Summary
Antikörper-basierte Medikamente haben die Behandlung von entzündlichen Erkrankungen revolutioniert. Zusätzlich zu den direkten Auswirkungen auf bestimmte Ziele, können Antikörper Makrophagen entzündungshemmende zu aktivieren. Dieses Protokoll beschreibt wie entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung bewertet in vitro mit Maus Knochenmark Makrophagen, und in-vivo mit peritonealen Makrophagen werden kann.
Abstract
Makrophagen sind phagocytic angeborene Immunzellen, die Immunantworten auf Krankheitserreger zu initiieren und zu Heilung und Gewebe Wiedergutmachung beitragen. Makrophagen sind ebenso wichtig für die Entzündungsreaktionen ausschalten. Wir haben gezeigt, dass hohe Mengen an die Anti-inflammatorische Zytokine, Interleukin 10 (IL-10) und niedrige Niveaus von Pro-inflammatorischen Zytokinen als Reaktion auf bakteriellen Lipopolysacchariden (Makrophagen stimuliert mit intravenösem Immunglobulin (IVIg produzieren) LPS). IVIg ist ein polyvalenter Antikörper, vor allem Immunglobulin Gs (IgGs), aus dem Plasma von mehr als 1.000 Blutspendern gebündelt. Es dient der Ergänzung Antikörper bei Patienten mit Immunschwäche oder Immunantworten bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen oder entzündlichen Bedingungen zu unterdrücken. Infliximab, eine therapeutische anti-Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF) Antikörper, nachweislich auch Makrophagen produzieren IL-10 in Reaktion auf entzündliche Reize zu aktivieren. IVIg und andere Antikörper-basierten Biologics kann getestet werden, um deren Auswirkungen auf Makrophagen Aktivierung zu bestimmen. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Ableitung, Stimulation und Bewertung der murinen Knochenmark Makrophagen durch Antikörper in Vitro aktiviert und murinen peritonealen Makrophagen aktiviert mit Antikörpern in Vivo. Zu guter Letzt zeigen wir die Verwendung von westliche Beflecken, um den Beitrag der bestimmte Zelle Signalwege entzündungshemmende Makrophagen-Aktivität zu bestimmen. Diese Protokolle können mit genetisch veränderten Mäusen, verwendet werden, um festzustellen, die Wirkung von bestimmten benutzt auf entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung. Diese Techniken können auch verwendet werden, um festzustellen, ob bestimmte Biologics wirken können, indem Makrophagen auf eine IL-10 produzierende entzündungshemmende Aktivierungsstatus, die Entzündungsreaktionen in Vivoreduziert. Dies kann geben Auskunft über die Rolle der Makrophagen Aktivierung in die Wirksamkeit von Biologika während Krankheitsmodelle in Mäusen und geben Einblick in ein potenzieller neuer Wirkmechanismus im Menschen. Umgekehrt kann dies gegen den Einsatz von spezifischen Antikörpern basierende Biologics Vorsicht zur Behandlung von Infektionskrankheiten, insbesondere dann, wenn Makrophagen eine wichtige Rolle in der Wirt Verteidigung gegen diese Infektion spielen.
Introduction
Makrophagen sind angeborene Immunzellen, die mehrere Rollen in der Immunantwort auf Infektionen oder Verletzungen zu spielen. Makrophagen sind verantwortlich für die Einleitung einer Immunantwort auf Infektionen oder Gewebe Schaden, die entzündliche Reaktion zu stoppen und die heilende Antwort1zu fördern. Beispiele für die drei am besten untersuchten Makrophagen Aktivierung Zustände sind: 1) Makrophagen, die Behandlung mit Interferon-Gamma (IFNγ) und bakterielle Lipopolysaccharid (LPS), M (IFNγ + LPS) bezeichnet, die dazu beitragen, die entzündliche Reaktion; (2) Makrophagen stimuliert mit Interleukin 4 (IL-4), M(IL-4), die mit dem Heilungsprozess verbunden sind; (3) Makrophagen stimuliert mit Immunkomplexe (IC) und LPS, M (IC + LPS), die die Fähigkeit haben, die entzündliche Reaktion2,3deaktivieren. M (IC + LPS) unterscheiden sich von M(IL-4) Wundheilung Makrophagen und nicht ausdrücken, das Enzym Arginase (Arg-1) oder FIZZ14. Der beste Marker für diese entzündungshemmende Makrophagen ist ihre Zytokin-Produktion-5. Makrophagen haben mehrere Rollen bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit, aber auch zu entzündlichen Erkrankungen und Krebs3beitragen. Aus diesem Grund sind Makrophagen eine wichtige therapeutische Ziel für die Behandlung von einer Vielzahl von Krankheiten. Es ist wichtig zu untersuchen, die Auswirkungen von Antikörpern auf ihren Aktivierungsstatus zu Makrophagen-basierte Therapien für Krankheiten zu entwickeln.
