Summary
Antikroppsbaserade läkemedel har revolutionerat behandling av inflammatoriska sjukdomar. Förutom att ha direkta effekter på specifika mål, kan antikroppar aktivera makrofager att bli antiinflammatoriska. Det här protokollet beskriver hur antiinflammatoriska makrofag aktivering kan vara bedömda in vitro använder mus benmärgen makrofager, och in vivo med peritoneal makrofager.
Abstract
Makrofager är fagocytos innate immuna celler, som inleda immunsvar mot patogener och bidra till läkning och vävnad restitution. Makrofager är lika viktiga i att stänga av inflammatoriskt svar. Vi har visat att makrofager stimuleras med intravenöst immunglobulin (IVIg) kan producera stora mängder av den anti-inflammatorisk cytokin, interleukin 10 (IL-10) och låga nivåer av proinflammatoriska cytokiner som svar till bakteriella lipopolysackarider ( LPS). IVIg är en polyvalenta antikropp, primärt immunglobulin Gs (IgG), poolade av plasma från mer än 1 000 blodgivare. Det används för att komplettera antikroppar hos patienter med immunbrister eller undertrycka immunsvaret hos patienter med autoimmuna eller inflammatoriska tillstånd. Infliximab, en terapeutisk anti-tumör nekros faktor alpha (TNFα) antikropp, har också visat att aktivera makrofager att producera IL-10 svar på inflammatoriska stimuli. IVIg och andra antikroppsbaserade biologics kan testas för att fastställa deras effekter på makrofag aktivering. Detta dokument beskriver metoder för härledning, stimulering och bedömning av murina benmärgen makrofager aktiveras av antikroppar i vitro och murina peritoneal makrofager aktiveras med antikroppar i vivo. Slutligen visar vi användningen av western blotting för att fastställa bidraget av viss cell signalering vägar till antiinflammatoriska makrofag aktivitet. Dessa protokoll kan användas med genetiskt modifierade möss, för att avgöra effekten av en specifik proteinernas på antiinflammatoriska makrofag aktivering. Dessa tekniker kan också användas för att bedöma om specifika biologics får agera genom att ändra makrofager till en IL-10-producerande antiinflammatoriska aktiveringsläge som minskar inflammatoriskt svar i vivo. Detta kan ge information om rollen av makrofag aktivering i effekten av biologiska läkemedel under sjukdomsmodeller hos möss, och ge inblick i en potentiell ny verkningsmekanism i människor. Däremot kan detta varning mot användning av specifika antikroppsbaserade biologics att behandla infektionssjukdomar, särskilt om makrofager spela en viktig roll i värd försvar mot att infektion.
Introduction
Makrofager är innate immuna celler, som spela flera roller i immunförsvaret till infektion eller skada. Makrofager är ansvariga för inleda ett immunsvar mot infektion eller vävnad skada, stoppa den inflammatoriska reaktionen och att främja helande svar1. Exempel på de tre bästa studerade makrofag aktiveringen staterna är: 1) makrofager som behandlats med interferon gamma (IFNγ) och bakteriella lipopolysackarid (LPS), designerat M (IFNγ + LPS), som bidrar till den inflammatoriska reaktionen; (2) makrofager stimuleras med interleukin 4 (IL-4), M(IL-4), som är associerade med den helande reaktion; (3) makrofager stimuleras med immunkomplex (IC) och LPS, M (IC + LPS), som har förmågan att stänga av den inflammatoriska reaktion2,3. M (IC + LPS) skiljer sig från M(IL-4) sårläkning makrofager och uttrycker inte den enzym arginas (Arg-1) eller FIZZ14. Den bästa markören för dessa antiinflammatoriska makrofager är deras cytokin produktion5. Makrofager har flera roller att upprätthålla hälsa, men också bidra till inflammatoriska sjukdomar och cancer3. På grund av detta är makrofager viktiga terapeutiska mål för behandling av en mängd olika sjukdomar. Det är viktigt att undersöka effekterna av antikroppar på deras aktiveringsläge att utveckla makrofag-baserade behandlingar för sjukdom.
