± sd. * P < 0.01 및 NS = 중요 한. 통계 분석은 양방향 ANOVA를 사용 하 여 여러 비교를 Sidak의 posttest를 수행 했다. 이 그림은 Kozicky 외8에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : IL-10과 IL-12/23 p 40 생산 IVIg + LPS 도전 쥐에서 vivo에서. 8 주 된 C57BL/6 마우스 컨트롤; PBS + LPS (0.2 µ g/g 몸 무게), intraperitoneally 주입 했다 또는 GX IVIg (2.5 g/kg 몸 무게) + LPS (0.2 µ g/g 몸 무게). 1 시간 후 쥐 했다 안락사 하 고 복 lavages 수행 했다. (A) Clarified 게 액체, (B) 단계 1 h 대 식 세포 부착, 복 막 세포에서 조절된 supernatants 명확히 하 고 (C) 명백 하 게 24 시간 복 막 대 식 세포 (Mφ) supernatants 했다에 대 한 분석 IL-10과 IL-12/23 p 40에 의해 애 란 데이터는 의미 ± SD n = 3 독립적인 실험에서 5 쥐 ELISAs와 중복에서 분석. P < 0.05, * *P < 0.01, * * *P < 0.001, 및 NS = 중요 한. PBS + LPS를 주입 하는 쥐 IVIg + LPS는 학생의 t 시험을 사용 하 여 주입 하는 쥐를 비교 했다. 이 그림은 Kozicky 외8에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
대 식 세포 활성화 상태 두 조직의 항상성 및 질병22에 중요 한 역할을 한다. 대 식 세포 활성화 상태, 그들의 microenvironment3에서 신호에 따라 중복 뿐만 아니라 고유 할 수 있습니다. 그들은 염증 반응의 모든 단계에 있는 명백한 역할: 병원 체에 대 한 방어, 상처 치유 및 조직 회복, 그리고 또한 염증 반응2 해제에 대 한 중요 한 다른 항 염증 제 활성화 상태 . 항 염증 제 대 식 세포 활성화 항 염증 성 사이토카인, IL-10, IL-1223같은 프로 염증 성 cytokines의 낮은 금액의 높은 금액을 생산 하는 세포에 대 한 두 개의 외부 자극을 필요 합니다. 하나의 신호 항 체 Fc 감마 수용 체를 통해 행동에서 유래 하 고 두 번째 신호는 LPS 또는 IFNγ와 같은 프로-염증 성 자극24,25. 혈 청, 면역성이 있는 복합물, 및 안티-TNFα 항 체, 모든 세포8,23,,2526에서 높은 IL-10-produing 항 염증 제 활성화 상태를 유도 하기 위해 발견 되었습니다. 우리의 그룹은 이전 murine 골 수 세포를 파생 하 고 또한 IL-10과 거의 없는 프로-염증 성 IL-12/23 p 40 LPS8에 대 한 응답의 높은 금액을 생산 하는 복 막 대 식 세포와 IVIg 자극된 게시 했습니다. 우리는 또한 다른 프로 염증 성 cytokines, 일리노이-6와 TNF에서 파생 하는 골 수 세포8IVIg에 의해 또한 감소 된다 나타났습니다. 여기에 설명 된 방법은 마우스 BMDMs 복 막 대 식 세포 생체 외 및 생체 내에서다른 항 체 기반 약물 응답을 테스트를 적용할 수 있습니다.
