Summary
Препараты на основе антител революционизировал лечения воспалительных заболеваний. Помимо непосредственного воздействия на конкретные цели, антитела могут активировать макрофаги стать противовоспалительное. Этот протокол описывает как противовоспалительное макрофагов активации может быть начисленных в пробирке, с помощью мыши костного макрофагов и в естественных условиях, используя перитонеальных макрофагов.
Abstract
Макрофаги являются фагоцитирующих врожденные иммунные клетки, которые инициируют иммунных реакций к патогенам и содействовать реституции исцеления и ткани. Макрофаги одинаково важны в отключение воспалительных реакций. Мы показали, что макрофаги стимулируется с внутривенного иммуноглобулина (IVIg) может производить большое количество противовоспалительных цитокинов, интерлейкин-10 (IL-10) и низкий уровень провоспалительных цитокинов в ответ (бактериальных липополисахаридов LPS). IVIg является поливалентная антитела, главным образом иммуноглобулина Gs (IgGs), пул из плазмы крови доноров, более чем 1000. Он используется для дополнения антител у больных с нарушениями иммунной или для подавления иммунной реакции у больных аутоиммунным или воспалительные условий. Также было показано, что инфликсимаб, терапевтические противоопухолевый некроза фактор альфа (TNFα) антител, активация макрофагов для производства Ил-10 в ответ на раздражители, воспалительные. IVIg и другие биопрепаратов на основе антител может испытываться для определения их воздействия на активацию макрофага. Этот документ описывает методы деривации, стимуляции и оценки мышиных костного Макрофаги активируются антител в пробирке и мышиных перитонеальных макрофагов, активированный с антител в естественных условиях. Наконец мы продемонстрировать использование Западный blotting для определения вклада конкретных ячеек, сигнальные пути противовоспалительные макрофагов деятельности. Эти протоколы могут использоваться с мышами, генетически модифицированных, для определения влияния конкретных белки на противовоспалительные макрофагов активации. Эти методы могут также использоваться для оценки ли конкретные биопрепаратов может действовать, изменив макрофагами IL-10-производство противовоспалительных активации государству, которое снижает воспалительные реакции в естественных условиях. Это может предоставить информацию о роли активации макрофагов в эффективность биопрепаратов во время болезни модели мышей и обеспечить понимание потенциальный новый механизм действий в людей. Наоборот это может предостеречь против использования конкретных биопрепаратов на основе антител для лечения инфекционных заболеваний, особенно если макрофаги играют важную роль в принимающей обороны против этой инфекции.
Introduction
Макрофаги являются врожденные иммунные клетки, которые играют многогранную роль в иммунной реакции на инфекции или травмы. Макрофаги являются ответственность за инициирование иммунного ответа на инфекцию или ткани ущерб, остановить воспалительный процесс и содействие исцеления ответ1. Примерами трех лучших изученных макрофагов активации государств являются: 1) макрофагов, относились с гамма-интерферона (IFNγ) и бактериальных липополисахарида (LPS), Места для М (IFNγ + ПЛАСТИНКИ), которые способствуют воспалительный процесс; 2) стимулируется с интерлейкинов 4 (Ил-4), M(IL-4), макрофаги, связанные с исцеления ответ; 3) макрофаги стимулируется с иммунных комплексов (ИК) и ЛПС, M (IC + ПЛАСТИНКИ), которые имеют возможность отключения воспалительной реакции2,3. M (IC + LPS) отличаются от M(IL-4) заживления макрофагов и не выразить фермента arginase (Arg-1) или FIZZ14. Лучшие маркер для этих противовоспалительные макрофагов является их производство цитокинов5. Макрофаги иметь несколько ролей в поддержании здоровья, но также способствовать воспалительных заболеваний и рака3. Из-за этого макрофаги являются ключевых терапевтических мишенью для лечения широкого спектра заболеваний. Важно исследовать эффекты антител на их состояние активации развивать Макрофаг основе лечения болезни.