Denna uppsats fokuserar på användning av murina benmärgen härrör makrofager (BMDMs) och peritoneal makrofager att testa effekten av antikroppar läkemedel på inflammatoriskt svar in vitro och in vivo. Nyligen har det varit flera studier som visar effekterna av antikroppar på makrofag aktiveringen6,7,8. Makrofager aktiveras tillsammans med immunkomplex, som är antikroppar komplexförening med antigen och LP-skivor, ett normalt inflammatoriskt stimulus, halter mycket höga av antiinflammatoriska cytokiner, IL-10 och mycket låga nivåer av de pro-inflammatorisk cytokin, interleukin 12 (IL-12)9. Dessutom, infliximab, en monoklonal antikropp mot TNFα, har visat sig fungera, delvis genom att inducera antiinflammatoriska makrofager genom dess fragment crystallizable (Fc) region7. Vi har rapporterat att IVIg + LPS inducerar antiinflammatoriska makrofag aktivering som liknar M (IC + LP-skivor), vari Co stimuleras makrofager producerar stora mängder IL-10 och låga mängder av pro-inflammatorisk cytokin subenhet Interleukin 12 eller 23 p40 ( Il-12/23p40), interleukin-6 (IL-6) och TNF8. IVIg är ett läkemedel som består av polyklonala antikroppar, primärt IgG, som har slagits samman från mer än 1000 givare10blod. Det används för att behandla en mängd olika immunologiska sjukdomar som idiopatisk trombocytopen purpura och kronisk demyeliniserande polyneuropati, men verkningsmekanismen är inte helt förstått11. Effekterna av antikropp baserat droger på makrofag aktivering kan bedömas med metoderna som beskrivs häri.
Effekterna av särskilda biologics på makrofag aktivering kan testas i BMDMs och peritoneal makrofager. Använda dessa makrofag källor tillåter bedömning av primära celler. Preliminär testning av antikroppar på odlade primära celler kräver mindre tid och monetär investering än andra tidskrävande och dyra sjukdomsmodeller. Genom att injicera en drog i en hälsosam mus i vivo, och isolera cellerna och analysera dem ex vivo, kan man bestämma om studier är berättigade för att bedöma om behandling med biologiska läkemedel påverkar makrofag aktivering i sjukdomsmodeller.
Med några studier testa effekten av biologiska behandlingar på makrofag aktivering in vitro och in vivo direkt, ger våra tekniker en fördel jämfört med alternativa tekniker. Aktuella tekniker innebär testning biologiska läkemedelseffekter på blandad cell populationer i vitro, till exempel effekten av infliximab hos en blandade lymfocyter reaktion (MLR) eller IVIg på mänskliga makrofager i perifera mononukleära blodceller, där effekten inte kan hänföras till en viss cell typ7,12. Använda BMDMs och peritoneal makrofager är fördelaktiga över med cellinjer, såsom RAW264.7 celler, som inte producerar den pro-inflammatoriska cytokin, IL-12, svar till LPS8,13. Testa effekten av en antikroppsbaserade läkemedel på makrofag Svaren ex vivo har fördelar eftersom cytokin svar kan hänföras direkt till makrofager, snarare än inferring makrofag Svaren genom att mäta nivåerna av serum cytokin14 . BMDMs och peritoneal makrofager kan härledas och isolerad från genetiskt modifierade möss att bestämma den särskilda rollen som ett protein i antiinflammatoriska makrofag aktivering. Till exempel har vi använt Il10 bristfällig(- / -) BMDMs att påvisa att IVIg-inducerad minskning av pro-inflammatorisk cytokin produktion är delvis beroende av IL-108. En läkemedlets verkningsmekanism kan undersökas med hjälp av western blotting, där rollen av specifika proteiner och signalering händelser kan fastställas. Kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR) kan utföras på BMDMs eller peritoneal makrofager att Visa beskrivningar av genuttryck som följd av antikropp aktivering. Sjukdomsmodeller hos möss kan ge information om den potentiella effekten av antikroppsbaserade biologiska terapier i modeller för sjukdomar som upphetsande läkt sjukdom, reumatoid artrit och cancer15,det16, 17. men de tekniker som beskrivs här ger information om verkningsmekanismen av dessa biologiska läkemedel genom att bestämma huruvida de inducerar antiinflammatoriska makrofag aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of British Columbia.
1. benmärg makrofag härledning och aktivering med antikroppar
- Utföra eutanasi med CO2 kvävning.
- Plats mus i induktion kammare. Avliva musen med 5% isofluran anestesi, för 60-90 s, tills orörliga och andas djupt och långsamt.
- Stäng av isofluran anestesi och administrera 6-8 L/min CO2 tills musen har slutat andas. Lämna mus med CO2 på för ytterligare minst 5 min. Kontrollera att det inte längre en puls eller andning. Utföra en cervikal dislokation för att säkerställa död.
Obs: 8-12 veckor gamla möss ger den högsta avkastningen av makrofager.
- Spray mus ben med 70% etanol och fäst dem med armar och ben utsträckta i ryggläge över en skum ombord. Med sax och pincett att hålla huden, göra ett grunt snitt (0,2 cm) att ta bort hud och päls från ytan av varje av bakbenen.
