Summary
抗体創薬が炎症性疾患の治療に革命をもたらしました。特定のターゲットに対する直接的な効果だけでなく、抗体は抗炎症になる大食細胞をアクティブ化できます。このプロトコルを記述する方法抗炎症マクロファージ活性化は評価in vitroマウス骨髄マクロファージと生体内のマクロファージを使用して使用することができます。
Abstract
マクロファージは、食細胞の自然免疫系の細胞、病原体に対する免疫応答を開始し、癒しと組織の反発に貢献。マクロファージは炎症性応答をオフにする均等に重要であります。マクロファージの免疫グロブリン (IVIg) で刺激が (IL-10)、抗炎症サイトカイン、インターロイキン 10 の多量、細菌リポ多糖 (応答のプロ炎症性サイトカインの低レベルを作り出すことができることを示したLPS)。IVIg は多価抗体は、主に免疫グロブリン (Igg)、Gs は以上 1,000 の献血者のプラズマからプールです。免疫不全症患者における抗体を補完する、または自己免疫・炎症性疾患患者の免疫応答を抑制するものです。インフリキシマブ治療抗腫瘍の壊死の要因アルファ (tnf α) 抗体は、マクロファージ炎症性の刺激への応答の IL-10 を生成するアクティブにも示されています。IVIg と他の抗体を用いた生物は、マクロファージ活性化に及ぼす影響を確認するテストできます。本稿では、派生、刺激との in vitro抗体によるマウス骨髄マクロファージと抗体の生体内で活性化マウス腹腔マクロファージの評価法について説明します。最後に、我々 は特定の細胞シグナル伝達に抗炎症マクロファージ活性経路の寄与を決定する西部にしみが付く使用を示します。これらのプロトコルは、特定の蛋白の抗炎症マクロファージ活性化に及ぼす影響を決定する遺伝子改変マウスを使用できます。これらのテクニックは、特定生物製剤は大食細胞を炎症反応で生体を減らす IL 10 生産抗炎症活性化状態に変更することにより行動できるかどうかを評価するためにも使用できます。これはマウスの病態モデルの中に生物学的製剤の有効性のマクロファージ活性化の役割に関する情報を提供し、人々 の行動の潜在的な新しいメカニズムへの洞察力を提供できます。逆に、これに警告するかもしれない特定抗体を用いた生物学的製剤の使用に対して感染症を治療するためにマクロファージがその感染に対する宿主防御において重要な役割を果たす場合に特に。
Introduction
大食細胞は自然免疫系細胞、感染症やけがに免疫応答における複数の役割を果たすです。マクロファージは、感染、組織の損傷に免疫応答を開始する、炎症性応答を停止、治癒反応1を推進します。3 つの最適勉強マクロファージ活性化状態の例としては、: 1) マクロファージがインターフェロン γ (肝腎) と細菌リポポリサッカライド (LPS)、炎症性応答に貢献する M (肝腎 + LP) を指定2) マクロファージ インターロイキン 4 (IL-4)、M(IL-4)、刺激治療の応答に関連付けられています。3) マクロファージ免疫複合体 (IC) で刺激や LP、M (IC + LP)、炎症性応答の2,3を無効にする能力を持っています。M (IC + LP) M(IL-4) 治癒マクロファージ、異なっているし、酵素アルギナーゼ (Arg-1) または FIZZ14を表現しないでください。これらの抗炎症マクロファージの最高のマーカーは、そのサイトカイン生産5です。マクロファージは、健康を維持するために複数のロールを持つが、炎症性疾患やがん3にも貢献。このため、マクロファージが様々 な疾患の治療のためキーの治療上のターゲットです。抗体マクロファージによる疾患治療法の開発に、活性化状態を検討することが重要です。
本稿の焦点はマウス骨髄由来マクロファージ (BMDMs) とマクロファージ炎症性応答体外と体内に抗体医薬の効果をテストするための使用です。最近、マクロファージ活性化6,7,8抗体の効果を示す複数の調査がずっとあります。共同のマクロファージ免疫複合体、抗体抗原および LP、通常炎症性刺激との複合体であると抗炎症サイトカイン、IL-10、およびプロ炎症性サイトカインの非常に低レベルの非常に高いレベルを生成します。インターロイキン 12 (IL-12)9。また、インフリキシマブ、tnf α、抗体、一部、そのフラグメント結晶 (Fc) 地域7を介して抗炎症大食細胞を誘導することによって動作するように発見されています。我々 は IVIg + LP が m (IC + LP)、共同誘導マクロファージが大量の IL-10 およびプロ炎症性サイトカイン サブユニット インターロイキン 12 の 23 p40 (少量を生成する前記のような抗炎症マクロファージの活性化を誘導することを報告しています。IL-12/23p40)、インターロイキン-6 (IL-6)、および TNF8。IVIg は、1,000 以上のドナー10の血からプールされて主に IgG ポリクローナル抗体から成る薬です。さまざまな慢性的な脱髄性多発性神経障害、特発性血小板減少性紫斑病などの免疫疾患の治療に使用されますが、その作用メカニズムは完全に理解11ではないです。マクロファージ活性化に基づく抗体医薬の効果は、ここに説明する方法を使用して評価できます。