Dieses Dokument konzentriert sich auf die Verwendung von murinen Knochenmark abgeleitet Makrophagen (BMDMs) und peritonealen Makrophagen, die Wirkung von Antikörpermedikamente auf Entzündungsreaktionen in Vitro und in Vivozu testen. Vor kurzem gab es mehrere Studien, die zeigen der Auswirkungen von Antikörpern auf Makrophagen Aktivierung6,7,8. Gemeinsam mit Immun-komplexe, die Antikörper mit einem Antigen und LPS, normalerweise Entzündungsreiz komplexiert sind aktiviert Makrophagen produzieren sehr hohes Maß an den Anti-inflammatorische Zytokine IL-10 und sehr niedrige Niveaus von Pro-inflammatorischen Zytokinen, Interleukin 12 (IL-12)9. In Addition, Infliximab, ein monoklonaler Antikörper gegen TNF zur Arbeit, zum Teil durch Induktion entzündungshemmende Makrophagen durch seine Fragment kristallisierbares (Fc) Region7festgestellt wurde. Wir haben berichtet, dass IVIg + LPS entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung, die ähnlich M (IC + LPS) induzieren, wobei Co stimulierte Makrophagen produzieren große Mengen von IL-10 und geringe Mengen an die Untereinheit Pro-inflammatorische Zytokin Interleukin-12 oder 23 p40 ( Il-12/23p40), Interleukin-6 (IL-6) und TNF-8. IVIg ist ein Medikament, bestehend aus polyclonal Antikörper vor allem IgG, die aus dem Blut von mehr als 1.000 Spender10gebündelt hat. Es wird zur Behandlung einer Vielzahl von Immunkrankheiten wie idiopathische thrombozytopenische Purpura und chronische demyelinisierende Polyneuropathie, aber sein Wirkmechanismus ist nicht vollständig verstanden11. Die Auswirkungen der Antikörpermedikamente basierend auf Makrophagen Aktivierung können beurteilt werden, hierin beschriebene Methoden verwenden.
Die Auswirkungen von spezifischen Biologics auf Makrophagen Aktivierung können in BMDMs und peritonealen Makrophagen getestet werden. Mit Hilfe dieser Makrophagen Quellen ermöglicht Bewertung von Primärzellen. Vorläufige Tests von Antikörpern auf kultivierten Primärzellen erfordert weniger Zeit und finanzielle Investition als andere Zeit- und kostenintensiv Krankheitsmodelle. Durch Einspritzen eines Medikaments in einem gesunden Maus in Vivo, und die Zellen zu isolieren und ex Vivozu analysieren, kann man feststellen, ob Studien gerechtfertigt sind, um zu beurteilen, ob die Behandlung mit Biologics Makrophagen Aktivierung in Krankheitsmodellen betrifft.
Unsere Techniken bieten nur wenige Studien die Wirkung von biologischen Therapien auf Makrophagen Aktivierung in Vitro und in Vivo direkt testen einen Vorteil gegenüber alternativen Techniken. Aktuelle Techniken beinhalten Tests biologischen Drogenwirkungen auf gemischte Zelle Bevölkerungen in Vitro, wie z. B. die Wirkung von Infliximab in einem gemischten Lymphozyten Reaktion (MLR) oder IVIg auf menschliche Makrophagen in peripheren mononukleären Blutzellen, wo die Wirkung kann nicht auf eine bestimmte Zelle Typ7,12zurückführen. Mit BMDMs und peritonealen Makrophagen ist vorteilhaft gegenüber der Verwendung von Zelllinien, wie RAW264.7 Zellen, die nicht die Pro-inflammatorische Zytokine produzieren, IL-12, als Reaktion auf LPS8,13. Testen die Wirkung von einem Antikörper-basierten Medikament auf Makrophagen Antworten ex Vivo hat Vorteile, weil direkt auf Makrophagen Cytokine Reaktionen zurückführen lassen, anstatt herleiten von Makrophagen Antworten durch die Messung der Serumspiegel Zytokin14 . BMDMs und peritonealen Makrophagen können abgeleitet und von genetisch veränderten Mäusen zu bestimmen, die spezifische Rolle eines Proteins in entzündungshemmende Makrophagen Aktivierung isoliert. Wir haben z. B. Il10 mangelhaft(- / -) BMDMs zu zeigen, dass IVIg-induzierte Verringerung der Produktion von Pro-inflammatorischen Zytokinen IL-108teilweise abhängig ist. Ein Medikament Wirkmechanismus untersucht werden kann verwenden westliche Beflecken, wo die Rolle der spezifischen Proteine und Signalisierung Ereignisse ermittelt werden kann. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) kann durchgeführt werden, auf BMDMs oder peritonealen Makrophagen Muster der Genexpression zu zeigen, die durch Antikörper Aktivierung entstehen. Krankheitsmodelle bei Mäusen bieten Informationen über die mögliche Wirksamkeit von Antikörper-basierten biologischen Therapien in Modellen für Erkrankungen wie entzündliche Darm-Krankheit, rheumatoide Arthritis und Krebs15,16, 17. jedoch die hier beschriebenen Techniken informieren über den Wirkmechanismus von diese Biologics durch die Bestimmung, ob sie entzündungshemmende Makrophagen-Aktivität induzieren.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of British Columbia genehmigt.
(1) Knochenmark Makrophagen Ableitung und Aktivierung mit Antikörpern
- Führen Sie Sterbehilfe mit CO2 Erstickung.
- Statt Maus Induktion Kammer. Einschläfern Sie Maus mit 5 % Isoflurane Narkose, für 60-90 s, bis unbeweglich und atmen tief und langsam ist.
- Isofluran-Narkose schalten Sie und verwalten Sie ca. 6-8 L/min CO2 bis Maus atmen aufgehört hat. Lassen Sie Maus mit CO2 für mindestens weitere 5 min. überprüfen, dass es nicht mehr ein Herzschlag oder Atmung. Führen Sie eine zervikale Dislokation um Tod zu gewährleisten.
Hinweis: 8-12 Wochen alte Mäusen bieten den höchsten Ertrag von Makrophagen.
- Spray Maus Beine mit 70 % Ethanol und Pin, die sie mit Armen und Beinen in Rückenlage auf eine Dämmplatte verteilt. Machen Sie mit Schere und Pinzette die Haut halten einen flachen Schnitt (0,2 cm), die Haut und das Fell von der Oberfläche eines jeden der Hinterbeine zu entfernen.
