Summary
Antikor bazlı ilaçlara inflamatuar hastalıkları tedavisinde devrim. Belirli hedefleri üzerinde doğrudan etkileri sahip olmanın yanı sıra, antikorlar makrofajlar anti-inflamatuar olmak için etkinleştirebilirsiniz. Bu protokolü nasıl anti-inflamatuar makrofaj açıklar harekete geçirmek-ebilmek var olmak istimal fare kemik iliği makrofajlar ve Periton makrofajlar kullanarak içinde vivo biçilen in vitro .
Abstract
Makrofajlar fagositik doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, bağışıklık yanıtı patojenlere başlatmak ve şifa ve doku iadesi için katkıda bulunmaktadır. Makrofajlar inflamatuar yanıt dönüm eşit derecede önemlidir. Makrofajlar intravenöz immünglobulin (IVIG) ile uyarılan yüksek miktarda anti-inflamatuar sitokin, İnterlökin 10 (IL-10) ve yanıt olarak bakteriyel lipopolisakkaritler (pro-inflamatuar sitokinlerin seviyesinin düşük üretebilir göstermiştir LPS). IVIG polivalan antikor, öncelikle immünglobulin Gs (IgGs), 1.000'den fazla kan bağış plazma havuza alınmış olduğunu. Bu antikorlar bağışıklık eksikliği olan hastalarda ek olarak ya da otoimmün veya inflamatuar koşulları olan hastalarda immün yanıt-e doğru bastırmak için kullanılır. İnfliksimab, bir tedavi anti-tümör nekroz faktör alfa (TNFα) antikor, ayrıca IL-10 inflamatuar uyaranlara yanıt üretmek için makrofajlar etkinleştirmek için gösterilmiştir. IVIG ve diğer antikor tabanlı destekte makrofaj harekete geçirmek üzerindeki etkileri belirlemek için test edilecek. Bu kağıt türetme, stimülasyon ve değerlendirme fare kemik iliği makrofajlar tarafından antikorlar vitro aktif ve ile antikor içinde vivoaktif fare peritoneal makrofajlar yöntemleri açıklar. Son olarak, belirli hücre anti-inflamatuar makrofaj aktivitesi yolları sinyal katkısını belirlemek için western Blot kullanımını göstermektedir. Bu protokoller genetiği değiştirilmiş fare ile anti-inflamatuar makrofaj etkinleştirme belirli bir protein(s) etkisini belirlemek için kullanılabilir. Bu teknikler, belirli destekte inflamatuar yanıt içinde vivoazaltan bir IL 10 üreten anti-inflamatuar harekete geçirmek durum için makrofajlar değiştirerek hareket edebilir olup olmadığını değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu etkinliği sırasında hastalık modelleri farelerde makrofaj etkinleştirme destekte, rolü hakkında bilgi vermek ve bir potansiyel yeni etki mekanizması kişilerde içgörü sağlamak. Özellikle makrofajlar bu enfeksiyona karşı konak savunmasında önemli bir rol oynamak Eğer tersine, bu belirli antikor tabanlı destekte kullanımına karşı bulaşıcı hastalığı tedavi etmek için dikkat.
Introduction
Enfeksiyon ya da yaralanma bağışıklık yanıtında birden çok rol oynamak doğuştan gelen bağışıklık hücreleri makrofajlar vardır. Makrofajlar, enfeksiyon veya doku hasarı bir bağışıklık yanıtı başlatmak, inflamatuar yanıt durdurma ve şifa yanıt1teşvik için sorumludur. Üç en iyi okudu makrofaj harekete geçirmek durum örnekleri şunlardır: 1) ile interferon gama (IFNγ) ve bakteriyel lipopolysaccharide (LPS), M (IFNγ + LPS), inflamatuar yanıt; katkıda belirlenmiş tedavi makrofajlar 2) şifa yanıtıyla ilişkili olan makrofajlar ile İnterlökin 4 (Il-4), M(IL-4), uyarılmış; 3) makrofajlar bağışıklık kompleksleri (IC) ile uyarılmış ve LPS, M (IC + LPS), inflamatuar yanıt2,3kapalı açmak seçeneğine sahipsiniz. M (IC + LPS) makrofajlar şifa M(IL-4) yaradan farklıdır ve enzim arginase (Arg-1) veya FIZZ14ifade değil. En iyi bu anti-enflamatuar makrofajlar için onların sitokin üretim5belirtecidir. Makrofajlar sağlığı korumak birden çok rol var, ama aynı zamanda inflamatuar hastalıkları ve kanser3katkıda. Bu nedenle, çok çeşitli hastalıkların tedavisi için anahtar bir terapötik hedef makrofajlar vardır. Makrofaj dayalı tedaviler hastalığı için geliştirmek için onların harekete geçirmek durum antikorlar etkilerini araştırmak önemlidir.