BMDMs と腹腔マクロファージ マクロファージ活性化の特定の生物学的製剤の効果をテストできます。これらのマクロファージのソースを使用すると、一次電池の評価ができます。培養細胞における抗体の予備的なテストより少ない時間と他の時間がかかり、高価な疾患モデルよりも金銭的投資が必要です。健康なマウス生体内で薬を注入すると細胞を分離する前のヴィヴォそれらを分析、研究、生物学的製剤による治療疾患モデルにおけるマクロファージ活性化に影響を与えるかどうかを評価するために保証されているを決定できます。
マクロファージ活性化in vitroとin vivoでの生物学的製剤の効果を直接テストいくつかの研究は、当社の技術は代替技術上の優位性を提供します。現在の技術を含む混合細胞集団の in vitro、ひと末梢血単核細胞、マクロファージにリンパ球混合培養反応 (MLR) や IVIg におけるインフリキシマブの効果などに対するテストの生物学的薬剤の効果、効果特定のセル型7,12に起因することはできません。炎症性サイトカインを生成しない、RAW264.7 細胞など細胞株を使用してで有利である BMDMs および腹腔マクロファージを用いた IL-12 組合8,13に対応。血清サイトカイン レベル14 を測定することによって大食細胞の応答を推定のではなく、サイトカインは、マクロファージに直接帰することができるので利点がありますマクロファージ反応前のヴィヴォにおよぼす抗体創をテスト.BMDMs と腹腔マクロファージを派生し、抗炎症のマクロファージ活性化におけるタンパク質の特定の役割を決定する遺伝子組み換えマウスから分離できます。たとえば、 Il10欠乏を使いました(-/-) BMDMs IVIg がプロ炎症性サイトカイン産生の還元反応は IL-108に部分的に依存します。薬の作用機序は、ウェスタンブロット、特定の蛋白質のシグナル伝達における役割を決定ことができますを使用して調べることができます。BMDMs または腹腔マクロファージ活性化抗体に起因する遺伝子発現のパターンを表示するには、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) を実行できます。マウスの病態モデルは炎症性腸疾患、関節リウマチ、癌15,16,のような病気のモデルで抗体を用いた生物学的治療の潜在的な有効性に関する情報を提供できます。17します。 ただし、ここで説明する方法に関する情報を提供これらのバイオ医薬品の作用機序彼らは抗炎症マクロファージ活性を誘導するかどうかを決定することによって。
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Protocol
ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ブリティッシュ ・ コロンビアの大学のによって承認されています。
1. 骨髄マクロファージ導出と抗体で活性化
- CO2窒息を使用して安楽死を実行します。
- 誘導チャンバー内にマウスを置く。不動と呼吸はゆっくりと深くまで、60-90 s のための 5% イソフルレン麻酔とマウスを安楽死させます。
- イソフルラン麻酔を切りマウスが呼吸を停止するまで 6 ~ 8 リットル/分の CO2を管理します。マウスを残す CO2に、少なくともあと 5 分確認心拍か呼吸が不要になったこと。死を確保するための頚部転位を実行します。
注: 8-12 週古いマウスのマクロファージの最高収量を提供します。
- 70% エタノール スプレー マウス足と腕と発泡ボードの上に仰臥位で伸ばして脚を固定します。はさみと皮膚を保持するための鉗子で、後脚のそれぞれの面から皮膚や毛を削除する浅いカット (0.2 cm) を作る。
注: は、無菌フードでこのプロシージャとすべての培養操作を実行します。 - 脛骨と大腿骨を表示する筋肉をトリムします。脛骨と大腿骨を骨と足首から股関節のすぐ下の筋肉を切断することによって削除します。可能な限りとして多くの筋肉を切り落とします。
- 70% エタノールで骨をスプレーし、蒸発、その後骨フラッシュ媒体 (Iscove の変更ダルベッコ媒体 (IMDM) 10% 牛胎児血清 (FBS)) の 6 ウェル プレートに配置するために 1 分を待ちます。
- 骨空洞を露出するように 0.1 cm 足首や大腿骨の一番上の骨を切断することによって骨の両端をトリミングします。骨髄が表示されて 26 ゲージの針は骨の空洞に配置できることを確認します。
- 骨と脛骨と大腿骨、膝関節から分離する筋肉をカットします。空洞に 10 mL の注射器に接続されている 26 ゲージの針を挿入します。フラッシュ中骨の 5 mL と 50 mL の円錐管に骨髄をフラッシュします。各 50 mL チューブに 2 つの脛骨と 1 つのマウスからの 2 つの大腿骨をフラッシュします。