Hinweis: Führen Sie dieses Verfahren und alle Gewebekultur Manipulationen in einer sterilen Kapuze. - Schneiden Sie Muskel um Tibien und Oberschenkelknochen sichtbar zu machen. Entfernen Sie die Schienbeine und Oberschenkelknochen, durch Schneiden von Knochen und Muskeln unterhalb des Hüftgelenks und über den Knöcheln. So viele Muskeln wie möglich abschneiden.
- Sprühen Sie Knochen mit 70 % Ethanol und warten Sie 1 Minute zu verdunsten, dann legen Sie sie in 6-well-Platte Knochen bündig Medium (Iscoves modifizierte Dulbecco Medium (IMDM), 10 % fetalen bovine Serum (FBS)).
- Schneiden Sie die Enden der Knochen von 0,1 cm des Knochens aus die Knöchel und die Oberseite des Oberschenkelknochens schneiden, so dass der Knochenhohlraum ausgesetzt ist. Sicherstellen Sie, dass das Knochenmark sichtbar ist und eine 26 Gauge-Nadel in den Knochenhohlraum platziert werden kann.
- Schneiden Sie die Knochen und Muskeln, die Schienbeine und Oberschenkelknochen aus den Kniegelenken zu trennen. Legen Sie eine 26 Gauge-Nadel befestigt, eine 10 mL Spritze in den Hohlraum. Spülen Sie das Knochenmark in ein 50 mL konische Röhrchen mit 5 mL des Knochens bündig mittlere. Spülen Sie zwei Schienbeine und zwei Oberschenkelknochen von einem einzigen Mausklick in jede 50 mL Tube.
- Pipette nach oben und unten mehrere Male oder Wirbel das Knochenmark mit langsamer Geschwindigkeit, Klumpen behutsam zu zerstreuen. Strings von Knochenmark sollte in klein (weniger als 0,5 mm) Flecken von Knochenmark aufgeteilt werden. Füllen Sie das konische Rohr bis 50 mL mit Knochen bündig mittlere. Pipette Inhalt des konischen Rohres in einer Gewebekultur 75 cm2 behandelt Kolben und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 für 1 h.
Hinweis: Ältere Makrophagen und mesenchymalen Zellen werden an den Kolben und verworfen werden, während die gewünschte hämatopoetischen Vorläuferzellen in der Schwebe bleiben. - Das Medium mit hämatopoetischen Vorläuferzellen in ein 50 mL konische Röhrchen Pipette. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 300 X g bei Raumtemperatur für 5 min. verwerfen den Überstand und das Pellet in 5 mL Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (MCSF) Kulturmedium Aufschwemmen (IMDM, 10 % FBS, 5 ng/mL MCSF und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin 150 μM Monothioglycerol (MTG)).
- Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer18. Fügen Sie Medium, um Zellen zu einer Konzentration von 0,5 x 106 Zellen/mL, 1, 5 x 107 Zellen/Kolben in 30 mL Medium, Aufschwemmen und pipette vorsichtig nach oben und unten hinzu. Pipette 30 mL der Suspension in eine neue 75 cm2 Gewebekultur behandelt Kolben.
- Am Tag 4 und 7. Tag nach der ursprünglichen Kultur im Schritt 1,9 überprüfen Sie die Zellen anhaftende und leicht verzweigt mit einem invertierten Phase Kontrast Hellfeld-Mikroskop. Entsorgen Sie das Medium mit den nicht-anhaftende Zellen. Waschen Sie die Zellen mit IMDM einmal und 30 mL MCSF Kulturmedium.
- Wenn die Zellen sind Reifen von Tag 10 (> 95 % positiv für F4/80 und Mac-1), noch einmal überprüfen, ob die Zellen sind Anhänger und leicht.
- Platte Zellen für Stimulationen, das Kulturmedium aus der Flasche zu entfernen und Hinzufügen von 8 mL Enzym frei, EDTA-basierte Zelle Dissoziation Puffer (Table of Materials). Inkubieren Sie die Zellen für 5 min bei 37 ° C, 5 % CO2.
- Kratzen Sie Zellen sanft, mit einer kleinen Menge des Drucks, mit einem sterilen Zelle Schaber. Check-in das Mikroskop, das Zellen von der Oberfläche der Küvette getrennt haben. Pipette dissoziiert Zellen in ein 50 mL konische Röhrchen. Spülen Sie den Kolben 3 Mal mit 5 mL IMDM und bündeln Sie die Spüllösung mit Zellen, die geerntet wurden. Zentrifugieren Sie Zellen bei 300 X g bei Raumtemperatur für 5 min.
- Die Zelle Pellet in 3 mL MCSF Kulturmedium pro 50 mL konische Röhrchen aufzuwirbeln. Anzahl vitaler Zellen mit einem Hemocytometer18. Zellen in einer Konzentration von 1 x 106 Zellen/mL und Platte 100 μl Zellsuspension (1 x 105 Zellen/Na) pro Bohrloch einer 96-Well Gewebekultur behandelt, flache Bodenplatte aufzuwirbeln.
Hinweis: Knochen aus einem einzigen Mausklick erzeugt genügend Zellen für 100 Brunnen. Auf Wunsch können 1 mL der Zellen in einem 6-Well-Platte (Gewebekultur behandelten, flacher Boden) überzogen. Eine größere Anzahl von Zellen (1 x 106 ) kann für western-Blot Analysen nützlich sein. - Sobald anhaftende, doppelte oder dreifacher Brunnen jeweils mit 10 ng/mL von LPS in IMDM, 30 mg/mL IVIg, oder IVIg + LPS zu stimulieren. Dosen von LPS oder IVIg können titriert werden, um Antworten zu optimieren. Doppelte oder dreifacher Brunnen als unstimulierte Steuerelemente zu verlassen. Inkubieren sie für 24 h (37 ° C, 5 % CO2).
