Summary
Antilichaam gebaseerde drugs hebben een revolutie teweeggebracht in behandeling voor inflammatoire ziekten. Naast directe gevolgen hebben voor concrete doelstellingen, kunnen antilichamen macrofagen tot anti-inflammatoire activeren. Dit protocol beschrijft hoe anti-inflammatoire macrofaag activering kan worden beoordeeld in vitro met behulp van de muis het beenmerg macrofagen en in vivo, met behulp van peritoneale macrofagen.
Abstract
Macrofagen zijn fagocytische ingeboren immune cellen, die initiëren immuunresponsen ziekteverwekkers en bijdragen tot de genezing en weefsel teruggave. Macrofagen zijn even belangrijk in het uitschakelen van inflammatoire reacties. We hebben aangetoond dat macrofagen gestimuleerd met intraveneuze immunoglobuline (IVIg) grote hoeveelheden van de anti-inflammatoire cytokine, interleukine 10 (IL-10), en lage niveaus van pro-ontsteking cytokinen in reactie op bacteriële lipopolysacchariden produceren kunnen ( LPS). IVIg is dat een polyvalente antilichaam, voornamelijk immunoglobulin Gs (IgGs), gebundeld uit het plasma van meer dan 1.000 bloeddonoren. Het wordt gebruikt ter aanvulling van antistoffen bij patiënten met een immuun tekortkomingen of onderdrukken van de immuunrespons bij patiënten met auto-immune of inflammatoire voorwaarden. Infliximab, een therapeutische anti-tumor necrose factor alpha (TNFα) antilichaam, heeft ook aangetoond dat het activeren van de macrofagen voor de productie van IL-10 in reactie op inflammatoire stimuli. IVIg en andere antilichaam gebaseerde biologics kan worden getest om te bepalen hun effecten op de macrofaag activering. Dit document wordt beschreven methoden voor afleiding, stimulatie en beoordelingvan lymfkliertest beenmerg macrofagen geactiveerd door antilichamen in vitro en lymfkliertest peritoneale macrofagen geactiveerd met antilichamen in vivo. Tot slot tonen wij het gebruik van het westelijke bevlekken om te bepalen van de bijdrage van specifieke cel signalering emissieroutes naar de anti-inflammatoire macrofaag activiteit. Deze protocollen kunnen worden gebruikt met genetisch gemodificeerde muizen, om te bepalen van het effect van een specifieke expressie gebrachte eiwitten op anti-inflammatoire macrofaag activering. Deze technieken kunnen ook worden gebruikt om te beoordelen of specifieke biologics optreden kan door macrofagen omzetten in een IL-10-producerende anti-inflammatoire activeringsstatus die inflammatoire reacties- in vivo vermindert. Dit kan informatie verschaffen over de rol van macrofaag activering in de werkzaamheid van biologics tijdens ziekte modellen in muizen, en bieden inzicht in een potentiële nieuwe werkingsmechanisme bij mensen. Omgekeerd, dit kan waarschuwen tegen het gebruik van specifieke antilichamen gebaseerde biologics voor de behandeling van besmettelijke ziekten, vooral als de macrofagen spelen een belangrijke rol in de verdediging van de gastheer tegen die infecties.
Introduction
Macrofagen zijn ingeboren immune cellen, die meerdere rollen in de immuunrespons op infectie of verwonding spelen. Macrofagen zijn verantwoordelijk voor het initiëren van een immuunrespons op infectie of weefsel schade, stoppen de ontstekingsreactie, en bevordering van de helende reactie1. Voorbeelden van de best bestudeerde macrofaag activering statussen zijn: 1) macrofagen, behandeld met interferon gamma (IFNγ) en bacteriële lipopolysaccharide (LPS), M (IFNγ + LPS), aangewezen die bijdragen tot de inflammatoire respons; 2) macrofagen gestimuleerd met Interleukine (IL-4), 4 M(IL-4), die geassocieerd met de helende reactie worden; 3) macrofagen gestimuleerd met immuuncomplexen (IC) en LP's, M (IC + LPS), die de mogelijkheid hebben om het uitschakelen van de ontstekingsreactie2,3. M (IC + LPS) onderscheiden van M(IL-4) wond genezing van macrofagen, en doen niet uiten het arginase enzym (Arg-1) of de FIZZ14. De beste teller voor deze anti-inflammatoire macrofagen is hun cytokine productie5. Macrofagen hebben meerdere rollen bij het handhaven van de gezondheid, maar ook bijdragen tot inflammatoire ziekten en kanker3. Hierdoor zijn de macrofagen een belangrijk therapeutisch doel voor de behandeling van een breed scala van ziekten. Het is belangrijk om te onderzoeken van de effecten van antilichamen op hun activeringsstatus te ontwikkelen macrofaag gebaseerde behandelingen voor ziekte.