- 上下にいくつかの時間または渦塊を優しく分散する低速で骨髄をピペットします。骨髄の文字列は、骨髄の小型 (0.5 mm 以下) の斑点に分割する必要があります。フラッシュ中の骨付きを 50 mL の円錐管を埋めます。75 cm2組織培養に円錐形の管のピペット内容はフラスコを扱われ、37 ° c、5% CO2 1 時間孵化させなさい。
注: 成熟マクロファージ、間葉系細胞になるフラスコに付着し必要な造血前駆細胞の懸濁液のまま破棄します。 - 造血前駆細胞と培地の 50 mL の円錐管にピペットします。常温 5 分破棄 300 x g でチューブに上清を遠心し、マクロファージコロニー刺激因子 (MCSF) 培養液 5 mL にペレットを再懸濁します (IMDM、10 %fbs、5 ng/mL MCSF、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、および 150 μ Mmonothioglycerol (MTG))。
- 検定18を使用してセルをカウントします。中長期 0.5 106セル/mL、30 ml 中の 10 の7セル/フラスコ × 1.5 倍の濃度に細胞を再懸濁し、優しく上下にピペットを追加します。新 75 cm2処理培養フラスコに懸濁液 30 mL のピペットします。
- 1.9 のステップで初期培養後 7 日目の 4 日目、細胞が付着し少し分岐逆相明視野顕微鏡を使用することを確認します。非付着性細胞を含む培地を破棄します。IMDM とセルを洗浄して 1 回、MCSF 培養液 30 mL を追加します。
- セルが 10 日で成熟した (> F4/80 の Mac 1 肯定的な 95%)、再度セルがあることを確認付着とわずかに。
- 刺激のための細胞をプレート、フラスコから培養液を削除し 8 mL の酵素無料、EDTA を用いた細胞解離バッファー (資材表) を追加します。セル 5% CO2、37 ° C で 5 分間インキュベートします。
- 無菌細胞スクレーパーを使用して、圧力の量が少ない細胞を優しくこすり。細胞がフラスコ表面から切断した顕微鏡で確認します。50 mL の円錐管にピペットの解離細胞。3 回 IMDM の 5 mL のフラスコを洗い、収穫された細胞と洗浄液をプールします。5 分間室温で 300 x g で細胞を遠心します。
- MCSF 培地 50 mL の円錐管あたりの 3 mL の細胞ペレットを再懸濁します。検定18を使用して実行可能なセルを数える。96 ウェル組織文化、底が平らなプレートのウェルあたり 1 x 10 の6セル/mL とプレート 100 μ 細胞懸濁液 (1 x 105細胞/ウェル) の濃度で細胞を再懸濁します。
注: 1 つのマウスの骨 100 基の井戸に十分なセルが生成されます。必要な場合は、6 ウェル プレート (組織培養処理、フラット下) でセルの 1 mL をめっきすることが。セル (1 x 10 の6セル) の大きい数は西部のしみの分析の役に立つかもしれません。 - 一度付着、帳票の写し井戸各 10 ng/ml の IMDM、IVIg、または IVIg + 組合の 30 mg/mL LP を刺激します。LPS や IVIg の投与量は、応答を最適化する滴定することができます。些細コントロールとして帳票の写しの井戸を残します。24 時間 (37 ° C、5% CO2) それらを孵化させなさい。
注: 再めっきされたセルは、1 時間以内の組織培養井戸に従う必要があります。 - 個々 の 1.7 mL 遠心チューブに各ウェルから細胞培養上清を収集し、5 分 10,000 x g で回して任意の粒子状物質を削除します。
- 細胞培養上清を取り外して、ペレットを妨害しません。滅菌遠心チューブに上清明らかにセルを配置します。
注: 細胞培養上清がサイトカイン、IL-10、およびサイトカイン サブユニット、IL-12/23 p 40 の酵素免疫測定法 (ELISA)、すぐにによって試金または長期的に-80 ° C で保存します。市販のキット (材料表) から ELISA のプロトコルに従ってください。その他の炎症性サイトカインが試金する、il-6, TNF など IVIg 共同処理による低減 + LPS 刺激と比較すると、単独で LPS 刺激。刺激後、西部にしみが付くことや量的なポリメラーゼの連鎖反応 (PCR-Q) 19,20技術の付着性のセルを用意できます。
2. マウスIn Vivo IVIg と腹腔マクロファージを収穫に挑戦
- 各マウスの重量を量る。
注: たとえば、20 g のマウスでは、IVIg の 500 μ L 必要です。
注: は、無菌フードの手順を実行します。
注: 置き針慎重にマウスで、臓器が腹膜腔にではなく、PBS を挿入しません。
注: 流体注入毎の 5 Ml、約 3.75 mL がリカバリされます。
メモ: 最終的な投与後があります簡単液が蓄積してきたマウスのところ左と右の側面から流体を抽出すること。臓器はこの位置に針が少なくをなります。
注: マクロファージは他の腹膜の細胞よりも少し大きめになります。典型的な収量は 5 x 105 - 1 × 106マクロファージ/マウス野生型 c57bl/6 マウスを使用です。