Этот документ посвящен использованию мышиных костного мозга, полученных макрофагов (BMDMs) и перитонеальные макрофаги проверить влияние наркотиков антител на воспалительные реакции в пробирке и в естественных условиях. Недавно было несколько исследований, показывающих эффекты антител на макрофагов активации6,,78. Макрофаги, совместно активированный с иммунных комплексов, которые являются антитела complexed антигена, и LPS, обычно воспалительных стимул, производят очень высокий уровень противовоспалительных цитокинов, Ил-10 и очень низкий уровень провоспалительных цитокинов, интерлейкина 12 (IL-12)9. Кроме того, инфликсимаб, моноклональные антитела против TNFα было установлено на работу, в части, побуждая противовоспалительные макрофаги через кристаллизующихся региона (Fc) его фрагмент7. Мы уже сообщали, что IVIg + LPS побудить противовоспалительные макрофагов активации, которая похожа на М (IC + ПЛАСТИНОК), которой совместно стимулировать макрофаги производят большое количество Ил-10 и низкое количество провоспалительных цитокинов Субблок интерлейкина 12 или 23 p40 ( IL-12/23p40), интерлейкина-6 (IL-6) и ФНО8. IVIg – это препарат, состоящий из поликлональных антител, главным образом IgG, который были объединены из крови более чем 1000 доноров10. Он используется для лечения широкий спектр иммунологических заболеваний, таких как идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и хронический демиелинизирующий полинейропатия, однако механизм его действия является не полностью понял11. Влияние препаратов на основе антител на активацию макрофага можно оценить с помощью методов, описанных здесь.
Влияние конкретных биопрепаратов на активацию макрофага можно протестировать в BMDMs и перитонеальных макрофагов. Использование этих источников макрофагов позволяет оценки начальной клеток. Предварительного тестирования антител на культивируемых клеток первичного требует меньше времени и денежных инвестиций, чем другие модели трудоемким и дорогим болезни. Инъекционных наркотиков в здоровой мыши в естественных условияхи изоляция клетки и анализируя их ex vivo, можно определить, если исследования необходимы для оценки ли лечение с biologics влияет активация макрофагов в модели заболеванием.
С несколько исследований, непосредственно тестирование влияния биологических методов лечения на активации макрофагов в пробирке и в естественных условиях наши методы обеспечивают преимущество над альтернативные методы. Современные методы включают тестирования биологических наркотиков эффекты на смешанных клеток населения в пробирке, например эффект инфликсимаба в смешанных лимфоцитов реакции (MLR) или IVIg на человека макрофагов в мононуклеарных клеток периферической крови, где эффект нельзя отнести к определенной ячейке тип7,12. С помощью BMDMs и перитонеальные макрофаги выгодно над использованием клеточных линий, таких как RAW264.7 клетки, которые не производят провоспалительных цитокинов, Ил-12, в ответ на LPS8,13. Влияние препарата на основе антител на макрофагов ответов ex vivo тестирование имеет преимущества, потому что цитокина ответы можно отнести непосредственно макрофагов, вместо того, чтобы выведение ответы макрофагов, измеряя уровни цитокина сыворотки14 . BMDMs и перитонеальных макрофагов могут быть получены и изолированы от генетически модифицированных мышей, чтобы определить конкретную роль белка в активации противовоспалительные макрофагов. Например, мы использовали Il10 несовершенным(- / -) BMDMs продемонстрировать, что ВВИГ индуцированной снижение производства провоспалительных цитокинов частично зависит от Ил-108. Механизм действия препарата могут быть исследованы с помощью Западный blotting, где роль специфических белков и сигнализации событий может быть определена. Количественные полимеразной цепной реакции (ПЦР) могут выполняться на BMDMs или перитонеальных макрофагов, чтобы показать закономерности экспрессии генов в результате активации антитела. Заболевание модели мышей может предоставить информацию о потенциальной эффективности на основе антител биологической терапии в модели для таких болезней как воспалительных кишечника болезнь, ревматоидный артрит и рака15,16, 17. Однако, описанные здесь методы представит информацию о механизме действия этих биопрепаратов путем определения ли они побудить противовоспалительные макрофагов деятельность.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Университета Британской Колумбии.
1. костного макрофагов дифференцирование и активация с антителами
- Выполните эвтаназии, используя CO2 удушья.
- Место мыши в камере индукции. Усыпить мышь с 5% изофлюрановая анестезии, для 60-90 сек, до тех пор, пока немобильные и дышать глубоко и медленно.
- Выключить изофлюрановая анестезии и управлять 6-8 Л/мин CO2 , пока мышь перестала дышать. Оставьте мышь с CO2 на по крайней мере еще 5 минут проверить что это больше не сердцебиение или дыхания. Выполните шейки матки дислокации для обеспечения смерти.
Примечание: 8-12 недель старых мышей обеспечивают наибольшую доходность макрофагов.
- Спрей мыши ноги с 70% этиловом спирте и закрепите их с руки и ноги протянул в лежачем положении на доску пены. С ножницами и щипцы для кожи сделать мелкий разрез (0,2 см) для удаления кожи и меха от поверхности каждого из задних ног.
Примечание: Выполните эту процедуру и все культуры тканей манипуляции в стерильных Худ. - Трим мышцы, чтобы сделать видимыми tibias и бедра. Удаление tibias и бедра, путем разрезания костей и мышц, чуть ниже тазобедренного сустава и выше лодыжки. Обрежьте как можно столько мышц.