Dit document richt zich op het gebruik van lymfkliertest beenmerg afgeleid macrofagen (BMDMs) en peritoneale macrofagen voor het testen van het effect van antilichaam drugs op inflammatoire reacties in vitro en in vivo. Onlangs, zijn er meerdere studies waaruit blijkt van de effecten van antilichamen macrofaag activering6,7,en8. Macrofagen mede geactiveerd met immuuncomplexen, die antilichamen complexvorm met een antigeen, en LP's, een normaal inflammatoire prikkel, produceren zeer hoge niveaus van anti-inflammatoire cytokine, IL-10, en zeer lage niveaus van de pro-inflammatoire cytokine, interleukine 12 (IL-12)9. In toevoeging, infliximab, een monoclonal antilichaam tegen TNFα, te werken, ten dele door de anti-inflammatoire macrofagen via haar fragment crystallizable (Fc) regio7inducerende is gebleken. We hebben gemeld dat IVIg + LPS veroorzaken anti-inflammatoire macrofaag-activering dat is vergelijkbaar met M (IC + LPS), waarin mede gestimuleerde macrofagen produceren grote hoeveelheden van IL-10 en lage bedragen van de pro-inflammatoire cytokine subeenheid interleukine 12 of 23 p40) Il-12/23p40), Interleukine-6 (IL-6) en TNF8. IVIg is een drug die bestaat uit polyclonal antilichamen, voornamelijk IgG, die uit het bloed van meer dan 1.000 donoren10heeft zijn gebundeld. Het wordt gebruikt voor de behandeling van een breed scala aan immunologische ziekten, zoals idiopathische trombocytopenische purpura en chronische demyeliniserende polyneuropathie, maar zijn werkingsmechanisme is niet volledig begrepen11. De effecten van antilichaam gebaseerd drugs op macrophage activering kunnen worden geschat aan de hand van de beschreven methoden hierin.
De effecten van specifieke biologics op macrophage activering kunnen worden getest in BMDMs en peritoneale macrofagen. Met deze macrofaag-bronnen kunt beoordeling van primaire cellen. Voorbereidende tests van antilichamen op gekweekte primaire cellen vergt minder tijd en monetaire investeringen dan andere modellen tijdrovend en duur ziekte. Door het injecteren van een geneesmiddel in een gezonde muis in vivo, en isoleren van de cellen en analyseren ze ex vivo, kan men bepalen als studies om te beoordelen of de behandeling met biologics is van invloed op macrophage activering in ziekte modellen zijn gerechtvaardigd.
Met weinig studies die het effect van biologische therapieën op macrophage activering in vitro en in vivo direct testen, bieden onze technieken een voordeel ten opzichte van alternatieve technieken. Huidige technieken betrekken testen biologische drug effecten op gemengde cel populaties in vitro, zoals het effect van infliximab in een gemengde lymfocyt reactie (MLR) of IVIg op menselijke macrofagen in perifere bloed mononucleaire cellen, waar het effect niet kan worden toegeschreven aan een bepaalde cel type7,12. Met behulp van BMDMs en peritoneale macrofagen is gunstig over het gebruik van cellijnen, zoals RAW264.7 cellen, die niet de pro-inflammatoire cytokine produceren, IL-12, in reactie op LPS8,13. Testen van het effect van een antilichaam gebaseerde drug op macrophage reacties ex vivo heeft voordelen omdat cytokine reacties kunnen rechtstreeks worden toegeschreven aan macrofagen, in plaats van macrophage reacties afgeleid door het meten van serum cytokine niveaus14 . BMDMs en peritoneale macrofagen kunnen worden afgeleid en geïsoleerd van genetisch gemodificeerde muizen om te bepalen van de specifieke rol van een proteïne in anti-inflammatoire macrofaag activering. Bijvoorbeeld, hebben we gebruikt Il10 gebrekkige(- / -) BMDMs om aan te tonen dat IVIg-geïnduceerde vermindering van pro-inflammatoire cytokine productie gedeeltelijk afhankelijk van IL-10,8 is. Van een drug werkingsmechanisme kan worden onderzocht gebruikend het westelijke bevlekken, waar de rol van specifieke proteïnen en signalering gebeurtenissen kan worden bepaald. Kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) kunnen worden uitgevoerd op BMDMs of peritoneale macrofagen weer te geven van de patronen van de genexpressie die uit een antilichaam activering voortvloeien. Modellen van de ziekte in muizen kunnen informatie geven over de mogelijke werkzaamheid van antilichaam gebaseerde biologische therapieën in modellen voor ziekten zoals inflammatory bowel disease, reumatoïde artritis en kanker15,16, 17. de hier beschreven technieken zal echter informatie verschaffen over het werkingsmechanisme van deze biologics door te bepalen of ze anti-inflammatoire macrofaag activiteit veroorzaken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de University of British Columbia.
1. het beenmerg Macrophage afleiding en activering met antilichamen
- Met behulp van CO2 verstikking euthanasie uitvoeren.
- Plaats de muis in inductie kamer. Euthanaseren muis met 5% Isofluraan anesthesie, voor 60-90 s, totdat ze stilstaan en ademhaling diep en traag is.
- Uitschakelen van Isofluraan anesthesie en beheren van 6-8 L/min voor CO2 tot muis is gestopt met ademen. Verlaten muis met CO2 op voor ten minste nog eens 5 min. verifiëren dat er niet langer een hartslag of ademhaling is. Het uitvoeren van een cervicale dislocatie om ervoor te zorgen dood.
Opmerking: 8-12 weken oude muizen bieden de hoogst mogelijke opbrengst van macrofagen.
- Spray muis poten met 70% ethanol en pin met armen en benen gestrekt in de liggende positie over een schuim-bord. Met een schaar en pincet te houden van de huid, maken een ondiepe snee (0,2 cm) verwijderen van de huid en de vacht van het oppervlak van elk van de achterpoten.