オプション: 細胞ペレットに赤血球の数が多いがある場合は、製造元の指示に従って 1 x 赤血球細胞の換散バッファーを使用して、それらを削除する溶解手順を実行します。
注: プールが必要になる場合がありますトリプリケート井戸や覚醒剤の滴定の実験を使用して場合の 1 つ以上のマウスから細胞。たとえば、1 つのマウスは、5 x 105マクロファージを持っていた、めっき中の 500 μ L は必要になります。5 井戸または 1 実験 1 LPS 投与で、重複での十分なセルがあります。
注: 刺激後付着性のセルは西部のしみや PCR などの手法を用意できます。
3. マウスin Vivo IVIg + LPS および腹腔マクロファージを収穫に挑戦
- 各マウスの重量を量る。IVIg (100 mg/mL のストック濃度) 体重 2.5 g/kg の最終的な投与量を提供するために必要な量を計算します。0.2 μ g/g の体重の最終的な投与量を提供するために必要な LP (IMDM ストック濃度 100 μ g/mL) の量を計算します。
注: たとえば、20 g のマウスでは、IVIg 原液を 500 μ l 添加し、LPS の 100 μ g/mL 溶液 40 μ L 必要です。 - IVIg の必要量を描画し、1 mL の滅菌注射器滅菌 26 装備に LPS ゲージの針。IVIg を受け取らないコントロール マウス、滅菌 PBS pH 7.4 の IVIg の相当量を交換してください。
- 親指と人差し指で首の後ろの皮をつかむと、尾と後ろ足を残りの指で片方の手でマウスの首筋。地面に向かって体を傾けてください。
- 針マウスの腹部、右下の象限を基準にして 30-40 ° の角度で、ベベルし 1.5 cm。 挿入、IVIg + LP、または PBS + LP を挿入、腹腔と手順で 2.4 の場所。
- 1 時間後 2.5 2.10 の手順を実行することによって腹腔マクロファージを収穫します。
- 4 ° C で 5 分間 300 x g でセルをスピンダウンします。回復された洗浄液の 1 mL を削除製造元の指示に従って IL-10 と IL-12/23 p 40 elisa 法による解析に使用したり、将来分析-80 ° C で凍結します。
注意: 洗浄液サイトカイン解析する試験治療間の比較を正確にするにはに、腹腔内の 5 mL flushs が 15 mL の最終巻の 4 回実行します。すべての流体は、各フラッシュから回復されます。 - 2.11 の手順を再懸濁しますそして実行可能なマクロファージをカウントします。
注: マクロファージは他の腹膜の細胞よりも少し大きめになります。
オプション: 細胞ペレットに赤血球の数が多いがある場合ステップ 2.11 のように、それらを削除するための製造元の指示に従って溶解手順を実行します。
注: 実験の 1 つ以上のマウスからプールのセルに必要になる可能性があります。たとえば、1 つのマウスは、5 x 105マクロファージを持っていた、めっき中の 500 μ L は必要になります。
注: サンプルすぐに使用または凍結し、elisa 法によるサイトカイン解析-80 ° C で保存します。
注: 手順 1.16 1.17 と 2.14 のように西部のしみや PCR など技術のセルを用意できます。
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Representative Results
マウス骨骨髄由来マクロファージは、骨髄の造血細胞前駆体から培養することができます。骨髄吸引から大腿骨および脛骨 1 つ c57bl/6 マウスの通常プールをもたらす 107骨髄由来マクロファージ、それらにマクロファージ実験のための便利なソースを作るします。BMDMs は、ベース抗体薬物反応を炎症性刺激体外挑戦されたときをテストする使用できます。図 1に示す Gammunex (GX) + LP 増加抗炎症サイトカインの生産、IVIg ブランド IL-10, LPS 刺激だけで (図 1A) と比較して、生産の IL-12/23 p 40 (図 1 を減少させます B)。図 1はまた異なる IVIg 製剤、動作が異なることを示します。IVIg の 3 つの異なる製剤が IL-12/23 の p 40 大幅 (図 1B)、Octagam (OG) と Gammagard を減らすことができる液体 (GL) が IL 10 生産組合 (図 1に応答を大幅増加しません。A). OG と GL が LP、GX よりも程度に応じてで IL-12/23 p 40 の生産を大幅に削減することができます。これらの結果は、抗体に影響を与える骨髄由来マクロファージ活性化であることと、応答の変化を引き起こすことができます同じ薬剤の準備の違いがあることを示しています。