마우스 골 수 및 복 막 대 식 세포 치료제 항 체 기반 테스트에서 많은 중요 한 단계가 있습니다. 불 임을 유지 하는 것은 각 프로토콜에 대 한 중요 합니다. 경우 대 식 세포 문화 공기, 모피, 또는 쥐의 배설물에서 미생물과 오염, 대 식 세포는 프로 염증 성 cytokines을 생산 하 여 그 자극에 응답 합니다. Biosafety 캐비닛에 모든 실험을 수행, 에탄올, 자유롭게 마우스를 살포 하 고 복 막 플러시 동안 내장의 무결성을 보장 필수적입니다. 항 체는 또한 살 균 하 고 제조업체의 지시에 따라 저장 유지 되어야 한다. 그것은 오염, 만료, 또는 혼 탁 한 경우 사용할 수 없습니다. 탁도, 약의 효과 감소 하 고 약 적절 한 온도에서 저장 되지 않은 또는 너무 오랫동안 저장 된 경우 발생할 수 있습니다. IVIg는 4 ° C에서 저장 고 전에 만료 날짜에 도달 하면, IL-10 생산 수준의 영향을 받을 수 있기 때문에 사용 될 수 있습니다. 또는, 우리는 응답에 영향 없음-20 ° C에 얼 수 있다 보았다. IVIg 브랜드 준비, 그림 1에서 같이 다른 유형의 세포에서 다른 응답을 발생할 수 있습니다 반면 IVIg의 다른 많은 유사한 실험 결과를 리드. 에센셜 제어, unstimulated와 같은 셀 및 셀, 항 체와 자극된 세포 또는 약물의 오염 배제 하는 각 실험에 포함 되어야 합니다.
몇 가지 수정은 실험을 사용자 지정 하려면 이러한 프로토콜을 만들 수 있습니다. 비 염증 상태에서 대형 실험에 대 한 충분 한 복 막 대 식 세포를 분리 하기 어려울 수 있습니다. 복 막 대 식 세포는 thioglycollate (TG)의 복 주입 하 여 elicited 수 있습니다. 면역 반응을 발생 하 고 4 일 후에 이끌려 복 막 대 식 세포 수확된27일 수 있다. 모집된 대 덜 성숙 수 있습니다 그리고 우리가 여기, 중요 한 고려 사항이 있는 사용 해야 주민 세포를 대표 하지 않는다. TG elicited 세포 수 있습니다 또한 먹어서27에 실험 하는 경우에 특히, 합병증이 있을 수 있습니다 TG 국물에서 agar를 내가지고. 다른 유전 배경, C57BL/6 또는 BALB/c 마우스 실험에도 사용할 수 있습니다 그리고 필요한 특정 유전 배경 질환 모델에서 평가 하는 대 식 세포 응답에 항 체의 영향 검토를 선택할 수 있습니다. 또한, 우리가 우리 자신의 작품8일 Il10/- 생쥐 같은 유전자 변형된 쥐 약물, 행동의 메커니즘에 특정 단백질의 기능을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 다른 염증 성 자극은 또한 대 식 세포 활성화에 항 체의 영향을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. IFNγ, 그리고 수용 체 (TLR) 촉진제 (예: 히 알루 론 산) 같은 파생 호스트 수신자 IL 10 생산 세포25,28을 활성화 하기 위해 사용 되었습니다. 중요 한 고려 사항은 항 체의 복용량은. 항 체 공급자 사이 다 것 이다 복용량은 문화에서 및 동물 실험에서 최적의 복용량을 얻기 위해 적정 한다. 선택한 복용량 또한 인 간에 게 주어진 복용량을 반영 해야 하 고 약물 사이 다를 것 이다. IVIg는 이러한 프로토콜29,30에 사용 되는 적정 한 복용량을 반영 하기 위해 항 염증 치료에서 고용량 (25-35 mg/mL 또는 2g/kg 몸 무게),으로 제공 됩니다.
골 수 및 복 막 대 식 세포의 사용에는 제한이 있습니다. 대 식 세포 세포 라인 개선, 마우스 BMDMs은 조 혈 선구자에서 아직도 인위적으로 파생된 셀. 체 외에서 세포의 면역 반응 테스트 이해 항 체 응답을 하는 중요 한 단계 이지만, vivo에서 실험도 수행 해야. 자극에서 vivo에서 세포 전 비보경작 뒤 주입, 항 체 기반 약물 또한 질병 상태에서 염증 세포를 활성화할 수 있습니다 여부를 조사 하는 미래 연구에 대 한 자세한 정보를 제공할 수 있습니다. 항 체 기반 biologics을 받는 사람들에서 발생에 결론이이 실험에서 그려야 수 없습니다. 몇 연구 인간 monocyte 파생 된 대 식 세포 생체 외에 IVIg의 효과 평가 하기 위해 출판 되었습니다. 생체 외에서 인간 monocytes 생산 일리노이-6의 수에 있는 감소 보고 되었습니다, IVIg는 공동 LPS 혼자12자극에 비해 LPS로 자극 하는 경우. IVIg 감소 TNFα과 일리노이-6 생산 THP-1 인간 monocytic에 procalcitonin (PCT)와 함께 자극 하면 세포31.