Opmerking: Deze procedure en alle weefselkweek manipulaties uitvoeren in een steriele kap. - Trim spier zijn verbeend en dijbeen om zichtbaar te maken. Verwijder de zijn verbeend en dijbeen, door het snijden van de botten en spieren net onder het heupgewricht en boven de enkels. Trim zo veel spieren uit mogelijk.
- Spray botten met 70% ethanol en wacht 1 minuut om te verdampen en plaats ze in 6 goed plaat van flush medium been (Iscove van gewijzigd Dulbecco van medium (IMDM), 10% foetale runderserum (FBS)).
- Snijd de uiteinden van de botten door het snijden van 0,1 cm van bot uit de enkel en de bovenkant van het dijbeen, zodat het bot holte wordt blootgesteld. Ervoor zorgen dat het beenmerg zichtbaar is en een 26 gauge naald kan worden geplaatst in de holte van het bot.
- Snijd de botten en spieren te scheiden van de zijn verbeend en dijbeen van de gewrichten van de knie. Invoegen van een naald van de 26 gauge gekoppeld aan een 10 mL spuit in de holte. Spoel de beenmerg in een conische buis van 50 mL met 5 mL bot flush middellange. Spoel twee zijn verbeend en twee dijbeen, van één muis, in elke tube van 50 mL.
- Pipetteer op en neer de verschillende tijden of vortex beenmerg op een langzame snelheid tot zachtjes dispergeren klontjes. Snaren van beenmerg moeten worden opgesplitst in kleine (minder dan 0,5 mm) vlekjes van beenmerg. Vul de conische buis tot 50 mL met bot flush middellange. Pipetteer inhoud van de conische buis in een 75 cm2 Weefselkweek behandeld kolf en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 voor 1 h.
Opmerking: Volwassen macrofagen en mesenchymale cellen zullen worden aanhangend aan op de maatkolf en worden afgevoerd, terwijl de gewenste hematopoietische progenitorcellen in suspensie blijven. - Het medium met hematopoietische progenitorcellen Pipetteer in een conische tube van 50 mL. Centrifugeer de buis bij 300 x g bij kamertemperatuur voor 5 min. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet in 5 mL macrofaag kolonie stimuleren kweekmedium factor (MCSF) (IMDM, 10% FBS, 5 ng/mL MCSF, 100 U/mL penicilline/streptomycine en 150 μM monothioglycerol (MTG)).
- Cellen tellen met behulp van een hemocytometer-18. Voeg medium resuspendeer de cellen tot een concentratie van 0,5 x 106 cellen/mL, 1.5 x 107 cellen/kolf in 30 mL medium, en Pipetteer zachtjes op en neer. Pipetteer 30 mL van de schorsing in een nieuwe 75 cm2 Weefselkweek behandeld bevat.
- Op dag 4 en dag 7 na de oorspronkelijke cultuur in stap 1.9, Controleer of de cellen aanhanger en lichtjes vertakte met behulp van een omgekeerde helder veld voor fasecontrastmicroscoop. Gooi het medium met de cellen die niet-aanhanger. Spoel de cellen met IMDM één keer en Voeg 30 mL MCSF-kweekmedium.
- Wanneer de cellen zijn volwassen per dag 10 (> 95% positief voor F4/80 en Mac-1), Controleer nogmaals of de cellen zijn aanhanger en lichtjes.
- Plaat van cellen voor stimulaties, het kweekmedium verwijderen uit de kolf en voeg 8 mL enzym gratis, EDTA-based cel dissociatie buffer (Tabel van materialen). Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C, 5% CO2.
- Schraap cellen zachtjes, met een kleine hoeveelheid druk, met behulp van een steriele cel schraper. Controleer in de Microscoop die cellen hebben losgemaakt van het oppervlak van de kolf. Pipetteer gedissocieerde cellen in een conische tube van 50 mL. Spoel de kolf 3 keer met 5 mL van IMDM en bundelen van de spoeling-oplossing met de cellen die zijn geoogst. Centrifugeer cellen bij 300 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de pellet cel in 3 mL MCSF kweekmedium per conische tube van 50 mL. Levensvatbare cellen tellen met behulp van een hemocytometer-18. Resuspendeer de cellen bij een concentratie van 1 x 106 cellen/mL en plaat 100 μl van celsuspensie (1 x 105 cellen/well) per putje van een 96-Wells Weefselkweek behandeld, platte bodemplaat.
Opmerking: Beenderen van één muisklik zal genereren genoeg cellen voor 100 putten. Indien gewenst, kan 1 mL van cellen in een 6-well plaat (Weefselkweek behandeld, platte bodem) worden verguld. Een groter aantal cellen (1 x 106 cellen) kan nuttig zijn voor westelijke vlek analyses. - Zodra aanhangend, stimuleren tweevoudige of drievoudige putjes elk met 10 ng/mL van LPS in IMDM, 30 mg/mL IVIg, of IVIg + LPS. Doses van LPS of IVIg kunnen worden getitreerd om te optimaliseren van reacties. Tweevoudige of drievoudige wells als ongestimuleerde besturingselementen verlaten. Incubeer hen gedurende 24 h (37 ° C, 5% CO2).