BMDMs は西部にしみが付くことによって免疫グロブリンの機械的効果をテストする使用できます。IC + LPS 活性化マクロファージは、p38、Erk1/2 増加 IL 10 生産21に責任があるマイトジェン活性化タンパク質 (地図表示) キナーゼのリン酸化を増加しています。図 2の結果表示が刺激される、または LPS、IVIg、または IVIg + LPS で刺激されているマクロファージによる IL 10 生産に必要な MAP キナーゼ活性を検出する典型的な西部のしみ。IVIg 単独で刺激や IVIg + 組合共刺激 MAP キナーゼ活性の上昇 Erk1/2 LP だけで見ると比較して以前と長期のリン酸化。P38 の活性化は、以前マクロファージ IVIg + lps 単独でこれらの刺激と比較して LPS 刺激で発生しました。これらの結果は、セルシグナ リング BMDMs に対する抗体薬の効果を示すため西部のしみが付くことなどの方法を使用できますを示します。サイトカイン産生に加えて MAP キナーゼ活性は抗炎症マクロファージ活性化が発生したことを示すため使用できます。
成熟した、その組織マクロファージは、IVIg 5.0 x 10 の5つの応答を評価するためにマウスから分離することができます - 1.0 x 106腹腔マクロファージは 1 つの健康的な c57bl/6 マウスから分離できます。図 3、IVIg 投与マウスの腹腔マクロファージはない大幅増産 IL 10 不在で刺激体外、PBS 注入マウスと比較されました。IVIg から腹腔マクロファージを注入する、マウスは前のヴィヴォLPS で刺激、PBS 投与マウスよりの 6 の IL 10 を出します。ただし、検出可能な量の IL-12/23 p 40前のヴィヴォLPS で刺激したときは生成されません、彼ら。これらの結果は、体内薬物を注入して、このメソッドとex vivo細胞、培養によってマクロファージに対する抗体の効果をテストことができることを示しています。
抗体、炎症性刺激に大食細胞の応答は、 in vivo評価をすることができます。サイトカイン産生は洗浄液で評価することができますおよび前のヴィヴォから上清中に腹腔マクロファージを刺激します。図 4に示す抗炎症サイトカイン IL-10 は洗浄液 (図 4A)、腹膜の細胞 (図 4B) とマクロファージ (図 4C) で増加マウスIVIg + PBS + LP と比較して組合に立ち向かっています。洗浄液ではなく培養マクロファージで、IL-12/23 p 40、プロ炎症性サイトカイン サブユニットの生産は大幅に削減します。このメソッドは、生体内の炎症反応と同様にex vivo抗体医薬の影響の検討できます。
図 1: IVIg と LPS の別のブランドの共刺激に応えてマクロファージ IL-10 と IL-12/23 p 40 生産。C57BL/6 MCSF 骨髄由来マクロファージか些細 (C)、または lps 刺激 (10 ng/mL)、IVIg (30 mg/mL)、または IVIg + LP。IVIg の 3 つの異なるブランドをテストした: Gammunex (GX)、Gammagard 液 (GL) と Octagam (OG)。マクロファージ培養上清は、刺激後 24 h を収集され、遠心分離によって明らかに。IL-10 (A) と (B) IL-12/23 p 40 の Elisa を行った。データは、マクロファージ n から = 3 が独立した実験、実験、Elisa あたり 1 個体のマウスから細胞が複製でアッセイします。データは、平均 ± SD. *P < 0.05、* * P < 0.001、* * *P < LPS 刺激し IVIg と比較 0.0001 + 組合共刺激。一方向の分散分析 (ANOVA) 多重比較のためのテューキー事後テストでは、統計分析に使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: IVIg 活性化マクロファージにおける MAP キナーゼ活性の西部のしみの分析。MCSF は骨髄由来マクロファージが些細または LPS 刺激を受けた (10 ng/mL)、GX IVIg (30 mg/mL)、または GX IVIg + LP;0、10、40、または 120 分全セル lysates (1.0 x 106マクロファージ/レーン) が施されたナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミドのゲルの電気泳動 (SDS-PAGE) と西洋の p38 リン酸化特異的抗体としみが付くと細胞外ローディング コントロールとしてグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) と同様、シグナル調節キナーゼ (Erk1/2)。表示結果が n = 3 が独立した実験、実験あたり 1 個体のマウスから細胞。各バンドの下 3 の独立した実験から平均 GAPDH に正規化 pp38 と pErk1/2 タンパク質レベルのデンシトメトリーのとおりです。この図は、Kozickyら8から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: IVIgの体内に挑戦マウスからマクロファージによる IL 10 生産。