Bu kağıt fare kemik iliği türetilmiş makrofajlar (BMDMs) ve inflamatuar yanıt içinde in vitro ve in vivoantikor ilaçların etkisi test etmek için Periton makrofajlar kullanımı üzerinde odaklanmıştır. Son zamanlarda, makrofaj harekete geçirmek6,7,8antikorların etkilerini gösteren birden çok çalışma yapılmıştır. Makrofajlar harekete geçirmek antikorlar bir antijen ve LPS, normalde inflamatuar bir uyarıcı ile complexed olan bağışıklık kompleksleri ile birlikte çok yüksek düzeyde anti-inflamatuar sitokin, IL-10 ve pro-inflamatuar sitokin düzeyi çok düşük üretmek, İnterlökin 12 (IL-12)9. Ayrıca, infliksimab, Monoklonal antikor TNFα karşı iş, kısmen, ile onun parçası crystallizable (Fc) bölge7anti-inflamatuar makrofajlar inducing tarafından tespit edilmiştir. IVIG + LPS neyin ortak uyarılmış makrofajlar IL-10 büyük miktarda ve pro-inflamatuar sitokin alt birim İnterlökin 12 veya 23 p40 (düşük miktarda üretmek M (IC + LPS), için benzer anti-inflamatuar makrofaj harekete geçirmek neden bildirdin Il-12/23p40), İnterlökin-6 (Il-6) ve TNF8. IVIG poliklonal antikorlar oluşan bir havuza 1.000'den fazla bağış10kandan IgG öncelikle ilaçtır. Çok çeşitli idiyopatik trombositopenik purpura ve kronik demiyelinizan polinöropati, gibi immünolojik hastalıkların tedavisinde kullanılan ama onun etki mekanizmaları tamamen anlaşılır11değil. Antikor dayalı ilaçların etkileri makrofaj etkinleştirme hakkında burada açıklanan yöntemleri kullanarak tespit edilebilir.
Makrofaj etkinleştirme belirli destekte etkilerini BMDMs ve Periton makrofajlar içinde test edilebilir. Bu makrofaj kaynaklarını kullanarak Primer hücre değerlendirilmesi izin verir. Antikor kültürlü Primer hücre üzerinde ön test daha az zaman ve daha başka zaman alıcı ve pahalı hastalık modelleri parasal yatırım gerektirir. Sağlıklı fare vivo içindebir uyuşturucu enjekte etme ve hücreleri izole ve ex vivoanaliz, kimse çalışmalar destekte tedaviyle makrofaj harekete geçirmek içinde hastalık modelleri etkiler değerlendirmek için gerekip gerekmediğinin belirleyebilirsiniz.
Makrofaj harekete geçirmek içinde in vitro ve in vivo biyolojik tedaviler etkisi doğrudan test kaç çalışmalar ile bizim teknikleri alternatif teknikleri üzerinde bir avantaj sağlar. Güncel teknikler içeren karma hücre popülasyonları vitro, karışık lenfosit reaksiyon (MLR) veya IVIG infliksimab periferik kan mononükleer hücrelerinde insan makrofajlar üzerinde etkisi gibi üzerinde test biyolojik uyuşturucu etkileri nerede etkisi bir belirli hücre türü7,12' ye isnat edilemez. BMDMs ve Periton makrofajlar kullanarak avantajlı hücre hatları, pro-inflamatuar sitokin üretmek değil, RAW264.7 hücreleri gibi kullanarak üzerinden IL-12, LPS8,13yanıt olarak. Bir antikor tabanlı uyuşturucu etkisi makrofaj yanıt ex vivo test sitokin yanıtları makrofajlar doğrudan bağlanabilir çünkü avantajları vardır yerine serum sitokin düzeyleri14 ölçerek makrofaj yanıt çıkarım . BMDMs ve Periton makrofajlar türetilen ve anti-inflamatuar makrofaj harekete geçirmek bir proteinin belirli bir rolü belirlemek için genetik olarak değiştirilmiş fare gelen izole. Örneğin, biz-si olmak kullanılmış Il10 eksik(- / -) BMDMs IVIG kaynaklı azaltma pro-inflamatuar sitokin üretiminin IL-108tarihinde kısmen bağlı olduğunu göstermek için. Bir ilacın etki mekanizmaları western Blot, spesifik proteinlerin ve sinyal olaylar rolü belirlendiği yerde kullanarak soruşturma olmaktır. Nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) BMDMs ya da Periton makrofajlar antikor aktivasyon neden gen ekspresyonu kalıpları göstermek için gerçekleştirilebilir. Hastalık modelleri farelerde bilgi ilgili modelleri antikor tabanlı biyolojik tedaviler potansiyel etkinliğini inflamatuvar barsak hastalığı, romatoid artrit, kanser15,ve16, gibi hastalıklar için sağlar 17. ancak, burada açıklanan teknikler bilgi bu destekte eylem mekanizması anti-inflamatuar makrofaj aktivitesi neden olup olmadığını belirleyerek sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) British Columbia Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. kemik iliği makrofaj türetme ve ile antikor etkinleştirme
- Ötenazi CO2 boğulma kullanarak gerçekleştirin.
- İndüksiyon odasında yerde fare. Derin ve yavaş hareketsiz ve nefes kadar fare ile 60-90 s, % 5 isoflurane anestezi ötenazi.
- İsoflurane anestezi açmak ve fare nefes durana kadar 6-8 L/dak CO2 yönetmek. Fare CO2 ile en az 5 dk. doğrula için orada olduğunu artık bir kalp atışı veya solunum çıkarma. Ölüm sağlamak için servikal yerindençıkmasına gerçekleştirin.
Not: 8-12 hafta yaşlı fareler makrofajlar en yüksek verimi sağlamak.