Hinweis: Neu vergoldete Zellen sollte Gewebekultur Brunnen innerhalb 1 h entsprechen. - Sammeln Sie Zelle Überstände jede Vertiefung in einzelnen 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen und entfernen Sie Partikel enthält durch Spinnen bei 10.000 x g für 5 min.
- Entfernen Sie die Zelle überstand und nicht zu stören das Pellet. Ort der geklärte Zelle in einem sterilen Microcentrifuge Schlauch überstand.
Hinweis: Zelle Überstände können Zytokine IL-10 und Zytokin-Untereinheit, IL-12 / 23p 40, durch Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) sofort untersucht, oder bei-80 ° C langfristig gelagert. Folgen Sie ELISA Protokoll von kommerziell erhältlichen Kit (Table of Materials). Andere Pro-inflammatorische Zytokine kann geprüft werden, wie IL-6 und TNF, wie auch sie durch Behandlung mit IVIg sinken + LPS Stimulation im Vergleich zur Stimulation mit LPS allein. Nach der Stimulation können Techniken wie westliche Beflecken oder quantitative Polymerase-Kettenreaktion (Q-PCR) 19,20adhärente Zellen vorbereitet sein.
(2) herausfordernd Mäuse In Vivo mit IVIg und Ernte peritoneale Makrophagen
- Wiegen Sie jede Maus.
Hinweis: zum Beispiel ist bei einer Maus 20 g 500 µL IVIg erforderlich.
Hinweis: Führen Sie die Prozedur in einer sterilen Kapuze.
Hinweis: Legen Sie die Nadel vorsichtig in der Maus, so dass Sie PBS nicht in die Organe, sondern vielmehr in den peritonealen Raum injizieren.
Hinweis: Für jede 5 mL Flüssigkeit injiziert, wird etwa 3,75 mL wiederhergestellt werden.
Hinweis: Nach der letzten Injektion kann es einfacher sein, die Flüssigkeit von den weit linken und rechten Seiten der Maus, extrahieren wo Flüssigkeit angesammelt hat. Die Organe werden weniger Interferenzen mit der Nadel an dieser Stelle führen.
Hinweis: Die Makrophagen werden etwas größer als die anderen peritonealen Zellen. Typische Ausbeute ist 5 x 105 - 1 x 106 Makrophagen/Maus mit einem Wildtyp-C57BL/6-Maus.
Optional: Wenn eine große Anzahl von roten Blutkörperchen in der Zelle Pellet vorhanden sind, führen Sie einen Lyse Schritt um sie zu entfernen, mit 1 X roter Blutkörperchen Lyse Puffer nach Anweisungen des Herstellers.
Hinweis: Es möglicherweise notwendig, Pool Zellen von mehr als eine Maus für ein Experiment, wenn mit dreifacher Brunnen oder Titration Stimulanzien. Zum Beispiel wenn eine Maus 5 x 105 Makrophagen hatte, wäre 500 μL der Beschichtung Medium erforderlich. Gäbe es genügend Zellen für 5 Brunnen oder 1 Experiment in zweifacher Ausfertigung mit einer Dosis von LPS.
Hinweis: Nach Stimulation können adhärente Zellen Techniken wie western-Blot oder PCR vorbereitet sein.
(3) herausfordernd Mäuse in Vivo mit IVIg + LPS und Ernte peritoneale Makrophagen
- Wiegen Sie jede Maus. Berechnen Sie das Volumen der IVIg (Lager Konzentration 100 mg/mL) benötigt, um eine endgültige Dosis von 2,5 g/kg Körpergewicht bereitzustellen. Berechnen Sie die Höhe der LPS (100 μg/mL Konzentration Lager in IMDM) benötigt, um eine endgültige Dosis von 0,2 μg/g Körpergewicht bereitzustellen.
Hinweis: zum Beispiel ist für eine Maus 20 g 500 µL der Stammlösung IVIg und 40 μl einer 100 μg/mL Lösung von LPS erforderlich. - Zeichnen Sie die erforderliche Menge an IVIg und LPS in eine sterile 1 mL Spritze, ausgestattet mit einem sterilen 26 gauge Nadel. Ersetzen Sie für Kontroll-Mäusen, die nicht IVIg erhalten gleichwertigem Umfang von IVIg mit sterilen PBS pH 7.4.
- SCRUFF die Maus mit einer Hand durch seine Haut an der Rückseite des Halses mit Daumen und Zeigefinger greifen und hielt seinen Schweif und Hinterbeine mit den restlichen Fingern. Neigen Sie ihren Körper auf den Boden.
- Ort die Nadel in einem Winkel von 30-40° im Verhältnis zu der Maus Bauch, im unteren rechten Quadranten, Fase, und fügen Sie 1,5 cm. Spritzen die IVIg + LPS, oder PBS + LPS, intraperitoneal wie in Schritt 2.4.
- Ernten Sie nach 1h peritoneale Makrophagen durch Schritten 2,5-2.10.
- Spin-down Zellen bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. 1 mL der wiederhergestellten Lavage-Flüssigkeit zu entfernen und IL-10 und IL-12 / 23p 40 Analysen von ELISA nach Herstellerangaben verwenden oder Einfrieren bei-80 ° C für zukünftige Analysen.
Hinweis: Um genauer Vergleich zwischen den Behandlungen für Lavage Fluid Zytokin Analyse zu gewährleisten, führen Sie 5 mL Flushs von der Bauchhöhle 4 Mal für ein finales Volumen von 15 mL. Nicht alle Flüssigkeit wird aus jeder Spülung wiederhergestellt werden. - Wie in Schritt 2.11 Aufschwemmen und tragfähige Makrophagen zu zählen.