8 週齢の c57bl/6 マウスは、腹腔内滅菌 PBS (インジェクション コントロール) または GX IVIg (2.5 g/kg) を与えられました。1 時間後マウスを安楽死させ、腹膜洗浄を行った。マクロファージは、密着性の選択を使用して分離されました。どちらか些細 (C)、または LPS 刺激によるマクロファージ (10 ng/mL)。細胞培養上清は、収穫され、IL-10 Elisa の 24 h 後明らかに。データは、n = 3 の独立した実験は、Elisa 実行グループあたり 5 個々 のマウスが重複でアッセイします。データは、平均 ± SD. * P < 0.01 と NS = 重要ではないです。統計分析は、複数の比較のため Sidak のポストテストで双方向の分散分析を使用して行った。この図は、Kozickyら8から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: IL-10 と IL-12/23 p 40 マウス IVIg + LP 挑戦産生体内で。8 週齢の c57bl/6 マウス コントロールとして PBS + LP (0.2 μ g/g 体重) を腹腔内に注入しました。または GX IVIg (2.5 g/kg 体重) + LP (0.2 μ g/g 本体重量)。1 時間後マウスを安楽死させ、腹膜洗浄を行った。(A) 明らかに洗浄液、(B) 1 h マクロファージ遵守手順中に腹腔細胞からエアコンの上清を明らかにし、(C) 明らかに 24 h の測定した腹腔マクロファージ (Mφ) 清IL-10 と IL-elisa 法による 12/23 p 40。データは平均 ± SD n = 3 の独立した実験で 5 マウス Elisa と重複でアッセイします。P < 0.05 * *P < 0.01 * * *P < 0.001 と NS = 重要ではないです。PBS + LPS 投与マウスは IVIg + スチューデントのt検定を使用して LPS 投与マウスと比較しました。この図は、Kozickyら8から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
マクロファージ活性化状態は、恒常性と疾患22を組織と両方で重要な役割を果たします。マクロファージはその微小環境3の手掛かりによって、アクティブ化の状態の重複だけでなく、個別に持つことができます。炎症性応答のすべての段階に個別の役割がある: 病原体に対する防衛、創傷治癒と組織の反発、また炎症性応答2 をオフにすることが重要です明確な抗炎症活性化状態にあります。.抗炎症マクロファージ活性化には、抗炎症サイトカイン、IL-10、およびプロ炎症性サイトカイン IL 1223などの少量の大量に生産する大食細胞の 2 つの外部刺激が必要です。抗体 Fc のガンマの受容体を介して作用から来る 1 つの信号と 2 つ目の信号、LPS や肝腎などのプロ炎症性刺激24,25。マクロファージ8,23,25,26で高 IL-10-水田抗炎症活性化状態を誘導するためには、抗 tnf α 抗体、免疫複合体血清のすべてを発見されています。私たちのグループは、マウス骨髄由来マクロファージとマクロファージの IVIg 刺激も IL-10 と少しにないプロ炎症性 IL-12/23 p 40 組合8に応えて大量を生成することに以前公開しています。また、他のプロ炎症性サイトカイン TNF, il-6 が骨髄由来マクロファージ8も IVIg による減少が発見しました。マウス BMDMs と腹腔マクロファージin vitroとin vivoで他の抗体による薬物応答をテストするのには、ここで説明する方法を適用できます。
マウス骨髄のマクロファージ抗体を用いた治療法のテストで多くの重要な手順があります。無菌性の維持は、各プロトコルにとって重要です。マクロファージの文化は空気、毛皮、またはマウスの糞便からの微生物で汚染されている場合、マクロファージは炎症性サイトカインを生産することによってそれらの刺激に対応します。バイオ セーフティ キャビネットのすべての実験を実行する、エタノール、マウスを自由にスプレーと腹膜フラッシュ中に腸の整合性の確保が欠かせません。抗体は、製造元の指示に従って格納され、滅菌にも保たれなければなりません。それは、それは汚染された、有効期限切れ、または濁った場合に使用できません。濁度は、薬剤の有効性を減らすし、薬適切な温度で保存されていないまたは余りに長くのために格納されている場合に発生することができます。IVIg は 4 ° C で保存し、IL 10 生産のレベルが影響を受けるので、期限に達する前にのみ使用できます。また、私たちは応答に影響しない、-20 ° C で凍結されることができることを見てきました。一方、図 1のように、IVIg ブランド製剤の種類はマクロファージの異なる応答を引き起こす可能性が、IVIg の異なった多くは同様の実験結果に します。エッセンシャル コントロールなど些細細胞、そして細胞刺激抗体だけで、各実験ではマクロファージまたは薬物汚染を排除するために含める必要があります。