- Sprey fare bacaklar % 70 etanol ve sırtüstü pozisyonda bir köpük tahta üzerinde onlarla kollar ve bacaklar gergin PIN ile. Makas ve cilt tutulacağı pensler, deri ve kürk her şiir yüzeyinden kaldırmak için sığ kesim (0.2 cm) olun.
Not: Bu yordam ve tüm doku kültürü manipülasyonlar steril bir mahallede gerçekleştirin. - Yırtılmalarıteşhis ve uyluk görünür kılmak için kas kırpın. Yırtılmalarıteşhis ve uyluk, kemik ve kas Kalça eklemi hemen altında ve ayak bilekleri üzerinde keserek çıkarın. Mümkün olduğu kadar kas döşeme.
- Kemikleri % 70 etanol ile sprey ve buharlaşmasına sonra kemik floş orta (Iscove'nın Dulbecco'nın orta (IMDM), % 10 fetal sığır serum (FBS) değiştirilmiş) 6 iyi tabağına koyup 1 dakika bekleyin.
- Kemikleri biter böylece kemik boşluğu maruz kemik ayak bileği ve femur üst kapalı 0.1 cm kesim tarafından kırpın. Kemik iliği görülür ve 26 gauge iğne-ebilmek var olmak konulmak kemik boşluğunda emin olun.
- Kemikler ve kaslar yırtılmalarıteşhis ve kalça diz eklemleri dan ayırmak için kesti. Bir 10 mL şırınga boşluğuna bağlı 26 gauge iğne yerleştirin. Kemik iliği kemiğin floş orta 5 mL ile 50 mL konik tüp içine sifonu çek. İki yırtılmalarıteşhis ve bir fareden iki uyluk her 50 mL tüp içine boşalt.
- Yukarı ve aşağı birkaç kez veya girdap yavaşça kümeleri dağıtmak için yavaş hızda iliği pipette. Dizeleri iliği kemik iliği küçük (daha az 0,5 mm) lekeler kırık. 50 ml konik tüp floş orta kemik ile doldurun. Konik tüp 75 cm2 doku kültürü içine içeriğini pipet şişesi tedavi ve 37 ° c, % 5 CO2 1 h için kuluçkaya.
Not: Olgun makrofaj ve Mezenkimal hücreler olacak şişeye yapışık ve atılır, istenen hematopoetik ataları süspansiyon kalırken. - Hematopoetik ataları ile orta 50 mL konik tüp içine pipette. 300 x g, oda sıcaklığında 5 dk. atmak için de tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet makrofaj koloni uyarıcı faktör (MCSF) kültür orta 5 mL resuspend (IMDM, %10 FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL penisilin/streptomisin ve 150 mikron monothioglycerol (MTG)).
- Bir hemasitometre18kullanarak hücreleri saymak. 0.5 x 106 hücre/mL, 1.5 x 107 hücreler/şişeye 30 mL orta, bir konsantrasyon hücrelere resuspend ve yukarı ve aşağı yavaşça pipet için orta ekleyin. 30 mL süspansiyon yeni bir 75 cm2 doku kültürü tedavi şişe pipet.
- 4. gün ve 7 gün sonra ilk adım 1.9 kültüründe, hücreleri yapışık ve biraz dallı bir ters faz kontrast parlak alan mikroskop kullanarak olduğundan emin olun. Yapışık olmayan hücreleri içeren orta atın. IMDM hücrelerle bir kez yıkama ve MCSF kültür orta 30 mL ekleyin.
- Ne zaman hücreleri olgun 10 gün (> % 95'i F4/80 ve Mac-1 için pozitif), tekrar hücreleri olduğunu doğrulayın yapışık ve biraz.
- Hücreler elektrodlar için plaka, kültür orta balonun kaldır ve enzim ücretsiz, EDTA tabanlı cep ayrılma arabelleği (Tablo reçetesi) 8 mL eklemek için. 37 ° c, % 5 CO25 min için hücreleri kuluçkaya.
- Hücreleri nazikçe, basınç, steril hücre kazıyıcı kullanarak küçük bir miktar ile kazı. Hücreleri şişesi yüzeyden ayırdıktan mikroskop iade edin. Disosiye hücreleri 50 mL konik tüp içine pipet. Şişesi 3 kez 5 mL IMDM de ile durulayın ve durulama çözüm hasat edildi hücreleri ile havuz. 300 x g 5 min için oda sıcaklığında hücreleri santrifüj kapasitesi.
- Hücre Pelet MCSF kültür orta 50 mL konik tüp başına 3 mL resuspend. Bir hemasitometre18kullanarak canlı hücreleri hesaplama. 1 x 106 hücre/mL ve plaka 100 μL hücre süspansiyon (1 x 105 hücreleri/de) bir konsantrasyon hücreleri bir 96-iyi doku kültürü düz alt plaka tedavi, kuyu resuspend.
Not: Bir fare kemiklerinden 100 kuyuları için yeterince hücre üretir. İstenirse, hücre 1 mL 6-şey plaka (doku kültürü tedavi, düz alt) kaplama. Hücreler (1 x 106 hücreleri) daha çok sayıda Batı Leke analizleri için yararlı olabilir. - Yapisan bir kez yinelenen veya onaylatılacak Wells'le her 10 ng/mL IMDM, 30 mg/mL IVIG, veya IVIG + LPS LPS teşvik. LPS veya IVIG dozlarda yanıt optimize etmek için titre. Yinelenen veya onaylatılacak kuyu unstimulated denetimi olarak bırakın. Onları 24 saat (37 ° C, % 5 CO2) kuluçkaya.