- Спрей кости с 70% этанола и подождите 1 мин для того, чтобы испарился, а затем поместить их в 6 хорошо пластину заподлицо среды кость (Iscove модифицированный Дульбекко средний (IMDM), 10% плода бычьим сывороточным (ФБС)).
- Обрежьте концы костей, резки 0,1 см кости лодыжки и верхней части бедра, так что подвергается полость кости. Убедитесь, что костный мозг является видимым и 26 иглы могут быть помещены в полость кости.
- Вырежьте кости и мышцы, чтобы отделить tibias и бедра от коленных суставов. Вставьте 26 иглы, придает шприц 10 мл в полость. Промойте костного мозга в 50 мл Конические трубки с 5 мл кости заподлицо среднего. Потопить два tibias и два бедра, от одной мыши, в каждую пробирку 50 мл.
- Пипетка вверх и вниз несколько раз или вихревого костного мозга на медленной скорости разойтись нежно сгустки. Строки костного мозга должны быть разбиты на небольшие (менее 0,5 мм) пятнышки костного мозга. Заполните Конические трубки 50 мл с костью заподлицо средних. Пипеткой содержимое конические пробки в культуру ткани2 75 см лечение колбу и инкубировать при 37 ° C, 5% CO2 на 1 ч.
Примечание: Зрелые макрофаги и мезенхимальных клеток станет приверженцем колбу и отменены, в то время как желаемого гемопоэтических прародителями оставаться во взвешенном состоянии. - Пипетка в среду с гемопоэтических прародителями в 50 мл Конические трубки. Центрифуга трубки на 300 x g при комнатной температуре в течение 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 5 мл макрофагальный колонии стимулирующий фактор (MCSF) культуры среднего (IMDM, 10% FBS, 5 нг/мл MCSF, 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина и 150 мкм monothioglycerol (MTG)).
- Подсчет количества ячеек с помощью Горяева18. Добавьте средне Ресуспензируйте клетки к концентрации 0,5 х 106 клеток/мл, 1,5 х 107 клеток/флакон 30 мл среды и аккуратно Пипетка вверх и вниз. Пипетка 30 мл суспензии в новой колбу культуры ткани лечение2 75 см.
- День 4 и 7 день после первоначальной культуры в шаге 1.9 убедитесь, что клетки являются приверженцем и слегка разветвленной с помощью микроскопа светлые области контраст Перевернутый фазы. Выбросите носитель, содержащий ячейки non сторонник. Вымыть клетки с IMDM один раз и добавить 30 мл MCSF питательной среды.
- Когда клетки зрелых на 10 день (> 95% положительных F4/80 и Mac-1), снова убедитесь, что клетки являются приверженцем и слегка.
- Пластина клетки для стимуляции, вынуть колбу питательной среды и добавить 8 мл фермента бесплатно, на основе ЭДТА клеток диссоциации буфера (Таблица материалов). Инкубируйте клетки для 5 минут при 37 ° C, 5% CO2.
- Скрип клетки мягко, с небольшим количеством давления, с помощью стерильных ячейки скребок. Проверьте в Микроскоп, что клетки отсоединяется от поверхности колбы. Пипетка диссоциированных клетки в 50 мл Конические трубки. Промойте колба 3 раза с 5 мл IMDM и бассейн полоскания раствор с клетки, которые были собраны. Центрифуга клетки на 300 x g при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 3 мл MCSF питательной среды на 50 мл Конические трубки. Количество жизнеспособных клеток с помощью Горяева18. Ресуспензируйте клетки в концентрации 1 х 106 клеток/мл и пластины 100 мкл суспензии клеток (1 х 105 клеток/хорошо) за хорошо культуры ткани 96-луночных лечить, Пологое дно плиты.
Примечание: Кости из одной мыши будет генерировать достаточно клетки для 100 скважин. При желании, 1 мл клеток может покрытием в 6-ну пластине (Культура ткани обработанных, плоские внизу). Большее количество клеток (1 х 106 клеток) может быть полезным для анализа западную помарку. - После сторонником, стимулировать двойные или тройные скважин каждый с 10 нг/мл LPS в IMDM, 30 мг/мл IVIg, или IVIg + ПЛАСТИНОК. Для оптимизации реакции можно титруют дозы ПЛАСТИНОК или IVIg. Оставьте двойные или тройные скважин как кератоз элементы управления. Инкубируйте 24 h (37 ° C, 5% CO2).
Примечание: Повторно покрытием клетки должны придерживаться культуры ткани скважин в течение 1 ч. - Собирать supernatants клетки от каждой скважины в отдельных 1,7 мл microcentrifuge трубы и удалите любые твердые частицы, спиннинг на 10000 x g за 5 мин.