Opmerking: Opnieuw vergulde cellen dient zich te houden aan weefselkweek putjes binnen 1 uur. - Cel supernatant van elk putje in individuele 1,7 mL microcentrifuge buizen verzamelen en verwijderen van elke zwevende deeltjes door spinnen bij 10.000 x g gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant cel en vermijden de pellet te verstoren. Plaats de geklaarde cel supernatant in een steriele microcentrifuge buis.
Opmerking: Cel supernatant kunnen worden vehiculumcontrolegroep cytokines, IL-10 en cytokine subeenheid, IL-12 / 23p 40, door enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) onmiddellijk, of die zijn opgeslagen op de lange termijn-80 ° C. Volg ELISA protocol van verkrijgbare kit (Tabel van materialen). Andere pro-inflammatoire cytokines kunnen worden bepaald, zoals IL-6 en TNF, zoals ze zijn ook verminderd door co behandeling met IVIg + LPS stimulatie t.o.v. stimulatie met LPS alleen. Na stimulatie, kunnen Adherente cellen worden voorbereid voor technieken zoals het westelijke bevlekken of kwantitatieve polymerase kettingreactie (Q-PCR) 19,20.
2. uitdagend muizen In Vivo met IVIg en peritoneale macrofagen oogsten
- Weeg elke muis.
Opmerking: bijvoorbeeld, voor een muis van 20 g, 500 µL van IVIg is vereist.
Opmerking: Voer de procedure in een steriele kap.
Opmerking: Plaats de naald zorgvuldig in de muis, zodat u niet PBS in de organen, maar veeleer in de peritoneale ruimte inspuit doen.
Opmerking: Voor elke 5 mL vloeistof ingespoten, ongeveer 3,75 mL zal worden hersteld.
Opmerking: Na de laatste injectie wellicht gemakkelijker om de vloeistof uit de zijkanten van het veel links en rechts van de muis, waar vocht heeft opgelopen. De organen zal minder interferentie met de naald op deze positie veroorzaken.
Opmerking: De macrofagen worden iets groter dan de andere peritoneale cellen. Typische opbrengst is 5 x 105 - 1 x 106 macrofagen/muis met een wild type C57BL/6 muis.
Optioneel: Als een groot aantal rode bloedcellen aanwezig in de cel pellet zijn, een lysis stap uitvoeren om ze te verwijderen, met behulp van de 1 x rode bloedcellen lysis-buffermengsel volgens de instructies van de fabrikant.
Opmerking: Het kan noodzakelijk zijn aan zwembad zijn cellen uit meer dan één muis voor een experiment als met drievoudige putten of titrating stimulerende middelen. Bijvoorbeeld, als een muis had 5 x 105 macrofagen, zou 500 μL van plating medium nodig zijn. Zou dat er genoeg cellen voor 5 putten, of 1 experiment in tweevoud, met één dosis van de LP's.
Opmerking: Na stimulatie, Adherente cellen kunnen worden voorbereid voor technieken zoals westelijke vlek of PCR.
3. uitdagend muizen in Vivo met IVIg + LP's en peritoneale macrofagen oogsten
- Weeg elke muis. Bereken het volume van IVIg (voorraad concentratie van 100 mg/mL) die nodig is om een definitieve dosis van 2,5 g/kg lichaamsgewicht. Berekent het bedrag van LPS (100 μg/mL voorraad concentratie in de IMDM) die nodig is om een definitieve dosis van 0.2 μg/g lichaamsgewicht.
Opmerking: bijvoorbeeld, voor een muis van 20 g, 500 µL van IVIg stockoplossing en 40 μL van een 100 μg/mL oplossing van LPS is vereist. - Teken het normbedrag van IVIg en LP's in een steriele 1 mL spuit uitgerust met een steriele 26 gauge naald. Voor controle muizen die geen IVIg ontvangt, vervangen door een gelijkwaardige hoeveelheid IVIg met steriel PBS pH 7.4.
- Nekvel de muis met één hand door haar huid aan de achterkant van de nek met uw duim en wijsvinger te grijpen en zijn staart en achterpoten met uw overige vingers te houden. Zijn lichaam naar de grond kan vallen.
- Plaats de naald onder een hoek van 30-40° ten opzichte van de muis van de buik, in de lagere juiste kwadrant, schuine rand, en invoegen van 1,5 cm. Injecteer het IVIg LPS, of PBS + LPS, intraperitoneally als in stap 2.4.
- Oogst na 1h, peritoneale macrofagen door het uitvoeren van de stappen 2.5-2.10.
- Cellen naar beneden draaien bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. 1 mL van de herstelde lavage vloeistof verwijderen en gebruiken voor IL-10 en IL-12 / 23p 40 analyses door ELISA volgens de instructies van de fabrikant of bevriezen bij-80 ° C voor toekomstige analyses.
Opmerking: Om ervoor te zorgen nauwkeurige vergelijking tussen behandelingen lavage vloeistof cytokine p.a., 5 mL flushs van de peritoneale holte 4 keer voor uitvoeren een eindvolume van 15 mL Niet alle vloeistof zal worden teruggevorderd van elke flush. - Zoals in stap 2.11, resuspendeer en levensvatbare macrofagen tellen.
Opmerking: De macrofagen worden iets groter dan de andere peritoneale cellen.
Optioneel: Als een groot aantal rode bloedcellen aanwezig in de cel pellet zijn, een lysis stap uitvoeren volgens de instructies van de fabrikant om ze te verwijderen, zoals in stap 2.11.