이 문서 내에서 프로토콜 기존 방법에 비해 장점이 있다. 골 수 유래 세포와 복 막 대 식 세포는 1 차 셀, 마우스에서 직접 분리 보다는 세포 선을 불멸 하 게 되 고.RAW264.7 세포 등 마우스 대 식 세포와 같은 세포 라인 프로-염증 성 사이토카인을 생산 하지 않습니다 IL-12, LPS, 응답에는 IL-10 IVIg8,13에 대 한 응답에서 생산 되는 의해 통제 된다 중요 한 사이토카인. 한 마약에서 테스트 vivo에서 LPS와 게 유체, 복 막 세포, 및 특히, 복 막 대 식 세포의 분석을 통해 지역 복 막 환경에 약의 효력의 검사를 허용 합니다. 그것은 짧은 기간, 질병의 더 이상 하 고 더 비용이 많이 드는 동물 모델에서 대 식 세포 활성화에 항 체의 일반적인 효과의 시험을 정당화 하기 위해 중요 한 정보를 제공할 수 있는 간단한 모델. Endotoxemia 모델 실험 측정이 종종 마우스 생존 또는 혈 청14cytokines에 이점이 있다. 생존 률과 혈 청 cytokines은 면역 반응의 중요 한 측정 하지만 그들은 표시 되지 않습니다 기여 세포 구체적으로 가질 수 있습니다. 분리 하 고 도전 실험에서 복 막 세포 배양 항 체 치료제는 대 식 세포 기능에 미칠 수 있는 직접적이 고 측정 가능한 효과 보여줍니다.
이러한 메서드는 응용 프로그램 테스트 및 생물 학적 치료를 설계. 치료제로 서 항 체를 사용 하 여 최근 몇 년 동안에서 극적으로 증가 했다. 그러나,이 치료는 항 체의 Fc 부분을 인식 하 고 그들의 사이토카인 생산을 변경할 수 있는 세포에 추가 알 수 없는 효과 있을 수 있습니다. 안티-TNFα 항 체, infliximab, IL-10 유도 및 억제 T 세포 확산의 Fc 부분을 통해 표시 되었습니다 그리고 그 액션7,,1526의 메커니즘의 하나로 제안 되었습니다. 유전자 모델을 사용 하 여, 특정 단백질 어떻게 이러한 약물 대 식 세포 활성화에 영향을의 메커니즘에 연루 될 수 있습니다. IgG 항 체와 항 체의 준비의 클래스는 어떻게 세포 생물 의약품에 의해 영향을 받습니다 변경 변경할 수 있습니다. 우리의 데이터 나타냅니다 준비 및/또는 스토리지 같은 항 체 의약품 (IVIg)의 대 식 세포 활성화에 미치는 영향을 줄 수 있습니다. 이 문서 내에서 방법은 치료 될 수 있는 암 치료를 하는 동안 immunosurveillance를 유지 하기 위해 중요 한 염증 세포 종양의 진행을 촉진 수도 있습니다 이러한 효과 없는 디자인을 사용할 수 있습니다. 이러한 기술은 디자인 하 고 이러한 효과 마약 바람직한 평가 또한 사용 될 수 있습니다. 예를 들어 도움이 대 식 세포 선 동적인 응답을 선 동적인 장 질병 또는 류 마티스 관절염에 대 한 치료를 향상 시키기 위해 항 염증 제 IL 10 생산 하는 세포를 만들 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
L.K.는 브리티시 컬럼비아의 대학 4 년 친교 (4YF) 대학원 재학 상 받는 사람입니다. L.M.S.은 위장의 캐나다 협회의 받는 사람 / 크 론 및 Colitis 캐나다 CIHR 새로운 탐정 급여 수상 / 건강 연구를 위한 마이클 스미스 재단의 생물 의학 학자입니다. 이 작품은 건강 연구의 캐나다 학회 (# CIHR2016-LS 부여)와 공동으로 캐나다 혈액 서비스에서 프로젝트 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
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