- Удалить ячейку супернатанта и не мешать гранулы. Место осветленный ячейки супернатант в стерильных microcentrifuge трубку.
Примечание: Supernatants клетки может быть assayed для цитокинов ИЛ-10 и цитокина Субблок, Ил-12 / 23p 40, на энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA) немедленно или храниться в долгосрочной перспективе-80 ° C. Следуйте ELISA протокол из коммерчески доступных kit (Таблица материалов). Другие провоспалительных цитокинов может быть assayed, как ИЛ-6 и ФНО, как они также сокращен на совместное обращение с ВВИГ + LPS стимуляции по сравнению с стимуляции с LPS только. После стимуляции адэрентных клеток могут быть подготовлены для методов, таких как Западный blotting или количественных полимеразной цепной реакции (Q-ПЦР) 19,20.
2. сложные мышей в Vivo с ВИГ и уборки перитонеальные макрофаги
- Вес каждой мыши.
Примечание: например, мышь, 20 g, 500 мкл ВВИГ не требуется.
Примечание: Выполните процедуру в стерильных Худ.
Примечание: Тщательно место иглы в мыши так, что вы не вводите PBS в органы, но, скорее, в перитонеального пространства.
Примечание: Для каждые 5 мл жидкости вводят примерно 3,75 мл будут восстановлены.
Примечание: После окончательного инъекции, она может быть проще для извлечения жидкости из далеко левой и правой стороны мыши, где накоплен жидкости. Органов вызовет меньше помех с иглой в этой позиции.
Примечание: Макрофаги будет немного больше, чем другие брюшной полости клетки. Типичные урожайность-5 x 105 - 1 х 106 макрофагов/мыши с помощью мыши C57BL/6 дикого типа.
Необязательно: Если большое количество красных кровяных клеток в клетки Пелле, выполните шаг лизиса их удалить, используя буфер lysis красных клеток крови 1 x согласно инструкциям производителя.
Примечание: Это может быть необходимо бассейн тройные клетки от более чем одной мыши для эксперимента, если с помощью скважин или титрования стимуляторов. Например если один мышь 5 x 105 макрофагов, потребуется 500 мкл обшивка среднего. Там будет достаточно клеток для 5 скважин, или 1 эксперимент в двух экземплярах, с одной дозы ПЛАСТИНОК.
Примечание: После стимуляции, адэрентных клеток могут быть подготовлены для методов, таких как Западная помарка или ПЦР.
3. сложные мышей в Vivo с ВВИГ + ПЛАСТИНОК и уборки перитонеальные макрофаги
- Вес каждой мыши. Рассчитайте объем IVIg (100 мг/мл концентрация запасов) необходимо предоставить окончательный дозу 2,5 мкг/кг массы тела. Рассчитайте количество ПЛАСТИНОК (100 мкг/мл концентрация запасов в IMDM), необходимо предоставить окончательный дозе 0,2 мкг/г веса тела.
Примечание: например, для мыши 20 g 500 мкл IVIg Стоковый раствор и 40 мкл 100 мкг/мл раствора LPS требуется. - Привлечь необходимое количество IVIg и ЛПС в стерильный 1 мл шприц с стерильных 26 манометра. Для управления мышей, которые не получат IVIg замените стерильные PBS рН 7,4 эквивалентный объем IVIg.
- Загривок мыши с одной стороны, схватив ее кожи задней части шеи с большим и указательным пальцем и удерживая его хвост и задние ноги с помощью остальных пальцев. Наклоните его тело к земле.
- Место иглу под углом 30-40° по отношению к мыши живота, в нижнем правом квадранте, скос и вставить 1,5 см. Inject IVIg LPS, или PBS + LPS, внутрибрюшинно как в шаге 2.4.
- После 1h урожай перитонеальных макрофагов, выполнив шаги 2,5-2.10.
- Спиновые клетки вниз на 300 g x 5 мин при 4 ° C. Удаление 1 мл жидкости восстановленные промывание и использовать для Ил-10 и Ил-12 / 23p 40 анализа ELISA согласно инструкции производителя или заморозить при температуре-80 ° C для будущего анализа.
Примечание: Чтобы гарантировать точное сравнение между процедурами для анализа жидкости цитокина промывание, выполняют 5 мл flushs брюшной полости 4 раза окончательный объем 15 мл. Не все жидкости будут восстановлены с каждым заподлицо. - Как и шаг 2.11 Ресуспензируйте и считать жизнеспособным макрофагов.
Примечание: Макрофаги будет немного больше, чем другие брюшной полости клетки.