Not: Yeniden kaplama hücre doku kültürü wells 1s içinde uygun olmalıdır. - Hücre supernatants her kuyudan bireysel 1.7 mL microcentrifuge tüpler içine toplamak ve Partiküler madde herhangi bir iplik 10.000 x g 5 min için de çıkarın.
- Hücre süpernatant kaldırmak ve Pelet rahatsız edici kaçının. Açıklanan bir steril microcentrifuge tüp süpernatant yerleştirin.
Not: Cep supernatants sitokinler, IL-10 ve sitokin alt birimi, IL-12/23 p 40, enzim bağlı immunosorbent assay tarafından (ELISA) hemen denetlesinler, veya-80 ° C uzun vadeli saklı. ELISA Protokolü piyasada bulunan Seti'nden (Tablo reçetesi) izleyin. Diğer pro-inflamatuar sitokinlerin, Il-6 ve TNF, gibi denetlesinler gibi onlar da IVIG ile ortak tedavi tarafından azaltılır + LPS stimülasyon ile karşılaştırıldığında stimülasyon ile LPS yalnız. Stimülasyon sonra yapışık hücreleri western Blot veya nicel Polimeraz zincir reaksiyonu (Q-PCR) 19,20gibi teknikleri için hazırlanabilir.
2. fare Vivo içinde IVIG ile zorlu ve Periton makrofajlar hasat
- Her fare tartın.
Not: Örneğin, bir 20 g fare için IVIG 500 µL gereklidir.
Not: steril bir mahallede yordamı gerçekleştirin.
Not: organları içine, ama yerine, Periton uzaya PBS enjekte değil iğne dikkatle fare yerleştirin.
Not: sıvı enjekte her 5 mL için yaklaşık 3.75 mL elde edilebilir.
Not: son enjeksiyon sonra sıvı nerede sıvı birikmiş fare kadar sol ve sağ taraftan ayıklamak daha kolay olabilir. Organları bu konumda iğne ile daha az girişim neden olur.
Not: Makrofajlar daha diğer Periton hücre biraz daha büyük olacaktır. 5 x 105 - 1 x 106 makrofajlar/fare vahşi türü C57BL/6 fare kullanma tipik verimidir.
İsteğe bağlı: kırmızı kan hücreleri, çok sayıda hücre Pelet varsa, bunları, 1 x kırmızı kan hücre lizis tampon üreticinin yönergelerine uygun kullanarak kaldırmak için lizis adımı gerçekleştirin.
Not: Bu havuzu için gerekli olabilir ineklemek kullanıyorsanız bir deney için birden fazla fare hücrelerden kuyu veya titrating uyarıcı. Örneğin, tek bir fare 5 x 105 makrofajlar olsaydı, kaplama orta 500 μL gerekli olacaktır. 5 kuyu veya yinelenen bir LPS doz ile 1 deneyde için yeterince hücre olur.
Not: stimülasyon sonra yapışık hücreleri gibi Batı leke veya PCR teknikleri için hazırlanabilir.
3. fareler içinde Vivo IVIG + LPS ve Periton makrofajlar hasat ile zorlu
- Her fare tartın. Son doz 2,5 g/kg vücut ağırlığı sağlamak için gerekli IVIG (100 mg/mL hisse senedi toplama) hacmi hesaplamak. LPS (IMDM 100 μg/mL hisse senedi toplama) 0.2 μg/g vücut ağırlığı son bir doz sağlamak için gereken miktarını hesaplamak.
Not: Örneğin, bir 20 g fare için 500 µL IVIG hisse senedi çözüm ve LPS, 100 μg/mL solüsyon 40 μL gereklidir. - IVIG gerekli miktarı çekmek ve LPS steril 26 ile donatılmış bir steril 1 mL şırınga içine iğne ölçmek. IVIG almazsınız kontrol fareler için IVIG eşdeğer hacmi steril PBS pH 7.4 ile değiştirin.
- Scruff fare derisi başparmağınız ve işaret parmağı ile boyun arkasında kapma ve onun kuyruk ve kalan parmaklarınızla arka ayakları tutan tek elle. Yere doğru onun beden eğ.
- İğne fare karın, alt sağ bölümündeki göre 30-40 ° açıyla, eğim ve eklemek 1,5 cm. ekleme IVIG + LPS, ya da PBS + LPS, intraperitoneally 2.4 adım'olarak yer.
- 1 saat sonra adımları 2.5-2,10 gerçekleştirerek Periton makrofajlar hasat.
- Hücreleri aşağı 300 x g 4 ° C'de 5 min için de spin 1 mL kurtarılan lavaj sıvı kaldırmak ve IL-10 ve ELISA tarafından IL-12/23 p 40 analizleri için üreticinin talimatlarına uyarak kullanmak veya gelecekteki analizleri için-80 ° C'de dondurmak.
Not: lavaj sıvı sitokin analiz için Tedaviler arasında doğru karşılaştırma sağlamak için 5 mL flushs Periton boşluğu ve 4 kez 15 mL son bir hacim için gerçekleştirin. Tüm sıvı her floş elde edilebilir. - Adım 2,11, olduğu gibi resuspend ve uygun makrofajlar saymak.
Not: Makrofajlar daha diğer Periton hücre biraz daha büyük olacaktır.