Opmerking: Het kan moet zwembad cellen van meer dan één muis voor een experiment. Bijvoorbeeld, als een muis had 5 x 105 macrofagen, zou 500 μL van plating medium nodig zijn.
Opmerking: Monsters kunnen worden onmiddellijk gebruikt of bevroren en opgeslagen bij-80 ° C voor cytokine analyse door ELISA.
Opmerking: Cellen kunnen worden voorbereid voor technieken zoals westelijke vlek of PCR, zoals in de stappen 1.16-1.17 en 2.14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lymfkliertest bot beenmerg afgeleid macrofagen kunnen worden gekweekt van hematopoietische cel precursoren in beenmerg aangeblazen. Het beenmerg aangeblazen gebundeld van dijbeen en zijn verbeend van één C57BL/6 muis meestal opbrengst 107 beenmerg afgeleid macrofagen, waardoor ze een handige bron van macrofagen voor experimenten. BMDMs kan worden gebruikt om te testen antilichaam gebaseerd drug reacties wanneer uitgedaagd met een inflammatoire stimulans in vitro. Figuur 1 laat zien dat IVIg merk, Gammunex (GX), + LPS verhoogt de productie van de anti-inflammatoire cytokine, IL-10, 7-fold in vergelijking met LPS stimulatie alleen (Figuur 1A) en vermindert de productie van IL-12/23 p 40 (Figuur 1 B). Figuur 1 toont ook aan dat verschillende IVIg preparaten anders uitvoeren. Hoewel de drie verschillende bereidingen van IVIg kunnen afnemen van IL-12 / 23p 40 aanzienlijk (Figuur 1B), Octagam (OG) en Gammagard vloeistof (GL), niet aanzienlijk verhogen de productie van de IL-10 in reactie op LPS (Figuur 1 A). OG en GL kunnen aanzienlijk verminderen de productie van IL-12/23 p 40 in reactie aan LPS, maar in mindere mate dan GX. Deze resultaten tonen aan dat antilichaam beïnvloedt het beenmerg afgeleid macrofaag activering, en zijn er verschillen tussen de voorbereidingen van de dezelfde drug die leiden veranderingen in de reacties tot kan.
BMDMs kan worden gebruikt om te testen de mechanistische effecten van IVIg, door het westelijke bevlekken. Macrofagen geactiveerd met IC + LPS toegenomen fosforylering van het eiwit (kaart) kinases mitogeen geactiveerd, p38 en Erk1/2, die verantwoordelijk voor de toegenomen productie van de IL-1021 zijn. In Figuur 2 blijkt een typische westelijke vlek te detecteren kaart kinase activatie vereist voor de productie van de IL-10 door macrofagen die ongestimuleerde of gestimuleerd met LPS, IVIg, of IVIg + LPS geweest. IVIg stimulatie alleen of IVIg + LPS co stimulatie verhoogde activering van de kaart kinases, Erk1/2, met eerdere en langdurige fosforylatie in vergelijking met die gezien met LPS alleen. Activering van p38 kwam eerder in macrofagen gestimuleerd met IVIg + LPS vergeleken met die gestimuleerd met LPS alleen. Deze resultaten tonen aan dat de methoden, zoals het westelijke bevlekken, kunnen worden gebruikt om te laten zien van cel signalering gevolgen van antilichaam drugs op BMDMs. Naast de cytokine productie, kan kaart kinase activering worden gebruikt om te tonen dat anti-inflammatoire macrofaag activering heeft plaatsgevonden.
Volwassen, kunnen weefsel resident macrofagen ook geïsoleerd van muizen voor het beoordelen van de reacties op IVIg 5.0 x 10-5 - 1.0 x 106 peritoneale macrofagen kunnen worden geïsoleerd uit een gezonde C57BL/6 muis. In Figuur 3, peritoneale macrofagen van muizen ingespoten met IVIg doen niet in staat de productie van de IL-10 in de afwezigheid van stimulatie in vitro, in vergelijking met PBS geïnjecteerd muizen aanzienlijk te verhogen. Wanneer peritoneale macrofagen van IVIg geïnjecteerd muizen worden gestimuleerd met LPS ex vivo, ze produceren 6-fold meer IL-10 dan muizen geïnjecteerd met PBS. Ze doen, echter geen detecteerbare hoeveelheden van IL-12 / 23p 40 wanneer gestimuleerd met LPS ex vivo. Deze resultaten tonen aan dat antilichaam effecten macrofagen getest kunnen worden door het injecteren de drug in vivo en cellen ex vivo kweken met deze methode.
Macrophage reacties op antilichamen en inflammatoire stimuli kunnen worden beoordeeld in vivo. Cytokine productie in lavage vloeistof kan worden beoordeeld en in supernatant van ex vivo gestimuleerd peritoneale macrofagen. Figuur 4 toont de anti-inflammatoire cytokine IL-10 wordt verhoogd in lavage vloeistof (Figuur 4A), peritoneale cellen (Figuur 4B) en peritoneale macrofagen (Figuur 4C) wanneer muizen worden uitgedaagd met IVIg + LPS in vergelijking met PBS + LPS. Productie van de pro-inflammatoire cytokine subeenheid, IL-12 / 23p 40, aanzienlijk verminderd in gekweekte peritoneale macrofagen, maar niet in lavage vloeistof. Met deze methode kan onderzoek naar de gevolgen van de drug van een antilichaam op inflammatoire reacties in vivo evenals ex vivo.