Необязательно: Если большое количество красных кровяных клеток в клетки Пелле, выполните шаг лизис согласно инструкциям производителя, чтобы удалить их, как в шаге 2.11.
Примечание: Это может быть необходимо для пула клеток от более чем одной мыши для эксперимента. Например если один мышь 5 x 105 макрофагов, потребуется 500 мкл обшивка среднего.
Примечание: Образцы могут использоваться немедленно или замороженных и температуре-80 ° C для анализа цитокинов, ELISA.
Примечание: Клетки могут быть подготовлены для таких методов, как Западная помарка или ПЦР, как и шаги 1.16-1,17 и 2.14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мышиных костного мозга, полученных макрофаги могут культивированный из гемопоэтических клеток предшественников в пунктаты костного мозга. Пунктаты костного пула от бедра и tibias одной C57BL/6 мыши обычно дают 107 костного мозга, полученных макрофаги, что делает их удобным источником макрофагов для экспериментов. BMDMs может использоваться для тестирования антител на основе наркотиков ответы, когда оспаривается с воспалительным стимул в пробирке. Рисунок 1 показывает что IVIg бренд, Gammunex (GX) + LPS увеличивает производство противовоспалительных цитокинов ИЛ-10, 7 раз по сравнению с ПЛАСТИНОК стимуляции самостоятельно (рис. 1А) и снижает производство Ил-12/23 p 40 (Рисунок 1 B). Рисунок 1 демонстрирует также, по-разному выполняют различные ВВИГ препаратов. Хотя три различных препаратов ВИГ способны уменьшить Ил-12 / 23p 40 значительно (рис. 1Б), Octagam (ОГ) и Gammagard жидкости (GL), не значительно увеличить производство Ил-10 в ответ на ПЛАСТИНКИ (рис. 1 A). ОГ и GL способны значительно сократить производство Ил-12/23 p 40 в ответ ПЛАСТИНОК, но в меньшей степени, чем GX. Эти результаты показывают, что антитела костного мозга влияет на производные активация макрофагов, и что есть различия между препараты же препарат, который может вызвать изменения в ответах.
BMDMs может использоваться для тестирования механистический эффекты IVIg, на Западный blotting. Макрофаги, активированный с IC + ПЛАСТИНОК возросли фосфорилирование киназы протеина (MAP) Митоген активирован, p38 и Erk1/2, которые отвечают за увеличение производства Ил-1021. Результаты на рисунке 2 показывают типичный западную помарку для выявления активации киназы карты необходимые для производства Ил-10, макрофаги, которые кератоз, или стимулировали с ПЛАСТИНОК, IVIg, или IVIg + ПЛАСТИНОК. IVIg стимуляции самостоятельно или IVIg + LPS совместно стимуляции увеличилась активации киназы карты, Erk1/2, с ранее и длительное фосфорилирование, по сравнению с видели с LPS только. Активация p38 произошло ранее в макрофагах, стимулируется с ВВИГ + LPS, по сравнению с теми стимулируется с LPS только. Эти результаты показывают, что методы, такие как Западный blotting, может использоваться для отображения ячейки сигнализации эффекты препаратов антител на BMDMs. В дополнение к производство цитокинов активации киназы карты может использоваться для показать, что противовоспалительное макрофагов активации произошла.
Зрелые, ткани-резидентов макрофаги также могут быть изолированы от мышей для оценки ответов на IVIg 5.0 x 105 - 1,0 x 106 перитонеальные макрофаги могут быть изолированы от одного здоровой мыши C57BL/6. На рисунке 3перитонеальных макрофагов от мышей, вводится с ВВИГ не значительно увеличить Ил-10 производство в отсутствие стимуляции в пробирке, по сравнению с PBS вводят мышей. Когда перитонеальных макрофагов с ВВИГ вводят мышей стимулируются с ПЛАСТИНОК ex vivo, они производят бриллиантов более Ил-10, чем мышей, вводится с PBS. Однако, они не, производят обнаруживаемых количествах Ил-12 / 23p 40 при стимуляции с ПЛАСТИНОК ex vivo. Эти результаты показывают, что антитела эффектов может быть проверена на макрофагов инъекционных наркотиков в естественных условиях и культивирования клеток ex vivo с помощью этого метода.
Макрофагов ответы на антитела и воспалительных стимулы могут быть начисленных в естественных условиях. Производство цитокинов может оцениваться в жидкость лаважа, а в supernatants от ex vivo стимулировали перитонеальных макрофагов. Рисунок 4 показывает противовоспалительных цитокинов ИЛ-10 увеличивается в жидкость лаважа (рис. 4A) и брюшной клеток (рис. 4B), перитонеальных макрофагов (рис. 4C) когда мышей сталкиваются с ВВИГ + LPS, по сравнению с PBS + ПЛАСТИНОК. Производство Субблок провоспалительных цитокинов, Ил-12 / 23p 40, значительно уменьшается в культивированный перитонеальных макрофагов, но не в жидкости промывания. Этот метод позволяет изучение воздействия наркотиков антитела на воспалительные реакции в естественных условиях , а также ex vivo.