実験をカスタマイズするこれらの議定書にいくつかの変更を行うことが。非炎症性の状態に十分な大規模な実験のためマクロファージを分離することは困難ことです。腹腔マクロファージは、thioglycollate (TG) の腹腔内投与によって誘発することができます。免疫反応が発生すると、および誘発マクロファージ 4 日後収穫27をすることができます。募集のマクロファージは成熟度も低く、私たちここでは、重要な考慮事項であるを使用している、常駐の細胞を表さない。TG 誘発マクロファージがまた TG スープは、貪食27に関する実験を行う場合は特に合併症がありますから寒天を内面化しています。さまざまな遺伝的背景、C57BL/6 または BALB/c マウス実験も使用できます、特定の遺伝的背景を必要とする疾患モデルで評価される大食細胞の応答に抗体の影響を調べるため選択可能性があります。さらに、我々 は私たち自身の仕事8に行っているIl10-/-マウスなどの遺伝子改変マウスを薬の作用メカニズムの特定の蛋白質の機能を評価するために使用可能性があります。さまざまな炎症性刺激は、マクロファージ活性化における抗体の影響を評価するためにも使用できます。肝腎、および受容体 (TLR) アゴニスト (ヒアルロン酸など) のような派生ホスト フリー ダイヤルは、IL 10 生産マクロファージ25,28をアクティブに使用されています。重要な考慮事項は、抗体の投与量です。抗体とサプライヤー間異なる線量必要があります文化と動物実験で最適な線量を求める滴定。選ばれた線量は人間に与えられる線量を反映する必要がありますもと薬間で異なります。IVIg はこれらプロトコル29,30で使用される滴定された用量を反映した高用量 (25-35 mg/mL または 2 g/kg 体重)、抗炎症療法として与えられます。
骨髄および腹腔マクロファージの使用制限があります。マクロファージ細胞株以上の改善、マウス BMDMs、造血前駆細胞からまだ人工的に派生セルです。大食細胞の in vitroの免疫応答をテスト理解の抗体応答に重要なステップですが、生体内で実験も実行する必要があります。刺激体内細胞の体外培養続いて注入抗体創薬も病気の状態で抗炎症マクロファージをアクティブにできるかどうかを調査するための将来の研究のための詳細を提供できます。これらの実験から何に抗体を用いた生物学的製剤を受けている人は、結論を出せない。いくつかの研究は、IVIg のひと単球由来マクロファージの培養に及ぼす影響を評価するために公開されています。IVIg が共同組合だけで12の刺激と比較して lps 刺激されるとき、IL-6 ひと単球の in vitroの生産数の減少を報告されています。IVIg が減り tnf α、il-6 産生 THP 1 ひと単球性プロカルシトニン (PCT) で刺激したとき細胞31。
本稿内プロトコルには、既存のメソッド上の利点があります。骨髄由来マクロファージとマクロファージは主細胞、マウスから直接ではなく細胞を不死化されています。マウス マクロファージ様細胞株 RAW264.7 細胞などは、賛成して炎症性サイトカインを生成しない IL-12 LP への応答では、IVIg8,13レスポンス内で生成される IL-10 で規制されている重要なサイトカインです。薬物体内lps テスト分析を通してローカル腹膜の環境洗浄液、腹膜の細胞と具体的には、マクロファージの薬の効果の検討を許可します。短期的には、病気のより長くより高価な動物モデルにおけるマクロファージ活性化の抗体の非特異的作用の検討を正当化するための重要な情報を提供することができます単純なモデルです。エンドトキシン血症モデルの実験的測定はしばしばだけマウスの生存率やサイトカイン血清14の上利点があります。生存率と血清サイトカインは、免疫応答の貴重な対策が、彼らを表示しない貢献マクロファージを具体的に持つことができます。分離及び培養マクロファージ挑戦実験から、抗体医薬がマクロファージに直接測定可能な影響を示しています。
これらのメソッドには、アプリケーションのテストおよび生物学的製剤の設計があります。抗体の治療薬としての使用は近年劇的に増加しています。ただし、これらの治療法には、マクロファージは抗体の Fc 部分を認識しサイトカイン生産を変えることができます、追加の不明な効果があります。IL-10 を誘導し、その Fc 部分を介して T 細胞の増殖を抑制する抗 tnf α 抗体インフリキシマブが示されているし、それがアクション7,15,26のメカニズムの一つとして提案されています。遺伝的モデルを使用すると、特定の蛋白質がこれらの薬は、マクロファージ活性化に影響を与えるメカニズムに関与することができます。抗体の調製及び IgG 抗体のクラスは、生物学的製剤でのマクロファージの影響を変更する変更できます。準備のことや、同じ抗体医薬 (IVIg) のストレージことができますマクロファージ活性化に及ぼす影響に影響を与えます。このペーパー内のメソッドは、がん治療中に食餌を維持するために重要な抗炎症マクロファージが腫瘍の進行を促進するかもしれない可能性がありますこれらの効果がない治療を設計する使用できます。これらの技術は、設計および必要であればこれらの効果を持っている薬の評価にも使えます。たとえば、マクロファージ炎症性応答を減らす、抗炎症の IL 10 生産マクロファージ炎症性腸疾患やリウマチ性関節炎の治療を強化するを作成して有益なことがあります。