Obs: Utföra proceduren och alla vävnadsodling manipulationer i en steril huva. - Trimma muskler att synliggöra skenbenet och lårbenet. Ta bort skenbenet och lårbenet, genom att skära ben och muskler nedanför höftleden och ovanför anklarna. Trimma så mycket muskler bort som möjligt.
- Spray ben med 70% etanol och vänta 1 min att avdunsta och sedan placera dem i 6 väl platta ben spola medium (Iscoves modifierad Dulbecco's medium (IMDM), 10% fetalt bovint serum (FBS)).
- Trimma ändarna på benen genom att skära 0,1 cm av ben av vristen och toppen av lårbenet så att Ben hålrummet är utsatt. Säkerställa att märgen är synliga och en 26 gauge nål kan placeras i ben hålighet.
- Skär ben och muskler att skilja på skenbenet och lårbenet från knäleder. Infoga en 26 gauge injektionsnål till en 10 mL spruta i kaviteten. Spola benmärgen till en 50 mL konisk rör med 5 mL av ben spola medium. Spola två skenben och två lårbenet, från en mus, i varje 50 mL tub.
- Pipettera upp och ner flera gånger eller virvel märgen på en långsam hastighet att försiktigt skingra klumpar. Strängar av benmärg bör delas upp i små (mindre än 0.5 mm) fläckar av benmärg. Fyll koniska röret till 50 mL med ben spola medium. Pipett förpackningens konformade röret till en 75 cm2 vävnadsodling behandlade kolv och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 för 1 h.
Obs: Mogen makrofager och mesenkymala celler blir anhängare till kolven och kasseras, medan de önskade hematopoetiska progenitorceller kvar i suspension. - Pipettera på medellång med hematopoetiska progenitorceller i en 50 mL konisk tub. Centrifugera röret vid 300 x g i rumstemperatur i 5 min. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 5 mL av makrofag kolonistimulerande faktor (MCSF) odlingsmedium (IMDM, 10% FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL penicillin/streptomycin och 150 μM monothioglycerol (MTG)).
- Räkna celler som använder en hemocytometer18. Lägg till medium för att resuspendera cellerna till en koncentration av 0,5 x 106 celler/mL, 1,5 x 107 celler/kolv i 30 mL medium, och Pipettera försiktigt upp och ner. Pipettera 30 mL av suspensionen i en ny 75 cm2 vävnadsodling behandlas kolv.
- Dag 4 och dag 7 efter inledande kultur i steg 1,9, kontrollera att cellerna är anhängare och något Grenade genom en inverterad fas kontrast ljusa fält Mikroskop. Kassera det medium som innehåller icke-anhängare celler. Tvätta cellerna med IMDM en gång och tillsätt 30 mL MCSF odlingsmedium.
- När cellerna är mogen av dag 10 (> 95% positiva för F4/80 och Mac-1), kontrollera igen att cellerna är anhängare och något.
- Platta celler för stimuli, ta bort odlingssubstratet från kolven och Lägg till 8 mL av enzymet gratis, EDTA-baserade cell dissociation buffert (Tabell för material). Inkubera cellerna för 5 min vid 37 ° C, 5% CO2.
- Skrapa försiktigt, celler med en liten mängd tryck, med hjälp av en steril cell skrapa. Kontrollera i mikroskopet som celler har lösgjort från kolvens yta. Pipettera dissocierade celler i en 50 mL konisk tub. Skölj kolven 3 gånger med 5 mL av IMDM och pool skölj lösningen med de celler som skördades. Centrifugera celler vid 300 x g i rumstemperatur i 5 min.
- Återsuspendera cellpelleten i 3 mL MCSF odlingsmedium per 50 mL koniska rör. Räkna viabla celler med hjälp av en hemocytometer18. Återsuspendera cellerna vid en koncentration på 1 x 106 celler/mL och platta 100 μl cellsuspension (1 x 105 celler per brunn) per brunn av en 96 brunnar vävnadsodling behandlas, platt bottenplattan.
Obs: Ben från en mus kommer att generera tillräckligt med celler för 100 brunnar. Om så önskas, kan 1 mL av celler vara klädd i en 6-well platta (vävnadsodling behandlade, platt botten). Ett större antal (1 x 106 celler) kan vara användbara för western blot analyser. - När vidhäftande, stimulera dubblett eller tre exemplar brunnar med 10 ng/mL av LPS i IMDM, 30 mg/mL av IVIg, eller IVIg + LP-skivor. Doser av LPS eller IVIg kan titreras för att optimera svaren. Lämna dubbletter eller tre exemplar brunnar som ostimulerade kontroller. Inkubera dem i 24 h (37 ° C, 5% CO2).