Рисунок 1 : Макрофаг Ил-10 и Ил-12 / 23p 40 производство в ответ на стимуляцию совместно с различными брендами IVIg и LPS. C57Bl/6 MCSF костного мозга, полученных макрофаги были либо кератоз (C), или стимулировали с ПЛАСТИНОК (10 нг/мл), IVIg (30 мг/мл), или IVIg + ПЛАСТИНОК. Три различных марок IVIg были протестированы: Gammunex (GX), Gammagard жидкость (GL) и Octagam (ОГ). Макрофагов supernatants были собраны 24 ч после стимуляции и разъяснить центрифугированием. ELISAs для Ил-10 (A) и (B) Ил-12/23 p 40 были исполнены. Данные для макрофагов из n = 3 независимых экспериментов, с ячейками от 1 отдельных мыши на эксперимент, с ELISAs assayed в двух экземплярах. Данные являются средства ± SD. *P < 0,05, ** P < 0,001, ***P < 0.0001 для сравнения между LPS стимуляции и IVIg + LPS совместно стимуляции. Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с Тьюки после тестирования нескольких сопоставлений были использованы для статистического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Западный анализ помаркой активации киназы карты в ВВИГ активации макрофагов. MCSF производные костного макрофаги были кератоз или стимулировали с ПЛАСТИНОК (10 нг/мл), IVIg GX (30 мг/мл), или GX IVIg + LPS; для 0, 10, 40 или 120 мин весь lysates клетки (1,0 x 10-6 макрофагов/пер) были подвергнуты натрия Додециловый сульфат Полиакриламид-гель электрофореза (SDS-PAGE) и Западный blotting с фосфо специфические антитела для p38 и внеклеточного сигнал регулируемых киназы (Erk1/2), а также Глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (GAPDH), как элемент управления загрузки. Результаты показали, представитель n = 3 независимых экспериментов, с ячейками от 1 отдельных мыши на эксперимент.Денситометрия для РР38 и pErk1/2 белка уровнях, нормализуются к GAPDH, в среднем от 3 независимых экспериментов показано ниже каждой группы. Эта цифра была изменена Kozicky et al8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : IL-10 производство макрофагами от мышей с ВВИГ в vivo. 8-week-old мышей C57BL/6 были даны внутрибрюшинно стерильные PBS (впрыска управления) или GX IVIg (2,5 мкг/кг). Через 1 ч мышей были умерщвлены и перитонеальной смывах были выполнены. Перитонеальные макрофаги были изолированы с помощью соблюдение отбора. Макрофаги были либо кератоз (C), или стимулировали с ПЛАСТИНОК (10 нг/мл). Supernatants клетки были собраны и уточнены после 24 ч для Ил-10 ELISAs. Данные из n = 5 индивидуальных мышей для каждой группы, выполненных в 3 независимых экспериментах с ELISAs assayed в двух экземплярах. Данные являются средства ± SD. * P < 0,01 и NS = не значительные. Статистические анализы были проведены с использованием ANOVA двусторонний с posttest Sidak для нескольких сравнений. Эта цифра была изменена Kozicky et al8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Ил-10 и Ил-12 / 23p 40 производство от мышей с ВВИГ + LPS в vivo. 8-week-old мышей C57BL/6 вводили внутрибрюшинно с PBS + ПЛАСТИНОК (0,2 мкг/г веса тела), как элемент управления; или GX IVIg (2,5 мкг/кг массы тела) + ПЛАСТИНОК (0,2 мкг/г веса тела). Через 1 ч мышей были умерщвлены и перитонеальной смывах были выполнены. (A) поясняется жидкость лаважа, (B) уточнил кондиционером supernatants от брюшной клеток на этапе присоединения макрофагов 1 h, и (C) уточнил 24 h на дубликатах supernatants перитонеальных макрофагов (φM) Ил-10 и Ил-12 / 23p 40 по ELISA. Данные являются средства ± SD для n = 5 мышей в 3 независимых экспериментах с ELISAs assayed в двух экземплярах. P < 0,05, **P < 0.01, ***P < 0,001 и NS = не значительные. Мышей, вводится с PBS + ЛПС были по сравнению с мышей, вводится с ВВИГ + ПЛАСТИНОК с помощью теста t студента. Эта цифра была изменена Kozicky et al8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Макрофагов активации государства играют важную роль в обеих ткани гомеостаза и болезни22. Макрофаги могут иметь собственный, а также перекрытие активации государства, в зависимости от сигналов в их микроокружения3. Они имеют различные роли на всех стадиях воспалительного ответа: оборона против патогенов, РАН реституция исцеления и ткани, а также имеют собственный противовоспалительные активации государство, которое имеет важное значение для выключения воспалительной реакции2 . Противовоспалительное макрофагов активации требуется два внешних стимулов для макрофагов произвести