İsteğe bağlı: kırmızı kan hücreleri, çok sayıda hücre Pelet varsa, bunları, adım 2.11 olduğu gibi kaldırmak için üreticinin yönergelerine uygun lizis adımı gerçekleştirin.
Not: Bir deney için birden fazla fare havuzu hücrelere gerekli olabilir. Örneğin, tek bir fare 5 x 105 makrofajlar olsaydı, kaplama orta 500 μL gerekli olacaktır.
Not: Örnekleri hemen kullanılabilir veya dondurulmuş ve sitokin analiz için-80 ° C'de ELISA tarafından saklanır.
Not: Hücreleri adımları 1.16-1.17 ve 2.14 olduğu gibi Batı leke veya PCR, gibi teknikleri için hazır olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare kemik iliği türetilmiş makrofajlar hematopoietik hücre kemik iliği boğulmadan Kara filmin tarih öncesi gelen kültürlü. Kalça ve yırtılmalarıteşhis bir C57BL/6 fare genellikle havuza alınmış kemik iliği örnekleri 107 kemik iliği türetilmiş makrofajlar onları makrofajlar deneyleri için uygun bir kaynak yapma, verim. BMDMs ne zaman ile inflamatuar uyarıcı vitromeydan dayalı antikor uyuşturucu yanıt test etmek için kullanılabilir. Şekil 1 gösterir o IVIG marka Gammunex (GX) + LPS anti-inflamatuar sitokin üretimini artırır IL-10, 7-fold için LPS stimülasyon tek başına (şekil 1A) karşılaştırıldığında ve IL-12/23 p 40 (Resim 1 üretim azalır B). Şekil 1 de farklı IVIG ürünleri farklı gerçekleştirmek gösterilmiştir. IVIG üç farklı hazırlıkları IL-12/23 p 40 önemli ölçüde (şekil 1B), Octagam (OG) ve Gammagard azaltmak mümkün olmakla birlikte sıvı (GL), önemli ölçüde artış beklemiyoruz IL-10 üretim LPS (şekil 1 yanıt A). OG ve GL IL-12/23 p 40 üretim yanıt LPS ama daha az bir ölçüde daha GX önemli ölçüde azaltabilirsiniz. Bu sonuçlar antikor etkiler kemik iliği makrofaj harekete geçirmek türetilen ve değişiklikleri yanıtlarında neden olabilir aynı uyuşturucu hazırlıkları arasında farklar vardır göstermektedir.
BMDMs western Blot tarafından IVIG, mekanik etkilerini sınamak için kullanılabilir. Aktif IC + LPS ile makrofajlar mitojenle aktive protein (harita) kinaz p38 ve Erk1/2, artan IL-10 üretim21için sorumlu olan fosforilasyon artmıştır. Şekil 2 sonuçlarında harita kinaz harekete geçirmek unstimulated veya LPS, IVIG, veya IVIG + LPS ile uyarılan olmuştur makrofajlar tarafından IL-10 üretimi için gerekli algılamak için tipik bir Batı leke göster. IVIG stimülasyon tek başına ya da IVIG + LPS co stimülasyon arttı harita kinaz aktivasyonu önceki ve uzun süreli fosforilasyon LPS ile yalnız gördüğüm için karşılaştırmak ile Erk1/2. Daha önce yer alan makrofajlar IVIG + bu uyarılmış LPS ile karşılaştırıldığında LPS ile uyarılan p38 aktivasyonu oluştu. Bu sonuçlar western Blot gibi yöntemler, hücre BMDMs antikor ilaçların etkileri sinyal göstermek için kullanılabileceğini göstermektedir. Sitokin üretim ek olarak, harita kinaz harekete geçirmek anti-inflamatuar makrofaj harekete geçirmek oluştuğunu göstermek için kullanılabilir.
Olgun, doku ikamet makrofajlar da fare yanıt IVIG 5.0 x 105 için değerlendirmek için yalıtılmış olabilir - 1.0 x 106 Periton makrofajlar bir sağlıklı C57BL/6 fare ayrılmış olabilir. Şekil 3' te, Periton makrofajlar IVIG ile enjekte fareler gelen stimülasyon vitroenjekte PBS fareler için karşılaştırıldığında, yokluğunda IL-10 üretimi önemli ölçüde artırmayın. IVIG üzerinden Periton makrofajlar enjekte edildiğinde fare LPS ex vivoile uyarılan, 6-fold daha fazla IL-10'dan PBS ile enjekte fareler ürettikleri. Onlar ancak, tespit tutarları, IL-12/23 p LPS ex vivoile uyardığında 40 üretmek değil. Bu sonuçlar antikor etkileri üzerinde makrofajlar vivo içinde uyuşturucu enjekte etme ve bu yöntemle hücreler ex vivo kültür tarafından sınanabilir gösterilmektedir.
Makrofaj yanıt antikorlar ve inflamatuar uyaranlara biçilen içinde vivoolabilir. Sitokin üretim lavaj sıvı tespit edilebilir ve ex vivo supernatants Periton makrofajlar uyarılmış. Şekil 4 gösterir anti-inflamatuar sitokin IL-10 artırılır lavaj sıvı (şekil 4A), Periton hücreleri (şekil 4B) ve Periton makrofajlar (şekil 4C) ne zaman fare IVIG + karşılaştırıldığında için PBS + LPS LPS zorlanmaktadır. Üretim bir pro-inflamatuar sitokin alt birimi, IL-12 / 23p 40, önemli ölçüde kültürlü Periton makrofajlar ama lavaj sıvısı azalır. Bu yöntem bir antikor ilacın etkisi inflamatuar yanıt vivo içinde hem de ex vivoinceleme sağlar.