Figuur 1 : Macrophage IL-10 en IL-12 / 23p 40 productie in reactie op de stimulatie van de samenwerking met verschillende merken van IVIg en LPS. C57BL/6 MCSF beenmerg afgeleid macrofagen waren beide ongestimuleerde (C), of gestimuleerd met LPS (10 ng/mL), IVIg (30 mg/mL), of IVIg + LPS. Drie verschillende merken van IVIg werden getest: Octagam (OG), Gammunex (GX) en Gammagard vloeistof (GL). Macrophage supernatant waren verzameld 24u na stimulatie, en verduidelijkt door middel van centrifugeren. ELISAs voor IL-10 (A) en IL-12/23 p 40 (B) werden uitgevoerd. Gegevens zijn voor macrofagen van n = 3 onafhankelijke experimenten, met cellen uit 1 afzonderlijke muis per experiment, met ELISAs vehiculumcontrolegroep in tweevoud. Gegevens zijn middelen ± SD. *P < 0,05, ** P < 0.001, ***P < 0,0001 voor vergelijking tussen LPS stimulatie en IVIg + LPS co-stimulatie. One-Way variantieanalyse (ANOVA) met Tukey van na de test voor meerdere vergelijkingen werden gebruikt voor statistische analyses. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Westelijke vlekkenanalyse voor kaart kinase activation in macrofagen IVIg-geactiveerde. MCSF afgeleid beenmerg macrofagen waren ongestimuleerde of gestimuleerd met LPS (10 ng/mL), GX IVIg (30 mg/mL), of GX IVIg + LPS; voor 0, 10, 40 of 120 min. hele cel lysates (1.0 x 106 macrofagen/lane) werden onderworpen aan natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide-gel elektroforese (SDS-PAGE) en westelijke bevlekkende met phospho-specifieke antilichamen voor p38 en extracellulaire signaal-gereglementeerde kinase (Erk1/2), evenals glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH), als een besturingselement laden. Resultaten die worden weergegeven zijn representatief voor n = 3 onafhankelijke experimenten, met cellen uit 1 afzonderlijke muis per experiment.Densitometrie voor pp38 en pErk1/2 eiwitniveaus, genormaliseerd naar GAPDH, gemiddeld uit 3 onafhankelijke experimenten staan hieronder elke band. Dit cijfer is gewijzigd van Kozicky et al.8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Productie van de IL-10 door macrofagen van muizen met IVIg in vivouitgedaagd. 8-week-oude C57BL/6 muizen kregen steriele PBS (injectie control) of GX IVIg (2,5 g/kg) intraperitoneally. Na 1 h, muizen werden euthanized en peritoneale lavages werden uitgevoerd. Peritoneale macrofagen werden geïsoleerd met behulp van de naleving van de selectie. Macrofagen waren beide ongestimuleerde (C), of gestimuleerd met LPS (10 ng/mL). Cel supernatant werden geoogst en verduidelijkt na 24u voor IL-10 ELISAs. Gegevens zijn van n = 5 individuele muizen per groep uitgevoerd in 3 onafhankelijke experimenten, met ELISAs vehiculumcontrolegroep in tweevoud. Gegevens zijn middelen ± SD. * P < 0,01 en NS = niet significant. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een Two-way ANOVA met Sidak de post-test voor meerdere vergelijkingen. Dit cijfer is gewijzigd van Kozicky et al.8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Productie van de IL-10 en IL-12 / 23p 40 van muizen uitgedaagd met IVIg + LPS in vivo. 8-week-oude C57BL/6 muizen werden intraperitoneally ingespoten met of PBS + LPS (0,2 µg/g lichaamsgewicht), als een controle; of GX IVIg (2,5 g/kg lichaamsgewicht) + LPS (0,2 µg/g lichaamsgewicht). Na 1 h, muizen werden euthanized en peritoneale lavages werden uitgevoerd. (A) Clarified lavage vloeistof, (B) verduidelijkt geconditioneerde supernatant van peritoneale cellen tijdens een 1 h macrofaag naleving stap, en (C) verduidelijkt 24u peritoneale macrofaag (Mφ) supernatant waren vehiculumcontrolegroep IL-10 en IL-12 / 23p 40 door ELISA. Gegevens zijn middelen ± SD voor n = 5 muizen in 3 onafhankelijke experimenten, met ELISAs vehiculumcontrolegroep in tweevoud. P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0.001 en NS = niet significant. Muizen ingespoten met PBS + LP's werden vergeleken met muizen ingespoten met IVIg + LPS met behulp van een Student t -test. Dit cijfer is gewijzigd van Kozicky et al.8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Macrophage activering Staten spelen een belangrijke rol in beide weefsel homeostase en ziekte22. Macrofagen hebben verschillende evenals het overlappende activering Staten, afhankelijk van de signalen in hun communicatie-3. Ze hebben verschillende rollen in alle stadia van de inflammatoire respons: verdediging tegen ziekteverwekkers, wond genezing en weefsel teruggave, en hebben ook een duidelijke anti-inflammatoire activeringsstatus dat belangrijk is voor het uitzetten van de inflammatoire respons2 . Anti-inflammatoire macrofaag activering vereist twee externe stimuli voor macrofagen produceren grote hoeveelheden van de anti-inflammatoire cytokine, IL-10 en lage bedragen van pro-ontsteking cytokinen, zoals IL-1223. Een signaal komt uit antilichamen handelend via Fc gamma receptoren, en het tweede signaal is een pro-inflammatoire prikkel, zoals LP's of IFNγ24,25. Serum, immuuncomplexen en anti-TNFα antilichamen, hebben alle gevonden voor het opwekken van een hoge IL-10-produing-anti-inflammatoire activeringsstatus in macrofagen8,23,25,26. Onze fractie heeft eerder gepubliceerd dat lymfkliertest beenmerg afgeleid macrofagen en peritoneale macrofagen gestimuleerd met IVIg ook grote hoeveelheden van IL-10 en weinig tot geen pro-inflammatoire IL-12 / 23p 40 in reactie op LPS8 produceren. We hebben ook geconstateerd dat andere pro-inflammatoire cytokines, TNF en IL-6 zijn ook verminderd door IVIg in beenmerg afgeleid macrofagen8. De hier beschreven methoden kunnen worden toegepast om te testen van andere antilichaam gebaseerd drug reacties in muis BMDMs en peritoneale macrofagen in vitro en in vivo.