высокое количество противовоспалительных цитокинов, Ил-10 и низкое количество провоспалительных цитокинов, таких как Ил-12-23. Один сигнал исходит от антител, действуя через Fc рецепторов гамма, и второй сигнал является про воспалительных стимулом, например ПЛАСТИНОК или IFNγ24,25. Сыворотка, иммунных комплексов и антител анти TNFα, все были найдены побудить высокое состояние противовоспалительные активации Ил-10-produing в макрофаги-8,-23,-25,-26. Наша группа ранее опубликовал что мышиных костного производные макрофагов и перитонеальные макрофаги стимулируется с IVIg также производят большое количество Ил-10 и мало, чтобы не про воспалительных Ил-12 / 23p 40 в ответ на LPS8. Мы также обнаружили, что другие провоспалительных цитокинов, ФНО и IL-6 также снижены IVIg костного мозга, полученных макрофаги8. Описанные здесь методы могут применяться для тестирования других ответов наркотиков на основе антител мыши BMDMs и перитонеальных макрофагов в пробирке и в естественных условиях.
Существует много важных шагов в тестировании на основе антител терапии на мыши костного мозга и перитонеальных макрофагов. Для каждого протокола важно сохранение стерильности. Если макрофагов культуры заражены с микроорганизмов из воздуха, меха или Кале мышей, макрофаги будет отвечать на эти раздражители, производя провоспалительных цитокинов. Выполняя все эксперименты в области биобезопасности кабинета, распыления мыши обильно с этанолом и обеспечение целостности кишки в брюшной полости сбрасывает. Антитело должны храниться также стерильных и хранимая согласно инструкции производителя. Нельзя использовать, если это загрязненных, истек или мутная. Мутность снизит эффективность препарата и может произойти, если препарат не сохраняется при соответствующей температуре или сохранена слишком долго. IVIg можно хранить при 4 ° C и используется только до даты истечения, поскольку объемы производства Ил-10 могут быть затронуты. Кроме того мы видели, что он может быть заморожены при-20 ° C с не влияет на ответы. Различные много IVIg привести к аналогичные экспериментальные результаты, в то время как различные типы ВВИГ препаратов марки, как показано на рисунке 1, может вызвать различные ответы в макрофагах. Основные элементы управления, такие как кератоз клетки и клетки, стимулируется с антителом самостоятельно, должны быть включены в каждом эксперименте исключает загрязнение макрофаги или препарат.
Эти протоколы могут внести несколько изменения для настройки эксперимента. В государстве, не воспаляется может быть сложно изолировать достаточно перитонеальных макрофагов для больших экспериментов. Перитонеальные макрофаги могут вызвал внутрибрюшинной инъекцией thioglycollate (ТГ). Иммунного ответа происходит, и после 4 дней, вызвал перитонеальные макрофаги могут быть заготавливаемым27. Набранных макрофаги могут быть менее зрелых и не представляют резидентов клетки, как мы использовали здесь, которые являются важными соображениями. TG-вызвал макрофаги могут также усвоили агар из бульона TG, которые могут быть осложнения, особенно если делать эксперименты на фагоцитоз27. Мышей от различных генетических стола, C57BL/6 или BALB/c, может также использоваться для экспериментов и могут быть выбраны для изучения воздействия антител на макрофагов ответы, которые будут оцениваться в моделях заболеваний, требующих конкретных генетический фон. Кроме того генетически измененных мышей, например Il10мышей- / - , может использоваться для оценки функции специфических белков в механизме действия препарата, как мы сделали в нашей собственной работе8. Различные воспалительные стимулы могут также использоваться для оценки воздействия антител на активацию макрофага. IFNγ и производный узел платных как агонистами рецепторов (TLR) (например , гиалуроновая кислота), использовали для того чтобы активировать Ил-10-производители макрофаги25,28. Важным соображением является доза антитела. Дозу следует титруемая для получения оптимальной дозы в культуре и экспериментов на животных, как она будет отличаться между как антитела, так и поставщиков. Доза подбирается должны также отражать дозы даны для людей и будут отличаться между наркотиками. IVIg дается как противовоспалительная терапия в высоких дозах (25-35 мг/мл или 2 г/кг веса тела), которая отражает титруемая дозы, используемые в эти протоколы29,30.