Resim 1 : Yanıt-e doğru farklı markalarla ortak uyarılması IVIG ve LPS makrofaj Il-10 ve IL-12 / 23p 40 üretimde. C57BL/6 MCSF kemik iliği türetilmiş makrofajlar ya unstimulated (C) olduğunu veya LPS ile uyarılmış (10 ng/mL), IVIG (30 mg/mL), ya da IVIG + LPS. IVIG üç farklı markalar test edildi: Gammunex (GX), Gammagard sıvı (GL) ve Octagam (OG). Makrofaj supernatants 24 saat sonra stimülasyon toplanmış ve Santrifüjü tarafından açıklığa kavuşturuldu. ELISAs IL-10(a)ve IL-12/23 p 40 (B) yapıldı. = N makrofajlar için veri olan hücrelerden ELISAs ile deneme başına 1 bireysel fare ile 3 bağımsız deneyler içinde yinelenen denetlesinler. Veri vardır anlamına gelir ± SD *P < 0,05, ** P < 0,001, ***P < 0,0001 LPS stimülasyon ve IVIG arasında karşılaştırma için + LPS co uyarım. Tek yönlü Varyans analizi (ANOVA) birden fazla karşılaştırmalar için Tukey'nın sonrası testi ile istatistiksel analizler için kullanılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Harita kinaz aktivasyonu IVIG aktif makrofajlar Western blot analizi. MCSF türetilmiş kemik iliği makrofajlar unstimulated veya LPS ile uyarılmış (10 ng/mL), GX IVIG (30 mg/mL), veya GX IVIG + LPS; 0, 10, 40 veya 120 dk. bütün hücre lysates (1.0 x 106 makrofajlar/yol) Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide için tabi tutuldu için Jel Elektroforez (SDS-sayfa) ve western Blot p38 fosfo özgü antikor ile ve ekstrasellüler sinyal düzenlenir kinaz (Erk1/2) yanı sıra gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH), yükleme denetimi olarak. Sonuçlar n temsilcisi olan deney başına 1 bireysel fare hücreleri ile 3 bağımsız deneyler =.GAPDH, 3 bağımsız deneylerden ortalama için normalleştirilmiş Dansitometresi pp38 ve pErk1/2 protein düzeyleri, altındaki her bandı gösterilir. Bu rakam Kozicky ve ark8değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : IL-10 üretim fareler IVIG içinde vivoile meydan gelen makrofajlar tarafından. 8-hafta-yaşlı C57BL/6 fareler steril PBS (enjeksiyon kontrol) veya GX IVIG (2.5 g/kg) intraperitoneally verildi. 1 h sonra fare euthanized ve Periton lavages gerçekleştirilmiştir. Periton makrofajlar bağlılık seçimini kullanarak izole edildi. Makrofajlar ya unstimulated (C) olduğunu veya LPS ile uyarılmış (10 ng/mL). Hücre supernatants hasat ve IL-10 ELISAs için 24 saat sonra açıklığa kavuşturuldu. Veri çoğu n = ELISAs ile 3 bağımsız deneyler yapılan grup başına 5 bireysel fareler içinde yinelenen denetlesinler. Veri vardır anlamına gelir ± SD * P < 0,01 ve NS = önemli değil. İstatistiksel analizler Two-way ANOVA Sidak'ın posttest ile birden fazla karşılaştırmalar için kullanma yapıldı. Bu rakam Kozicky ve ark8değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : IL-10 ve IL-12 / 23p 40 üretim meydan IVIG + LPS ile fareler içinde vivo. 8-hafta-yaşlı C57BL/6 fareler bir denetim olarak intraperitoneally PBS + LPS (0.2 µg/g vücut ağırlığı), ile enjekte edildi; veya GX IVIG (2.5 g/kg vücut ağırlığı) + LPS (0.2 µg/g vücut ağırlığı). 1 h sonra fare euthanized ve Periton lavages gerçekleştirilmiştir. (A)Clarified lavaj sıvı, (B) 1 h makrofaj bağlılık adımı sırasında Periton hücrelerden şartına supernatants açıklık ve (C) açıklık 24 h için denetlesinler Periton makrofaj (Mφ) supernatants IL-10 ve IL-12 / 23p 40 ELISA tarafından. Veri vardır anlamına gelir ± SD n 5 3 bağımsız deneyler, farelerde = ELISAs ile içinde yinelenen denetlesinler. P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 ve NS = önemli değil. Farelere enjekte PBS + LPS ile farelere enjekte IVIG + öğrenci'nin t testi kullanılarak LPS ile karşılaştırıldı. Bu rakam Kozicky ve ark8değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Makrofaj harekete geçirmek Birleşik her iki doku homeostazı ve hastalık22içinde önemli bir rol oynamaktadır. Makrofajlar bağlı olarak kendi microenvironment3ipuçlarını etkinleştirme Birleşik örtüşen yanı sıra farklı olabilir. İnflamatuar yanıt tüm aşamalarında farklı rollere sahip: savunma patojenlere karşı yara iyileşmesi ve doku restitüsyon ve da inflamatuar yanıt2 dönüm için önemli bir farklı anti-inflamatuar etkinleştirme durumları vardır . Anti-inflamatuar makrofaj etkinleştirme makrofajlar anti-inflamatuar sitokin, IL-10 ve IL-1223gibi pro-inflamatuar sitokinlerin düşük miktarda yüksek miktarlarda üretmek için iki dış çekim gücü gerektirir. Fc gama reseptörleri hareket antikorlar bir sinyal geliyor ve ikinci sinyal LPS veya IFNγ gibi pro-inflamatuar bir uyarıcı olduğunu24,25. Serum, immün kompleksler ve anti-TNFα antikorlar, tüm yüksek IL-10-produing anti-inflamatuar harekete geçirmek durumda makrofajlar8,23,25,26teşvik bulundu. Bizim grup daha önce fare kemik iliği makrofajlar türetilen ve Periton makrofajlar IVIG ile uyarılan da IL-10 ve küçük hiçbir pro-inflamatuar IL-12/23 p 40 LPS8yanıt olarak yüksek miktarlarda üretmek yayınladı. Biz de diğer pro-inflamatuar sitokinlerin, TNF ve Il-6 Ayrıca kemik iliği türetilmiş makrofajlar8' IVIG tarafından azaltılır bulduk. Yöntem tanımlamak burada diğer dayalı antikor uyuşturucu yanıt fare BMDMs ve Periton makrofajlar içinde in vitro ve in vivosınamak için uygulanabilir.