Hinweis: Die Makrophagen werden etwas größer als die anderen peritonealen Zellen.
Optional: Wenn eine große Anzahl von roten Blutkörperchen in der Zelle Pellet vorhanden sind, führen Sie einen Lyse Schritt nach Herstellerangaben zu entfernen, wie in Schritt 2.11.
Hinweis: Es möglicherweise notwendig, Pool Zellen von mehr als eine Maus für ein Experiment. Zum Beispiel wenn eine Maus 5 x 105 Makrophagen hatte, wäre 500 μL der Beschichtung Medium erforderlich.
Hinweis: Proben können sofort verwendet oder eingefroren und bei-80 ° C für die Zytokin-Analyse von ELISA gespeichert.
Hinweis: Zellen können Techniken wie western-Blot oder PCR, wie in den Schritten 1.16 1.17 und 2.14 vorbereitet werden.
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Representative Results
Murine Knochen Knochenmark abgeleitet Makrophagen können aus Vorstufen der blutbildenden Zellen im Knochenmark Aspiraten kultiviert werden. Knochenmark Aspiraten gebündelt in der Regel vom Oberschenkelknochen und Gebeinen der Mausklick C57BL/6 Ertrag 107 Knochenmark abgeleitet Makrophagen, so dass sie eine günstige Quelle von Makrophagen für Experimente. BMDMs kann verwendet werden, basieren Medikament Antikörperantworten als mit einem Entzündungsreiz in Vitroherausgefordert zu testen. Abbildung 1 zeigt, dass IVIg-Marke Gammunex (GX) + LPS erhöht die Produktion von der Anti-inflammatorische Zytokine IL-10, 7-fach im Vergleich zu LPS Stimulation allein (Abb. 1A) und sinkt die Produktion von IL-12/23 p 40 (Abbildung 1 B). Abbildung 1 zeigt auch, dass verschiedene IVIg-Präparate anders durchführen. Obwohl die drei verschiedenen Zubereitungen von IVIg IL-12/23 p 40 deutlich (Abbildung 1B), Octagam (OG) und Gammagard verringern können Flüssigkeit (GL), IL-10 Produktion als Reaktion auf LPS (Abbildung 1 nicht deutlich steigern ( A). OG und GL sind in der Lage, IL-12/23 p 40 Produktion als Reaktion auf LPS, aber in geringerem Maße als GX deutlich zu reduzieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass Antikörper Affekte Knochenmark Makrophagen Aktivierung abgeleitet und gibt es Unterschiede zwischen den Vorbereitungen für das gleiche Medikament, das Veränderungen in Reaktionen hervorrufen können.
BMDMs kann verwendet werden, um die mechanistische Effekte von IVIg, durch westliche Beflecken zu testen. Mit IC + LPS aktiviert Makrophagen stiegen die Phosphorylierung von der Mitogen aktiviert (MAP) Proteinkinasen, p38 und Erk1/2, die für erhöhte IL-10 Produktion21verantwortlich sind. Ergebnisse in Abbildung 2 zeigen eine typische western-Blot, MAP-Kinase-Aktivierung erforderlich für die Produktion von IL-10 durch Makrophagen, die unstimulierte, oder wurden mit LPS, IVIg, oder IVIg + LPS stimuliert zu erkennen. IVIg Stimulation allein oder IVIg + LPS Co Stimulation erhöht Aktivierung der MAP-Kinasen Erk1/2, mit früheren und lang anhaltenden Phosphorylierung im Vergleich dazu mit LPS allein gesehen. Aktivierung der p38 erfolgte früher in Makrophagen stimuliert mit IVIg + LPS im Vergleich zu denen stimuliert mit LPS allein. Diese Ergebnisse zeigen, dass Methoden, wie westliche Beflecken, zum darstellen von Zelle signalisieren Auswirkungen der Antikörpermedikamente auf BMDMs. Neben der Produktion von Zytokinen kann MAP Kinase Aktivierung verwendet werden, zu zeigen, dass anti-entzündliche Makrophagen Aktivierung stattgefunden hat.
Reife, resident Gewebe Makrophagen können auch isoliert werden von Mäusen, um Antworten auf IVIg 5.0 x 105 bewerten - 1.0 x 106 peritonealen Makrophagen können von einem gesunden C57BL/6-Maus isoliert werden. In Abbildung 3peritoneale Makrophagen von Mäusen injiziert mit IVIg IL-10 Produktion in Ermangelung der Stimulation in Vitro, im Vergleich zu PBS injiziert Mäuse nicht erheblich erhöhen. Wenn peritoneale Makrophagen von IVIg injiziert Mäuse sind mit LPS ex Vivostimuliert, sie produzieren 6-fold mehr IL-10 als Mäuse injiziert mit PBS. Sie produzieren jedoch nicht nachweisbare Mengen von IL-12/23 p 40 wenn mit LPS ex Vivostimuliert. Diese Ergebnisse zeigen, dass Antikörper Effekte auf Makrophagen durch Injektion von Drogen in Vivo und Kultivierung von Zellen Ex Vivo mit dieser Methode getestet werden können.
Makrophagen Antworten auf Antikörper und entzündliche Reize können bewertet in Vivo. Produktion von Zytokinen im Lavage Fluid beurteilt werden kann und in Überstände von ex-Vivo peritoneale Makrophagen stimuliert. Abbildung 4 zeigt die Anti-inflammatorische Zytokine IL-10 wird erhöht Lavage Fluid (Abb. 4A), peritonealen Zellen (Abbildung 4B) und peritonealen Makrophagen (Abb. 4C) Wenn Mäuse stehen vor der Herausforderung mit IVIg + LPS im Vergleich zu PBS + LPS. Produktion von Pro-inflammatorischen Zytokinen Untereinheit, IL-12 / 23p 40, wird in kultivierten peritonealen Makrophagen, aber nicht in Lavage-Flüssigkeit deutlich reduziert. Diese Methode ermöglicht eine Antikörper-Wirkstoff-Auswirkungen auf Entzündungsreaktionen in Vivo und Ex Vivo.