Obs: Nytt guldpläterade celler ska följa vävnadsodling brunnar inom 1 h. - Samla in cell supernatanterna från varje brunn i enskilda 1,7 mL mikrocentrifugrör och ta bort partiklar av snurrande vid 10 000 x g i 5 min.
- Ta bort cellen supernatanten och undvika att störa pelleten. Placera den klargj橬一j cellen supernatanten i ett sterilt mikrocentrifug rör.
Obs: Cell supernatanterna kan analyseras för cytokiner, IL-10 och cytokin subenhet, IL-12 / 23p 40, av enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) omedelbart eller förvaras vid-80 ° C lång sikt. Följ ELISA protokoll från kommersiellt tillgängliga kit (Tabell för material). Andra pro-inflammatoriska cytokiner kan analyseras, såsom IL-6 och TNF, eftersom de också minskas med samtidig behandling med IVIg + LPS stimulering jämfört med stimulering med LPS ensam. Efter stimulering, kan vidhäftande celler förberedas för tekniker såsom western blotting eller kvantitativa polymeras-kedjereaktion (Q-PCR) 19,20.
2. utmana möss In Vivo med IVIg och skörd Peritoneal makrofager
- Väga varje mus.
Obs: till exempel för en 20 g mus, 500 µL av IVIg krävs.
Obs: Utför åtgärderna i en steril huva.
Obs: Placera nålen försiktigt i musen så att du inte injicera PBS i organen, men snarare i peritoneal utrymme.
Obs: För varje 5 mL vätska injiceras, cirka 3,75 mL kommer att återvinnas.
Obs: Efter den sista injektionen, kan det vara lättare att extrahera vätskan från långt vänster och höger sidorna av musen, där vätska har ackumulerats. Organen kommer att orsaka mindre störningar med nålen på denna position.
Obs: Makrofager kommer att vara något större än de andra peritoneal cellerna. Typiska avkastningen är 5 x 105 - 1 x 106 makrofager/mus med hjälp av en mus med vildtyp i C57BL/6.
Valfritt: Om ett stort antal röda blodkroppar i cellpelleten, utföra ett Lys steg för att ta bort dem, använder 1 x röd blod cell lysis bufferten enligt tillverkarens anvisningar.
Obs: Det kan vara nödvändigt att pool celler från fler än en mus för ett experiment om använder tre exemplar brunnar eller titrering stimulantia. Exempelvis om en mus hade 5 x 105 makrofager, skulle 500 μL av plätering medium krävas. Det skulle finnas tillräckligt med celler för 5 brunnar, eller 1 experiment i två exemplar med en LPS dos.
Obs: Efter stimulering, vidhäftande celler kan förberedas för tekniker såsom western blot eller PCR.
3. utmana möss in Vivo med IVIg + LPS och skörd Peritoneal makrofager
- Väga varje mus. Beräkna volymen av IVIg (100 mg/mL lager koncentration) behövs för att ge en sista dosen på 2,5 g/kg kroppsvikt. Beräkna mängden LPS (100 μg/mL lager koncentration i IMDM) behövs för att ge en sista dos på 0,2 μg/g kroppsvikt.
Obs: till exempel för en 20 g mus, 500 µL av IVIg stamlösning och 40 μL av en 100 μg/mL lösning av LPS krävs. - Rita den erforderliga mängden av IVIg och LPS i en steril 1 mL spruta med en steril 26 gauge nål. För kontroll möss som får IVIg, ersätta en motsvarande volym av IVIg med steril fosfatbuffrad Koksaltlösning pH 7,4.
- Kragen musen med ena handen genom greppa dess huden på baksidan av halsen med tummen och pekfingret och hålla sin svans och bakbenen med dina återstående fingrar. Luta kroppen mot marken.
- Plats nålen i 30-40° vinkel i förhållande till musens buken, i den nedre högra kvadranten, kant, och infoga 1,5 cm. injicera IVIg + LP-skivor, eller PBS + LPS, intraperitonealt som i steg 2,4.
- Efter 1h, skörda peritoneal makrofager genom att utföra steg 2.5-2.10.
- Snurra celler ner vid 300 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Ta bort 1 mL av återvunna lavage vätska och använda för IL-10 och IL-12 / 23p 40 analyser av ELISA enligt tillverkarens anvisningar eller frysa vid-80 ° C för framtida analyser.
Obs: För att säkerställa korrekt jämförelse mellan behandlingar för lavage vätska cytokin analys, utföra 5 mL flushs av bukhålan 4 gånger för en slutlig volym av 15 mL. Inte alla vätska kommer att återkrävas från varje spolning. - Som i steg 2.11, Omsuspendera och räkna livskraftig makrofager.