Antikor tabanlı therapeutics fare kemik iliği ve Periton makrofajlar test birçok kritik adımlar vardır. Kısırlık koruyarak her protokol için önemlidir. Makrofaj kültürler mikroorganizmaların hava, kürk veya fare dışkısı ile kontamine Eğer makrofajlar pro-inflamatuar sitokinlerin üreterek bu uyaranlara cevap verecektir. Tüm deneylerin bir biyogüvenlik kabini gerçekleştirme, fare liberal etanol ile püskürtme ve bağırsak bütünlüğünü sağlama sırasında Periton basması gereklidir. Antikor Ayrıca steril ve üreticinin yönerge göre saklı tutulması gerekir. Kirlenmiş, süresi dolmuş veya bulanık ise kullanılamaz. Bulanıklık ilacın etkinliğini azaltmak ve ilaç uygun sıcaklıkta depolanmaz veya çok uzun süre saklı oluşabilir. IVIG 4 ° C'de depolanan ve IL-10 üretim seviyeleri etkilenen bu yana geçerlilik tarihi dolmadan önce sadece kullanılır. Alternatif olarak, bu yanıt üzerinde hiçbir etkisi ile-20 ° C'de donmuş olabilir gördük. IVIG marka hazırlıklar, şekil 1, olduğu gibi farklı türleri farklı tepkiler makrofajlar neden olabilir, ancak farklı çok sayıda IVIG benzer deneysel sonuçlara neden. Temel kontrol eder, unstimulated gibi hücreleri ve ile antikor yalnız, uyarılmış hücreleri gerekir dahil her denemede makrofajlar veya ilaç kirlenme kural.
Birçok değişikliği bir deney özelleştirmek için bu iletişim kuralları için yapılabilir. İltihaplı olmayan durumda büyük deneyler için yeterli Periton makrofajlar yalıtmak zor olabilir. Periton makrofajlar thioglycollate (TG) mayi enjeksiyonu ile elde edildi. Bir bağışıklık yanıtı oluşur ve 4 gün sonra hasat27Periton makrofajlar elde edildi olabilir. İşe makrofajlar daha az olgun olabilir ve biz burada, hangi önemli konulardır kullanılmış gibi yerleşik hücre temsil etmemektedir. TG elde edildi makrofajlar agar üzerinden bir komplikasyon özellikle fagositoz27üzerinde deneyler yapıyor olabilir TG suyu da içselleştirilmiş var. Fare farklı alanlardan genetik, C57BL/6 veya BALB/c, deneyler için de kullanılabilir ve belirli bir genetik arka plan gerektiren hastalık modellerinde değerlendirilecektir makrofaj yanıt antikorlar etkisini incelemek için seçmiş olabilirsiniz. Buna ek olarak, kendi iş8' de yaptığımız gibi Il10- / - fareler gibi genetik fareler bir ilacın etki mekanizması içinde belirli proteinlerin işlevini değerlendirmek için kullanılabilir. Farklı inflamatuar uyaranlara antikorlar makrofaj etkinleştirme üzerinde etkisini değerlendirmek için de kullanılabilir. IFNγ ve elde edilen ana otoyol gibi (TLR) reseptör agonistleri (örneğin hyaluronik asit), makrofajlar25,28IL 10 üreten etkinleştirmek için kullanılır. Antikor doz önemli bir noktadır. Antikorlar yanı sıra tedarikçiler arasında değişir gibi doz kültür ve hayvan deneyleri, en uygun doz elde etmek için titre. Seçilen doz da insanlara verilen doz yansıtmalıdır ve ilaçlar arasında değişir. IVIG bu protokolleri29,30' u kullanılan titrated dozlarda yansıtan bir anti-inflamatuar tedavi yüksek dozda (25-35 mg/mL ya da 2 g/kg vücut ağırlığı) olarak verilir.