Abbildung 1 : Makrophagen IL-10 und IL-12 / 23p 40 Produktion als Reaktion auf Co Stimulation mit verschiedenen Marken von IVIg und LPS. C57BL/6 MCSF Knochenmark abgeleitet Makrophagen waren entweder unstimulierte (C) oder mit LPS stimuliert (10 ng/mL), IVIg (30 mg/mL) oder IVIg + LPS. Drei verschiedene Marken von IVIg getestet wurden: Gammunex (GX), Gammagard Flüssigkeit (GL) und Octagam (OG). Makrophagen Überstände wurden gesammelt von 24 h nach der Stimulation und durch Zentrifugation geklärt. ELISAs für IL-10 (A) und IL-12/23 p 40 (B) wurden durchgeführt. Daten sind für Makrophagen aus n = 3 unabhängige Experimente mit Zellen aus 1 einzelnen Maus pro Experiment mit ELISAs untersucht in zweifacher Ausfertigung. Daten sind Mittel ± SD. *P < 0,05, ** P < 0,001 ***P < 0,0001 für den Vergleich zwischen LPS Stimulation und IVIg + Co Stimulation LPS. One-Way Varianzanalyse (ANOVA) mit Tukey nach dem Test für multiple Vergleiche wurden für statistische Auswertungen verwendet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Western-Blot Analyse der MAP-Kinase-Aktivierung in IVIg-aktivierten Makrophagen. MCSF abgeleitet Knochenmark Makrophagen waren unstimulierte oder mit LPS stimuliert (10 ng/mL), GX IVIg (30 mg/mL) oder GX IVIg + LPS; für 0, 10, 40 oder 120 min. ganze Zelle Lysates (1,0 x 106 Makrophagen/Bahn), Sodium Dodecyl Sulfat-Polyacrylamid ausgesetzt waren gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) und Western Blot mit Phospho-spezifische Antikörper für p38 und extrazellulären Signal-regulierte Kinase (Erk1/2), als auch Glyceraldehyde-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), als ein Steuerelement laden. Die dargestellten Ergebnisse sind repräsentativ für n = 3 unabhängige Experimente mit Zellen aus 1 einzelnen Maus pro Versuch.Densitometrie für pp38 und pErk1/2 Proteingehalte, normiert auf GAPDH, im Durchschnitt von 3 unabhängigen Experimenten werden unterhalb jedes Bandes gezeigt. Diese Zahl wurde von Kozicky Et al.8geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Produktion von IL-10 durch Makrophagen von Mäusen mit IVIg in Vivoin Frage gestellt. 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen erhielten intraperitoneal sterile PBS (Einspritzregelung) oder GX IVIg (2,5 g/kg). Nach 1 h Mäuse wurden eingeschläfert und peritonealen Lavages wurden durchgeführt. Peritoneale Makrophagen wurden isoliert mit Einhaltung der Auswahl. Makrophagen waren entweder unstimulierte (C) oder mit LPS stimuliert (10 ng/mL). Zelle Überstände wurden geerntet und nach 24 h für IL-10 ELISAs geklärt. Daten sind von n = 5 einzelnen Mäusen pro Gruppe in 3 unabhängigen Experimenten mit ELISAs durchgeführt untersucht in zweifacher Ausfertigung. Daten sind Mittel ± SD. * P < 0,01 und NS = nicht signifikante. Statistische Analysen wurden mit einem Two-Way ANOVA mit Sidaks Schülerergebnisse für multiple Vergleiche durchgeführt. Diese Zahl wurde von Kozicky Et al.8geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : IL-10 und IL-12 / 23p 40 Produktion von Mäusen mit IVIg + LPS herausgefordert in Vivo. 8 Wochen alten C57BL/6 Mäusen wurden intraperitoneal mit entweder PBS + LPS (0,2 µg/g Körpergewicht), als ein Steuerelement injiziert; oder GX IVIg (2,5 g/kg Körpergewicht) + LPS (0,2 µg/g Körpergewicht). Nach 1 h Mäuse wurden eingeschläfert und peritonealen Lavages wurden durchgeführt. (A) aufgeklärt Lavage Fluid, (B) geklärt konditionierten Überstände aus peritonealen Zellen in einem 1 h Makrophagen Einhaltung Schritt, und (C) geklärt 24 h peritonealen Makrophagen (Mφ) Überstände wurden geprüft für IL-10 und IL-12 / 23p 40 von ELISA. Daten sind Mittel ± SD für n = 5 Mäusen in 3 unabhängigen Experimenten mit ELISAs untersucht in zweifacher Ausfertigung. P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und NS = nicht signifikante. Mäuse injiziert mit PBS + LPS wurden mit Mäusen injiziert mit IVIg + LPS mit ein Student t -Test verglichen. Diese Zahl wurde von Kozicky Et al.8geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Makrophagen Aktivierung Staaten spielen eine wichtige Rolle in beiden Gewebe Homöostase und Krankheit22. Makrophagen können unterschiedliche sowie überlappende Aktivierungsstatus abhängig von Cues in ihrer Mikroumgebung3haben. Sie haben unterschiedliche Rollen in allen Phasen der Entzündungsreaktion: Verteidigung gegen Krankheitserreger, Wunde heilen und Gewebe Restitution und haben auch eine ausgeprägte entzündungshemmende Aktivierungsstatus, die wichtig für das Ausschalten der entzündlichen Reaktion2 . Anti-inflammatory Makrophagen Aktivierung erfordert zwei äußere Reize für Makrophagen produzieren hohe Mengen an den Anti-inflammatorische Zytokine IL-10 und geringe Mengen an Pro-inflammatorische Zytokine wie IL-12-23. Ein Signal kommt von Antikörpern durch Fc-Gamma-Rezeptoren, und das zweite Signal ist ein Pro-inflammatorischen Stimulus wie LPS oder IFNγ24,25. Serum, Immunkomplexe und Anti-TNF-Antikörper wurden alle induzieren eine hohe IL-10-Produing entzündungshemmende Aktivierungsstatus in Makrophagen8,23,25,26gefunden. Unsere Fraktion hat zuvor veröffentlicht, dass murinen Knochenmark Makrophagen abgeleitet und stimuliert mit IVIg peritoneale Makrophagen auch hohe Mengen an IL-10 und wenig bis keine Pro-inflammatorischen IL-12 / 23p 40 als Reaktion auf LPS8 produzieren. Wir haben auch festgestellt, dass andere Pro-inflammatorische Zytokine, TNF und IL-6 auch von IVIg im Knochenmark abgeleitet Makrophagen8reduziert werden. Die hier beschriebenen Methoden können angewendet werden, um andere Antikörperantworten basierten Medikament BMDMs Maus peritonealen Makrophagen in Vitro und in Vivozu testen.