Obs: Makrofager kommer att vara något större än de andra peritoneal cellerna.
Valfritt: Om ett stort antal röda blodkroppar i cellpelleten, utföra ett Lys steg enligt tillverkarens instruktioner för att ta bort dem, som i steg 2.11.
Obs: Det kan vara nödvändigt till pool celler från fler än en mus för ett experiment. Exempelvis om en mus hade 5 x 105 makrofager, skulle 500 μL av plätering medium krävas.
Obs: Prover kan användas omedelbart eller fryst och lagras vid-80 ° C för cytokin analys av ELISA.
Obs: Celler kan förberedas för tekniker såsom western blot eller PCR, som i steg 1.16-1.17 och 2.14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Murina bone marrow härrör makrofager kan vara odlade från hematopoetiska celler prekursorer i benmärg enkelarmade. Benmärgen aspirerade poolats från lårbenet och förbenade av en C57BL/6 mus vanligtvis ge 107 benmärgen härrör makrofager, vilket gör dem till en bekväm källa av makrofager för experiment. BMDMs kan användas för att testa baserat drog antikroppssvar när utmanas med ett inflammatoriskt stimulus i vitro. Figur 1 visar att IVIg varumärke, Gammunex (GX), + LPS ökar produktionen av de antiinflammatoriska cytokin, IL-10, 7-fold jämfört med LPS stimulering ensam (figur 1A) och minskar produktionen av IL-12/23 p 40 (figur 1 B). Figur 1 visar också att olika IVIg preparat utför annorlunda. Även om de tre olika preparat av IVIg kan minska IL-12 / 23p 40 betydligt (figur 1B), Octagam (OG) och Gammagard vätska (GL), inte avsevärt ökar IL-10 produktion svar på LPS (figur 1 A). OG och GL kan avsevärt minska produktionen av IL-12/23 p 40 i svar till LP-skivor, men i mindre grad än GX. Dessa resultat visar att antikroppar påverkar benmärgen härrör makrofag aktivering, och att det finns skillnader mellan preparat av samma läkemedel som kan orsaka förändringar i svaren.
BMDMs kan användas för att testa mekanistiska effekterna av IVIg, av western blotting. Makrofager aktiveras med IC + LPS har ökat fosforylering av mitogen aktiveras (karta) proteinkinaser, p38 och Erk1/2, som är ansvariga för ökad IL-10 produktion21. Resultaten i figur 2 visar en typisk western blot upptäcka karta Kinas aktivering krävs för produktion av IL-10 av makrofager som ostimulerade, eller har varit stimuleras med LPS, IVIg, eller IVIg + LP-skivor. IVIg stimulering ensam eller IVIg + LPS samtidig stimulering ökad aktivering av de karta kinaser, Erk1/2, med tidigare och långvarig fosforylering jämfört som ses med LPS ensam. Aktivering av p38 uppstod tidigare i makrofager stimuleras med IVIg + LPS jämfört med de stimuleras med LPS ensam. Dessa resultat visar att metoder, såsom western blotting, kan användas för att Visa cell signalering effekter av antikropp läkemedel på BMDMs. Förutom cytokin produktion användas karta Kinas aktivering till antiinflammatoriska makrofag aktiveringen har skett.
Mogen, vävnad bosatta makrofager kan också isoleras från möss att bedöma Svaren till IVIg 5.0 x 105 - 1,0 x 106 peritoneal makrofager kan isoleras från en hälsosam C57BL/6 mus. I figur 3ökar peritoneal makrofager från möss som injicerats med IVIg inte avsevärt IL-10 produktion i avsaknad av stimulering i vitro, jämfört med PBS injiceras möss. När peritoneal makrofager från IVIg injiceras möss stimuleras med LPS ex vivo, de producerar 6-fold mer IL-10 än möss som injicerats med PBS. De producerar inte, dock detekterbara mängder av IL-12 / 23p 40 när stimuleras med LPS ex vivo. Dessa resultat visar att antikroppen effekter kan testas på makrofager genom injicering av narkotika i vivo och odla celler ex vivo med denna metod.
Makrofag Svaren till antikroppar och inflammatoriska stimuli kan vara bedömda i vivo. Cytokin produktion kan bedömas i lavage vätska och i supernatanterna från ex vivo stimuleras peritoneal makrofager. Figur 4 visar den anti-inflammatorisk cytokin IL-10 ökas i lavage vätska (figur 4A), peritoneal celler (figur 4B) och peritoneal makrofager (figur 4C) när möss utmanas med IVIg + LPS jämfört med PBS + LP-skivor. Produktionen av den pro-inflammatoriska cytokin subuniten, IL-12 / 23p 40, minskas avsevärt i odlade peritoneal makrofager, men inte i lavage vätska. Denna metod tillåter granskning av en antikropp drogens effekt på inflammatoriska svar i vivo samt ex vivo.