Kemik iliği ve Periton makrofajlar sınırlamalar bulunmaktadır. Bir gelişme de makrofaj hücre hatları üzerinden, fare BMDMs hala yapay olarak türetilmiş hücreleri hematopoetik hareketlenme öncesi ilk belirtiler vardır. Bağışıklık yanıtları makrofajlar vitro test anlayış antikor yanıt için önemli bir adımdır, ama içinde vivo deneyler de gerçekleştirilmesi gerekir. Hücreleri ex vivokültür tarafından takip uyaranlara vivo enjekte, antikor bazlı ilaçlara da bir hastalık durumda anti-inflamatuar makrofajlar etkinleştirebilirsiniz olup olmadığını araştırmak gelecekteki çalışmaları için daha fazla bilgi sağlayabilir. Antikor tabanlı destekte alacak insanlar ne olacağı üzerinde sonuçlar Bu deneylerden çekilemez. Kaç çalışmalar elde edilen insan monosit makrofaj içinde vitroIVIG etkilerini değerlendirmek için yayınlanmıştır. Il-6 insan monosit vitro üreten sayıda bir azalma bildirilmiştir, ne zaman IVIG stimülasyon LPS yalnız12ile karşılaştırıldığında LPS ile birlikte uyarılır. IVIG TNFα azaltır ve31THP-1 insan Monositik prokalsitonin (PCT) ile uyardığında Il-6 üretim hücreleri.
Bu kağıt protokolleri mevcut yöntemler üstünlükleri vardır. Kemik iliği makrofajlar türetilen ve Periton makrofajlar birincil fare doğrudan, izole, hücrelerdir yerine varlık hücre hatları ölümsüzleştirdi.RAW264.7 hücreleri gibi fare makrofaj gibi hücre hatları pro-inflamatuar sitokin üretmek değil IL-12, LPS, hangi yapılır IVIG8,13yanıt olarak üretilen IL-10 tarafından düzenlenen önemli bir sitokin. LPS ile uyuşturucu vivo içinde test ilaç etkisi lavaj sıvı, Periton hücrelerin ve özellikle, Periton makrofajlar yerel Periton çevre analizi ile incelenmesi izin verir. Bu bir kısa vadeli, makrofaj etkinleştirme hastalığı hayvan modellerinde daha uzun ve daha pahalı antikorlar belirsiz etkileri incelenmesi haklı göstermek için önemli bilgiler sağlayan basit modeli var. Deneysel ölçü kez sadece fare hayatta kalma ya da serum14sitokinler nerede endotoksemi modelleri üzerinde bir avantaj have. Sağkalım oranları ve serum sitokinler bağışıklık yanıtının değerli önlemleri vardır ama onlar katkı makrofajlar özellikle olabilir görünmüyor. İzole edip bir meydan okuma deneme Periton makrofajlar kültür antikor therapeutics makrofaj işlev üzerinde olabilir doğrudan ve ölçülebilir bir etkisi gösterir.
Bu yöntemler test ve biyolojik tedaviler tasarımı için uygulamalar vardır. Tedavi olarak antikor kullanımı son yıllarda önemli ölçüde artmıştır. Ancak, bu tedaviler antikor Fc kısmını tanıyıp sitokin üretim değiştirmek makrofajlar ek bilinmeyen etkileri olabilir. Anti-TNFα antikor, infliksimab, IL-10 neden ve T hücre çoğalması, Fc kısmı üzerinden bastırmak için gösterilmiştir ve bu bir eylem7,15,26, mekanizmaları olarak önerilmiştir. Genetik modellerini kullanarak, bu ilaçların makrofaj harekete geçirmek nasıl etkiliyor bir mekanizma spesifik proteinlerin karıştığı. IgG antikorlar ve hazırlıklar antikorların sınıflarını makrofajlar tarafından destekte nasıl etkileneceği değiştirmek için değiştirilebilir. Veriler hazırlık gösteriyor ve/veya aynı antikor uyuşturucu (IVIG) depolanmasını makrofaj harekete geçirmek üzerindeki etkileri etkileyebilir. Bu kağıt içinde yöntemleri burada anti-inflamatuar makrofajlar tümör ilerleme teşvik immunosurveillance kanser tedavileri sırasında korumak için kritik olabilir bu etkileri var mı terapiler tasarlamak için kullanılabilir. Bu teknikler tasarlamak ve eğer arzu edilen bu etkileri var uyuşturucu değerlendirmek için de kullanılabilir. Örneğin, makrofaj inflamatuar yanıt-e doğru azaltmak ve anti-inflamatuar IL 10 üreten makrofajlar iltihabi bağırsak hastalıkları veya romatoid artrit için tedavi geliştirmek için oluşturmak yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
L.K. British Columbia Üniversitesi 4 yıllık arkadaş grubu (4YF) lisansüstü öğrencilik Ödülü alıcı olduğunu. L.M.S. olduğunu Kanadalı bir Gastroenteroloji Derneği alıcı / Crohn ve kolit Kanada / CIHR yeni araştırmacı maaş Ödülü ve biyomedikal bilim adamı Michael Smith Vakfı Sağlık Araştırma için. Bu eser Kanada Enstitüleri Sağlık (# CIHR2016-LS vermek) araştırma ile işbirliği içinde Kanada kan Hizmetleri, bir proje hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
- Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
- Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
- Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
- Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).
- Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
- Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
- Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
- Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
- Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
- Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
- Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
- Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
- Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
- Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
- Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
- Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).