Es gibt viele wichtige Schritte in Tests Antikörper-basierten Therapeutika auf Maus Knochenmark und peritonealen Makrophagen. Sterilität ist wichtig für jedes Protokoll. Wenn Makrophagen Kulturen mit Mikroorganismen aus der Luft, Fell oder Kot von Mäusen kontaminiert sind, werden die Makrophagen durch Herstellung von Pro-inflammatorischen Zytokinen auf diese Reize reagieren. Alle Experimente in eine biologische Kabinett, sprühen die Maus großzügig mit Ethanol und Gewährleistung der Integrität des Darms während peritonealen Leerungen sind unerlässlich. Der Antikörper muss auch steril und nach Anweisungen des Herstellers aufbewahrt werden. Es kann nicht verwendet werden, wenn es kontaminierten, abgelaufen oder trübe ist. Trübung verringert sich die Wirksamkeit des Medikaments und kann auftreten, wenn das Medikament nicht bei der richtigen Temperatur gelagert ist oder zu lange gelagert wurde. IVIg kann bei 4 ° C gelagert und nur verwendet werden, bevor das Ablaufdatum erreicht ist, da die Ebenen der IL-10 Produktion beeinflusst werden können. Alternativ haben wir gesehen, dass es bei-20 ° C ohne Auswirkung auf Antworten eingefroren werden kann. Verschiedene Partien IVIg führen zu ähnlichen experimentellen Ergebnissen, während verschiedene Arten von IVIg Marke Vorbereitungen, wie in Abbildung 1, dazu, dass unterschiedliche Reaktionen in Makrophagen führen können. Ätherische steuert, wie unstimulierte Zellen und Zellen stimuliert mit Antikörper allein, müssen in jedem Experiment, um die Kontamination von Makrophagen oder das Medikament auszuschließen aufgenommen werden.
Mehrere Änderungen können auf diese Protokolle erfolgen, um ein Experiment anzupassen. Es kann im nicht entzündeten Zustand schwierig, genügend peritonealen Makrophagen für große Experimente zu isolieren. Peritoneale Makrophagen können durch intraperitoneale Injektion von Thioglykollat (TG) ausgelöst werden. Eine Immunantwort tritt können, und nach 4 Tagen, berührungsempfindliche peritoneale Makrophagen geernteten27. Die rekrutierten Makrophagen möglicherweise weniger ausgereift und residente Zellen nicht darstellen, wie wir hier verwendet haben, die wichtige Überlegungen sind. TG-entlockte Makrophagen können Agar aus der TG-Brühe, die eine Komplikation sein können, insbesondere dann, wenn Experimente auf Phagozytose27, auch verinnerlicht. Mäuse aus verschiedene genetische Hintergründe, C57BL/6 oder BALB/c, können auch für Experimente verwendet werden und können gewählt werden, um die Auswirkungen von Antikörpern auf Makrophagen Antworten zu untersuchen, die in Krankheitsmodellen erfordern einen speziellen genetischen Hintergrund beurteilt werden. Darüber hinaus können genetisch veränderte Mäuse, wie Il10- / - Mäusen, verwendet werden, die Funktion spezifischer Proteine in den Wirkmechanismus eines Medikaments zu beurteilen, wie wir in unserer eigenen Arbeit8getan haben. Verschiedene entzündliche Reize können auch zur Bewertung der Auswirkungen von Antikörpern auf Makrophagen Aktivierung verwendet werden. IFNγ und Host abgeleitet Maut wie Rezeptor (TLR)-Agonisten (z. B. Hyaluronsäure), wurden zur Herstellung von IL-10 Makrophagen25,28zu aktivieren. Ein wichtiger Aspekt ist die Dosis des Antikörpers. Die Dosis sollte um die optimale Dosis in der Kultur und im Tierversuch zu erhalten titriert werden, da es zwischen Antikörpern sowie Lieferanten abweichen wird. Die Dosis gewählt, sollte auch die Dosis für den Menschen widerspiegeln und wird zwischen Drogen unterscheiden. IVIg wird als eine entzündungshemmende Therapie bei hohen Dosen (25-35 mg/mL oder 2 g/kg Körpergewicht), widerspiegelt die betitelten verwendeten diese Protokolle29,30Dosen gegeben.