Figur 1 : Makrofag IL-10 och IL-12 / 23p 40 produktionen som svar på samtidig stimulering med olika märken av IVIg och LPS. C57BL/6 MCSF benmärg härrör makrofager var antingen ostimulerade (C), eller stimuleras med LPS (10 ng/mL), IVIg (30 mg/mL), eller IVIg + LP-skivor. Tre olika märken av IVIg testades: Gammunex (GX), Gammagard vätska (GL) och Octagam (OG). Makrofag supernatanterna samlades in 24 h efter stimulering, och genom centrifugering. Elisa-test för IL-10 (A) och IL-12/23 p 40 (B) utfördes. Data är för makrofager från n = 3 oberoende experiment, med celler från 1 individuell mus per experiment, med ELISA-test analyseras i duplikat. Data är medel ± SD. *P < 0,05, ** P < 0,001, ***P < 0,0001 för jämförelse mellan LPS stimulering och IVIg + LPS samtidig stimulering. Envägs variansanalys (ANOVA) med Tukeys post-test för multipla jämförelser användes för statistiska analyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Western blot analys av karta Kinas aktivering i IVIg-aktiverade makrofager. MCSF härrör benmärgen makrofager var ostimulerade eller stimuleras med LPS (10 ng/mL), GX IVIg (30 mg/mL), eller GX IVIg + LPS; för 0, 10, 40 eller 120 min. hela cellen lysates (1,0 x 106 makrofager/lane) utsattes för sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gel elektrofores (SDS-PAGE) och western blotting med phospho-specifika antikroppar för p38 och extracellulära signal-reglerade Kinas (Erk1/2), samt glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenas (GAPDH), som lastning kontroll. Resultaten som visas är representativa för n = 3 oberoende experiment, med celler från 1 individuell mus per experiment.Densitometry för pp38 och pErk1/2 proteinnivåer, normaliserade till GAPDH, i genomsnitt från 3 oberoende experiment visas nedanför varje band. Denna siffra har ändrats från Kozicky et al8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : IL-10 produktion av makrofager från möss utmanas med IVIg i vivo. 8 veckor gamla C57BL/6 möss fick steril fosfatbuffrad Koksaltlösning (injektion kontroll) eller GX IVIg (2,5 g/kg) intraperitonealt. Efter 1 h, möss var euthanized och peritoneal lavages utfördes. Peritoneal makrofager var isolerade med följsamhet urval. Makrofager var antingen ostimulerade (C), eller stimuleras med LPS (10 ng/mL). Cell supernatanterna var skördas och förtydligade efter 24 h IL-10 ELISAs. Data är från n = 5 individuella möss per grupp utförs i 3 oberoende experiment, med ELISA-test analyseras i duplikat. Data är medel ± SD. * P < 0,01 och NS = inte betydande. Statistiska analyser utfördes med en dubbelriktad ANOVA med Sidak's posttest för multipla jämförelser. Denna siffra har ändrats från Kozicky et al8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : IL-10 och IL-12 / 23p 40 produktion från möss utmanas med IVIg + LPS i vivo. 8 veckor gamla C57BL/6 möss injicerades intraperitonealt med antingen PBS + LPS (0.2 µg/g kroppsvikt), som en kontroll; eller GX IVIg (2,5 g/kg kroppsvikt) + LPS (0.2 µg/g kroppsvikt). Efter 1 h, möss var euthanized och peritoneal lavages utfördes. (A) Clarified lavage vätska, (B) förtydligas luftkonditionerade supernatanterna från peritoneal celler under ett 1 h makrofag följsamhet steg, och (C) förtydligas 24 h peritoneal makrofag (Mφ) supernatanterna analyserades för IL-10 och IL-12 / 23p 40 av ELISA. Data är medel ± SD för n = 5 möss i 3 oberoende experiment, med ELISA-test analyseras i duplikat. P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 och NS = inte betydande. Möss som injicerats med PBS + LPS jämfördes med möss som injicerats med IVIg + LPS använder en Student's t -test. Denna siffra har ändrats från Kozicky et al8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Makrofag aktiveringen stater har en viktig roll i både vävnad homeostas och sjukdom22. Makrofager kan ha skilda samt överlappande aktiveringen staterna, beroende på ledtrådar i sin mikromiljö3. De har skilda roller i alla stadier av det inflammatoriska svaret: försvar mot patogener, sår läkning och vävnad restitution och har också en distinkt antiinflammatoriska aktiveringen stat som är viktigt för att stänga av den inflammatoriska reaktionen2 . Antiinflammatoriska makrofag aktiveringen kräver två yttre stimuli för makrofager att producera stora mängder den antiinflammatoriska cytokiner, IL-10 och låga mängder av pro-inflammatoriska cytokiner, såsom IL-1223. En signal kommer från antikroppar genom Fc gamma receptorer, och den andra signalen är ett pro-inflammatoriska stimulus, såsom LPS eller IFNγ24,25. Serum, immunkomplex och anti-TNFα antikroppar, har alla visat sig framkalla en hög IL-10-produing antiinflammatoriska aktiveringstillstånd i makrofager8,23,25,26. Vår grupp har tidigare publicerats att murina benmärgen härrör makrofager och peritoneal makrofager stimuleras med IVIg producerar också stora mängder IL-10 och lite till ingen pro-inflammatoriska IL-12 / 23p 40 svar till LPS8. Vi har också funnit att andra pro-inflammatoriska cytokiner, TNF och IL-6 är också minskat av IVIg i benmärgen härrör makrofager8. Metoderna som beskrivs här kan användas för att testa andra baserat drog antikroppssvar i mus BMDMs och peritoneal makrofager in vitro och in-vivo.