Использование костного мозга и перитонеальные макрофаги имеют ограничения. Хотя улучшение по сравнению с макрофагов клеточных линий, мыши BMDMs являются по-прежнему искусственно производных клетки из кроветворных прекурсоров. Тестирование иммунной реакции макрофагов в пробирке является важным шагом к пониманию антитела ответы, но в vivo эксперименты должны выполняться также. Парентерального введения стимулов в vivo следуют культивирования клеток ex vivo, может предоставить больше информации для будущих исследований расследовать ли препараты на основе антител может также активировать противовоспалительные макрофагов в болезненное состояние. Нельзя сделать выводы на то, что происходит в людях, получающих биопрепаратов на основе антител от этих экспериментов. Были опубликованы несколько исследований для оценки воздействия IVIg на человека Моноцит производные макрофагов в пробирке. Сокращение количества ИЛ-6 производства человеческого моноцитов в vitro сообщалось, когда IVIg стимулируется совместно с ПЛАСТИНОК, по сравнению с стимуляции с LPS только12. IVIg уменьшает TNFα и IL-6 производства при стимуляции с прокальцитонин (ПКТ) в THP-1 человека monocytic клетки31.
Протоколы в этой бумаги имеют преимущества перед существующими методами. Костного мозга, полученных макрофагов и перитонеальные макрофаги Главные ячейки, изолированные непосредственно от мышей, а не быть увековечен клеточных линий.Мышь Макрофаг как клеточных линий, таких как RAW264.7 клетки, не производят провоспалительных цитокинов ИЛ-12, в ответ на LPS, который является важным цитокина, которая регулируется Ил-10, которое производится в ответ IVIg8,13. Тестирование препарата в vivo с ПЛАСТИНОК позволяет изучение влияния препарата на местных перитонеальный окружающей среды путем анализа жидкость лаважа, перитонеальный клеток, и конкретно, перитонеальных макрофагов. Это короткий срок, простая модель, которая может обеспечить важную информацию, чтобы оправдать рассмотрение неспецифических эффектов антител на активации макрофагов в более и более дорогостоящим животных моделях заболеваний. Это имеет преимущество над эндотоксемии модели, где экспериментальные меры часто является только мыши выживания или цитокинов в сыворотке14. Выживаемости и цитокины сыворотки являются ценные меры иммунного ответа, но они не показывают вклад что макрофаги могут иметь специально. Изоляции и культивирования перитонеальных макрофагов с задачей эксперимента показывает прямой и поддающихся измерению эффект, что антитела терапии может иметь функцию макрофагов.
Эти методы имеют приложения для тестирования и разработки биологической терапии. В последние годы резко возросло использование антител в качестве терапии. Однако эти методы могут иметь дополнительные неизвестные эффекты на макрофаги, которые можно признать Fc часть антитела и изменить их производство цитокинов. Антитела анти TNFα, инфликсимаб, было показано, чтобы побудить Ил-10 и подавляет пролиферацию клеток T через ее Fc часть, и что была предложена в качестве одной из своих механизмов действий7,15,26. Использование генетической модели, специфические белки могут быть причастны механизм как эти препараты влияют на активацию макрофага. Классы и подготовка антител IgG антитела могут быть изменены изменить как макрофаги, подвержены биопрепаратов. Наши данные свидетельствуют о подготовке и/или хранения препарата же антитела (IVIg) может повлиять на его воздействие на активацию макрофага. Методы в этом документе может использоваться для разработки методов лечения, которые не имеют эти эффекты, которые могут иметь решающее значение для поддержания immunosurveillance во время лечения рака, где противовоспалительные макрофагов может способствовать прогрессии опухоли. Эти методы могут также использоваться для разработки и оценки лекарств, которые имеют эти эффекты, если желательно. Например это может быть полезным для уменьшения воспалительных реакций макрофагов и создания противовоспалительных ИЛ-10-производители макрофаги активизировать лечения воспалительных заболеваниях кишечника или ревматоидный артрит.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Acknowledgments
Л.к. является получателем премии выпускник студенчества стипендий (4YF) 4-летнего университета Британской Колумбии. L.M.S. является получателем Канадская ассоциация гастроэнтерологии / крона и колит Канада / КНИИЗ новый следователь оклад премии и биомедицинских ученый Майкл Смит фонда для исследований в области здравоохранения. Эта работа была поддержана грантом проекта от Канадской службы крови, в сотрудничестве с канадской институтов медицинских исследований (Грант # CIHR2016-LS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
- Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
- Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
- Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
- Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).
- Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
- Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
- Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
- Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
- Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
- Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
- Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
- Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
- Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
- Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
- Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
- Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).