Die Verwendung von Knochenmark und peritonealen Makrophagen haben Grenzen. Obwohl eine Verbesserung gegenüber der Makrophagen-Zelllinien sind Maus BMDMs noch künstlich abgeleitete Zellen von hämatopoetischen Vorläufer. Immune Antworten von Makrophagen in-vitro- Tests ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis Antikörperantworten, aber in Vivo Experimente sowie durchgeführt werden müssen. Injektion von Reizen in Vivo gefolgt von Zellen Ex VivoKultivierung, bieten weitere Informationen für zukünftige Studien zu untersuchen, ob Antikörper-basierte Medikamente auch entzündungshemmende Makrophagen in einen Krankheitszustand aktivieren können. Rückschlüsse auf was tritt bei Menschen empfangen von Antikörper-basierten Biologics können nicht aus diesen Experimenten gezogen werden. Nur wenige Studien wurden veröffentlicht, um die Auswirkungen von IVIg auf menschliche Monocyte abgeleiteten Makrophagen in Vitro. Eine Verringerung der Zahl von IL-6 Produktion von menschlichen Monozyten in Vitro gemeldet wurden, wenn IVIg mit LPS im Vergleich zur Stimulation mit LPS allein12Co angeregt wird. IVIg reduziert TNF und IL-6-Produktion bei Stimulation mit procalcitonin (PCT) in der THP-1 menschlichen monozytären Zellen31.
Die Protokolle innerhalb dieses Papier haben Vorteile gegenüber bestehenden Methoden. Knochenmark abgeleitet Makrophagen und peritoneale Makrophagen sind Primärzellen, direkt von Mäusen isoliert anstatt Zelllinien verewigt werden.Maus-Makrophagen-wie Zell-Linien wie RAW264.7 Zellen, produzieren nicht die Pro-inflammatorische Zytokin IL-12, als Reaktion auf LPS, das ist eine wichtige Zytokin, das von der IL-10 geregelt ist, die als Reaktion auf IVIg8,13produziert wird. Ein Medikament testen in Vivo mit LPS erlaubt die Untersuchung der Wirkung des Medikaments auf die lokalen peritonealen Umwelt durch Analyse der Lavage-Flüssigkeit, peritonealen Zellen und insbesondere peritonealen Makrophagen. Es ist eine kurzfristige, einfaches Modell, das wichtige Informationen um die Prüfung der unspezifischen Wirkungen von Antikörpern auf Makrophagen Aktivierung in länger und teurer Tiermodellen der Krankheit zu rechtfertigen. Es hat einen Vorteil gegenüber Endotoxämie Modelle wo die experimentelle Maßnahme oft nur Maus überleben oder Zytokine im Serum14ist. Überlebensraten und Serum Zytokine sind wertvolle Maßnahmen der Immunantwort, aber sie zeigen nicht dem Beitrag, dass Makrophagen speziell haben können. Isolierung und Kultivierung der peritonealen Makrophagen aus eine Herausforderung-Experiment zeigt einen direkten und messbaren Effekt, den Antikörper-Therapie auf Makrophagen Funktion haben kann.
Diese Methoden haben Anwendungen für die Prüfung und Gestaltung von biologischen Therapien. Die Verwendung von Antikörpern als Therapeutika hat in den letzten Jahren dramatisch zugenommen. Allerdings haben diese Therapien weitere unbekannte Effekte auf Makrophagen, die den Fc-Teil des Antikörpers erkennen und ändern ihre Produktion von Zytokinen. Der Anti-TNF-Antikörper Infliximab, hat gezeigt, dass induzieren IL-10 und T-Zell-Proliferation durch den Fc-Teil zu unterdrücken, und, als eines seiner Mechanismen der Aktion7,15,26vorgeschlagen wurde. Mit genetischen Modellen, können bestimmte Proteine in den Mechanismus der wie diese Medikamente Makrophagen Aktivierung beeinflussen impliziert. Klassen von IgG-Antikörpern und Vorbereitungen von Antikörpern können geändert werden, um ändern, wie Makrophagen von Biologics betroffen sind. Unsere Daten zeigen die Vorbereitung und/oder Lagerung von die gleichen Antikörper-Wirkstoff (IVIg) kann seine Wirkung auf Makrophagen Aktivierung auswirken. Die Methoden in diesem Papier lässt sich Therapien zu entwerfen, die nicht über diese Effekte, die möglicherweise entscheidend für die Aufrechterhaltung der Tumorüberwachung während Krebstherapien, wo vielleicht entzündungshemmende Makrophagen Tumorprogression zu fördern. Diese Techniken können auch verwendet werden, zu entwerfen und zu Drogen, die diese Effekte haben zu bewerten, wenn erwünscht. Beispielsweise ist es möglicherweise vorteilhaft für Makrophagen Entzündungsreaktionen zu reduzieren und entzündungshemmende IL-10-produzierenden Makrophagen zur Verbesserung der Behandlung von entzündlichen Darmerkrankungen oder rheumatoider Arthritis zu schaffen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.
Acknowledgments
L.k. ist der Empfänger von der University of British Columbia 4-Jahres-Stipendium (4YF) Diplom Zugehörigkeit Award. L.M.S ist der Empfänger der Canadian Association of Gastroenterology / Morbus Crohn und Colitis Kanada / CIHR neue Ermittler Gehalt Award und biomedizinische Stipendiat der Stiftung Michael Smith für die Gesundheitsforschung. Diese Arbeit wurde durch einen Projekt-Zuschuss von Canadian Blood Services in Zusammenarbeit mit der Canadian Institutes of Health Research unterstützt (gewähren # CIHR2016-LS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
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