Det finns många kritiska steg i testning antikroppsbaserade therapeutics på mus benmärg och peritoneal makrofager. Att upprätthålla sterilitet är viktigt för varje protokoll. Om makrofag kulturer är förorenade med mikroorganismer från luften, päls eller avföring från möss, att makrofager svara på dessa stimuli genom att producera pro-inflammatoriska cytokiner. Utföra alla experiment i en biosäkerhet skåp, sprutning musen frikostigt med etanol och integritet av tarmen under peritoneal spolningar är nödvändiga. Antikroppen måste också hållas steril och lagrade enligt tillverkarens anvisning. Det kan inte användas om det är förorenat, utgångna eller grumligt. Turbiditet kommer att minska effekten av läkemedlet och kan uppstå om läkemedlet inte förvaras vid rätt temperatur eller har lagrats för länge. IVIg kan lagras vid 4 ° C och endast användas innan upphörandedatum nås, eftersom nivåerna av IL-10 produktion kan påverkas. Alternativt har vi sett att det kan frysas vid-20 ° C med ingen effekt på svaren. Olika massor av IVIg leda till liknande experimentella resultat, medan olika typer av IVIg varumärke preparat, som i figur 1, kan orsaka olika svar i makrofager. Eteriska kontrollerar, såsom ostimulerade celler och celler stimuleras med antikropp som är ensam, måste inkluderas i varje experiment att utesluta förorening av makrofager eller drogen.
Flera ändringar kan göras till dessa protokoll att anpassa ett experiment. I icke-inflammerad staten, kan det vara svårt att isolera tillräckligt peritoneal makrofager för stora experiment. Peritoneal makrofager kan utlösas av intraperitoneal injektion av thioglycollate (TG). Ett immunsvar uppstår och efter 4 dagar, framkallade peritoneal makrofager kan skördas27. Den rekryterade makrofager kan vara mindre mogen och representerar inte bosatt celler, som vi har använt här, vilket är viktigt att tänka på. TG-framkallade makrofager kan också har internaliserat agar från TG buljong, vilket kan vara en komplikation, särskilt om gör experiment på fagocytos27. Möss från olika genetiska bakgrunder, C57BL/6 eller BALB/c, kan också användas för experiment och kan väljas för att undersöka effekterna av antikroppar på makrofag svar som kommer att bedömas i sjukdomsmodeller som kräver en specifik genetisk bakgrund. Dessutom kan genetiskt modifierade möss, såsom Il10- / - möss, användas för att bedöma funktionen av specifika proteiner i verkningsmekanismen av ett läkemedel, som vi gjort i vårt eget arbete8. Olika inflammatoriska stimuli kan också användas för att bedöma effekten av antikroppar på makrofag aktiveringen. IFNγ och värd härrör vägtull som (TLR)-receptoragonister (t.ex. hyaluronsyra), har använts för att aktivera IL-10-producerande makrofager25,28. En viktig faktor är dosen av antikroppen. Dosen bör titreras för att få den optimala dosen i kulturen och i djurförsök, som det kommer att skilja mellan antikroppar samt leverantörer. Den dosen som valt bör också återspegla den dos som ges till människor, och varierar mellan läkemedel. IVIg ges som en antiinflammatorisk terapi vid höga doser (25-35 mg/mL eller 2 g/kg kroppsvikt), vilket återspeglar de titrerade doser som används i dessa protokoll29,30.