Er zijn vele kritische stappen in testen antilichaam gebaseerde therapeutics op muis beenmerg en peritoneale macrofagen. Steriliteit is belangrijk voor elk protocol. Als macrofaag culturen zijn besmet met micro-organismen uit de lucht, bont of uitwerpselen van muizen, zal de macrofagen reageren op deze prikkels door overlegging van de pro-inflammatoire cytokines. Alle experimenten uitvoeren in een kabinet bioveiligheid, de muis royaal spuiten met ethanol en waarborging van de integriteit van de darm tijdens peritoneale opvliegers zijn essentieel. Het antilichaam moet ook steriele en opgeslagen volgens de instructie van de fabrikant worden gehouden. Het kan niet worden gebruikt als het is besmet, verlopen of troebel. Turbiditeit zal verlagen de effectiviteit van de drug, en kan optreden als de drug niet bij de juiste temperatuur opgeslagen wordt of te lang is opgeslagen. IVIg kan worden opgeslagen bij 4 ° C en alleen gebruikt voordat de verlopen datum is bereikt, aangezien de niveaus van de productie van de IL-10 kunnen worden beïnvloed. Anderzijds hebben we gezien dat het kan worden bevroren bij-20 ° C met geen effect op de reacties. Percelen van IVIg leiden tot soortgelijke experimentele resultaten, overwegende dat verschillende soorten IVIg merk preparaten, zoals in Figuur 1, leiden verschillende antwoorden in macrofagen tot kunnen. Essentiële controles, zoals ongestimuleerde cellen en cellen gestimuleerd met antilichaam alleen moeten worden opgenomen in elk experiment uit de besmetting van macrofagen of de drug te sluiten.
Verschillende wijzigingen kunnen worden aangebracht om deze protocollen voor het aanpassen van een experiment. In de niet-ontstoken staat, kan het moeilijk zijn om genoeg peritoneale macrofagen voor grote experimenten te isoleren. Peritoneale macrofagen kunnen worden ontlokte door intraperitoneale injectie van thioglycollate (TG). Een immuunrespons treedt op kunnen, en na 4 dagen, ontlokte peritoneale macrofagen geoogst27. De aangeworven macrofagen wellicht minder volwassen en vertegenwoordigen niet resident cellen, zoals wij hebben hier gebruikt die belangrijke overwegingen zijn. TG-ontlokte macrofagen kunnen ook agar van de TG-Bouillon, die een complicatie, wellicht vooral als het doen van experimenten op fagocytose27hebben geïnternaliseerd. Muizen van verschillende genetische achtergronden, C57BL/6 of BALB/c, kunnen ook worden gebruikt voor experimenten en onderzoeken van het effect van antilichamen op macrophage reacties die zal worden beoordeeld in ziekte modellen vereisen een specifieke genetische achtergrond kunnen worden gekozen. Bovendien is dat de genetisch gemodificeerde muizen, zoals Il10- / - muizen, kunnen worden gebruikt ter beoordeling van de functie van de specifieke proteïnen in het werkingsmechanisme van een drug, zoals wij hebben gedaan in onze eigen werk8. Verschillende inflammatoire stimuli kunnen ook worden gebruikt om de impact van antilichamen op macrophage activering. IFNγ, en host afgeleid tol zoals (TLR) receptor agonisten (bijvoorbeeld hyaluronzuur), hebben geweest tweedehands voor activeren van IL-10-producerende macrofagen25,,28. Een belangrijke overweging is de dosis van het antilichaam. De dosis moet worden getitreerd met het oog op de optimale dosis in cultuur en in dierproeven, zoals het tussen zowel antilichamen als leveranciers verschillen zal. De gekozen dosis moet weerspiegelen ook de dosis die aan mensen gegeven en zal verschillen tussen harddrugs. IVIg wordt gegeven als een anti-inflammatoire therapie bij hoge doses (25-35 mg/mL of 2 g/kg lichaamsgewicht), waarin het aantal doses worden gebruikt in deze protocollen29,30.