Användning av benmärgen och peritoneal makrofager har begränsningar. Även om en förbättring över makrofag cellinjer, är mus BMDMs fortfarande artificiellt härledda celler från hematopoetisk prekursorer. Testning av makrofager i vitro immunt svar är ett viktigt steg att förstå antikroppssvar, men i vivo experiment behöver utföras samt. Injicera stimuli i vivo som följt av odla celler ex vivo, kan ge mer information för framtida studier för att undersöka huruvida antikroppsbaserade läkemedel kan också aktivera antiinflammatoriska makrofager i ett sjukdomstillstånd. Slutsatser om vad som sker i personer som får antikroppsbaserade biologics kan inte dras från dessa experiment. Få studier har publicerats för att bedöma effekterna av IVIg på mänskliga monocyt härrör makrofager in vitro. En minskning av antalet IL-6 producerar humana monocyter in vitro- har rapporterats, när IVIg stimuleras tillsammans med LPS jämfört med stimulering med LPS ensam12. IVIg minskar TNFα och IL-6 produktion när stimuleras med procalcitonin (PCT) i THP-1 mänskliga monocytic celler31.
Protokollen i denna uppsats har fördelar jämfört med befintliga metoder. Benmärgen härrör makrofager och peritoneal makrofager är primära celler, isolerade direkt från möss, snarare än att vara förevigat cellinjer.Mus makrofag-liknande cellinjer, såsom RAW264.7 celler, inte producerar den pro-inflammatoriska cytokin, IL-12, som svar på LP-skivor, vilket är en viktigt cytokin som är reglerad av IL-10 som produceras som svar på IVIg8,13. Testa en drog i vivo med LPS tillåter granskning av effekten av läkemedlet på peritoneal närmiljön genom analys av lavage vätska, peritoneal celler och specifikt peritoneal makrofager. Det är en kort sikt, enkel modell som kan ge viktig information för att motivera undersökningen av icke-specifika effekter av antikroppar på makrofag aktivering i längre och mer kostsamma djurmodeller av sjukdom. Den har en fördel över endotoxemia modeller där experimentell åtgärden är ofta endast mus överlevnad eller cytokiner i serum14. Överlevnad och serum cytokiner är värdefulla åtgärder av immunsvar, men de visar inte bidrag att makrofager kan ha specifikt. Isolera och odla peritoneal makrofager från en utmaning experiment visar en direkt och mätbar effekt antikropp therapeutics kan ha på makrofag funktion.
Dessa metoder har program för provning och utforma biologiska behandlingar. Användning av antikroppar som therapeutics har ökat dramatiskt under de senaste åren. Dessa behandlingar kan dock ha ytterligare okända effekter på makrofager som kan känna igen Fc-delen av antikroppen och ändra deras cytokin produktion. Den anti-TNFα antikroppen, infliximab, har visat sig inducera IL-10 och undertrycka T cell spridning genom dess Fc-delen och som har föreslagits som en av dess mekanismer av åtgärd7,15,26. Med hjälp av genetiska modeller, kan specifika proteiner vara inblandat i mekanismen för hur dessa läkemedel påverkar makrofag aktivering. Klasser av IgG-antikroppar och preparat av antikroppar kan ändras för att förändra hur makrofager påverkas av biologiska läkemedel. Våra data indikerar att förbereda och/eller lagring av samma antikropp drog (IVIg) kan påverka dess effekter på makrofag aktivering. Metoderna i denna uppsats kan användas för att designa behandlingar som inte har dessa effekter, vilket kan vara avgörande för att upprätthålla immunosurveillance under cancerbehandlingar, där antiinflammatoriska makrofager kan främja tumör progression. Dessa tekniker kan också användas för att utforma och utvärdera droger som har dessa effekter, om önskvärt. Exempelvis kan det vara fördelaktigt att minska makrofag inflammatoriskt svar och skapa antiinflammatoriska IL-10-producerande makrofager för att förbättra behandling för inflammatorisk tarmsjukdom eller reumatoid artrit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter avslöja.
Acknowledgments
Larsson är mottagare av utmärkelsen University of British Columbia 4-årig fellowship (4YF) graduate STUDENTTILLVARO. L.M.S. är mottagare av en Canadian Association i gastroenterologi / Crohns och kolit Kanada / CIHR nya utredare lön Award och är en biomedicinsk vetenskapsman av stiftelsen Michael Smith för hälsoforskning. Detta arbete stöds av ett projektanslag från kanadensiska blod tjänster, i samarbete med den kanadensiska institut för hälsa forskning (bevilja # CIHR2016-LS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
- Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
- Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
- Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
- Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).
- Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
- Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
- Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
- Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
- Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
- Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
- Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
- Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
- Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
- Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
- Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
- Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).