Het gebruik van beenmerg en peritoneale macrofagen hebben beperkingen. Hoewel een verbetering ten opzichte van macrofaag cellijnen, zijn muis BMDMs nog steeds kunstmatig afgeleide cellen van hematopoietische precursors. Immuun reacties van macrofagen in vitro testen is een belangrijke stap naar inzicht antilichaam reacties, maar in vivo experimenten moeten ook worden uitgevoerd. Injecteren van prikkels in vivo gevolgd door het kweken van cellen ex vivo, bieden meer informatie voor toekomstige studies om te onderzoeken of antilichaam gebaseerde drugs ook anti-inflammatoire macrofagen in een staat van ziekte kunnen activeren. Conclusies over wat er gebeurt in mensen ontvangen antilichaam gebaseerde biologics kunnen niet worden getrokken uit deze experimenten. Weinig studies zijn gepubliceerd voor de beoordeling van de effecten van IVIg op menselijke monocyt afgeleid macrofagen in vitro. Een afname van de nummers van IL-6 produceren van menselijke monocyten in vitro zijn gemeld, wanneer IVIg wordt mede gestimuleerd met LPS in vergelijking met stimulatie met LPS alleen12. IVIg vermindert TNFα en productie van de IL-6 wanneer gestimuleerd met procalcitonine (PCT) in THP-1 mens monocytic cellen31.
De protocollen in dit document hebben voordelen ten opzichte van bestaande methoden. Het beenmerg afgeleid macrofagen en peritoneale macrofagen zijn primaire cellen, rechtstreeks van muizen, geïsoleerd in plaats van cellijnen worden vereeuwigd.Muis macrofaag-achtige cellijnen, zoals RAW264.7 cellen, niet produceren de pro-inflammatoire cytokine, IL-12, in reactie op LPS, dat is een belangrijk cytokine dat wordt geregeld door de IL-10, die wordt geproduceerd in reactie op IVIg8,13. Testen van een drug in vivo met LPS toelaat onderzoek naar het effect van de drug op de lokale peritoneale milieu door middel van analyse van de lavage vloeistof, peritoneale cellen en specifiek, peritoneale macrofagen. Het is een korte termijn, eenvoudig model dat belangrijke informatie bieden kan ter rechtvaardiging van het onderzoek van de niet-specifieke gevolgen van antilichamen voor macrophage activering in langer en duurder diermodellen van ziekte. Het heeft een voordeel ten opzichte van endotoxemia modellen waar de experimentele maatregel vaak alleen de overleving van de muis of de cytokines in serum14 is. Overlevingskans van de patiënt en serum cytokines zijn waardevolle maatregelen van de immuunrespons, maar ze doen niet tonen de bijdrage dat macrofagen specifiek kunnen hebben. Isoleren en het kweken van de peritoneale macrofagen van een uitdaging experiment toont een direct en meetbaar effect die antilichaam therapeutics op macrophage functie kan hebben.
Deze methoden hebben toepassingen voor het testen en het ontwerpen van biologische therapieën. Het gebruik van antilichamen als therapeutics is sterk toegenomen in de afgelopen jaren. Deze therapieën hebben echter bijkomende onbekende effecten op macrofagen die kunnen worden herkend het Fc deel van het antilichaam en veranderen hun cytokine productie. Het anti-TNFα-antilichaam, infliximab, heeft aangetoond dat induceren van IL-10 en onderdrukken van T-celproliferatie door haar Fc gedeelte, en dat is voorgesteld als een van de mechanismen van actie7,15,26. Met behulp van genetische modellen, kunnen specifieke proteïnen betrokken worden in het mechanisme van deze drugs hoe macrofaag activering beïnvloeden. Klassen van IgG antilichamen en preparaten van antilichamen kunnen worden gewijzigd om te wijzigen hoe de macrofagen biologics ondervinden. Onze gegevens blijkt de voorbereiding en/of opslag van de dezelfde antilichaam drug (IVIg) kan invloed hebben op de gevolgen ervan voor macrophage activering. De methoden die in dit document kunnen worden gebruikt om te ontwerpen therapieën die niet deze effecten, die cruciaal hoeft voor het handhaven van immunosurveillance tijdens kankertherapieën worden kunnen, waar anti-inflammatoire macrofagen tumor progressie kunnen bevorderen. Deze technieken kunnen ook worden gebruikt voor het ontwerpen en evalueren van drugs die over deze effecten beschikken, als wenselijk. Bijvoorbeeld, is het wellicht gunstig voor macrophage inflammatoire reacties verminderen en anti-inflammatoire IL-10-producerende macrofagen ter verbetering van de behandeling van inflammatoire darmziekten of reumatoïde artritis te creëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.
Acknowledgments
L.K. is de ontvanger van de University of British Columbia 4 jaar fellowship (4YF) graduate studententijd award. L.M.S. is de ontvanger van een Canadese Vereniging van de gastro-enterologie / ziekte van Crohn en Colitis Canada / CIHR nieuwe onderzoeker salaris Award en is een biomedische van de Michael Smith Stichting voor gezondheidsonderzoek. Dit werk werd gesteund door een projectsubsidie van Canadese bloed Services, in samenwerking met de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (verlenen # CIHR2016-LS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13 (2014).
- Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
- Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
- Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
- Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
- Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
- Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777 (2013).
- Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
- Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
- Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
- Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
- Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
- Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
- Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160 (2014).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
- Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
- Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
- Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
- Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
- Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
- Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
- Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
- Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).