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Disclosures
著者はある利益相反を開示します。
Acknowledgments
L.K. は、ブリティッシュ ・ コロンビアの大学 4 年間奨学金 (4YF) 大学院学生の身分賞の受信者です。L.M.S. は消化器のカナダの協会の受信者/クローン病、大腸炎カナダされて新しい調査官給与賞/健康研究、生物医学学者マイケル ・ スミス財団。この作品は、(# CIHR2016 LS を付与) 健康研究のカナダの協会と共同でカナダの血サービスからプロジェクトの助成金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM) | Life technologies | 12440053 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 12483-020 | |
| Recombinant murine macrophage colony stimulating factor (MCSF) | Stemcell technologies | 78059 | |
| Penicillin-streptomycin | Life technologies | 15140148 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X red blood cell lysis buffer | eBioscience | ||
| Cell dissociation buffer | Life technologies | 13150016 | Enzyme-Free, Hanks's-based, EDTA |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | From E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Gammagard liquid) | Baxter Healthcare Corporation | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| IVIg (Octagam) | Octapharma | Received from BC Children's Hospital, Transfusion Medicine | |
| Phosphate buffered saline (PBS) (sterile), pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| mouse IL-10 ELISA | BD biosciences | 555252 | |
| mouse IL-12/23p40 ELISA | BD biosciences | 555165 | |
| anti-Erk1/2 antibody | Cell signalling technology | 9101 | |
| anti-pp38 antibody | Cell signalling technology | 9211 | |
| anti-GAPDH antibody | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g needle | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL syringe | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL syringe | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL conical tube | BD biosciences | 352096 | |
| 50 mL conical tube | BD biosciences | 352070 | |
| microcentrifuge tube (1.7 mL) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 tissue culture treated flask | BD biosciences | 353136 | |
| Cell scraper | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | fine tip, dissecting |
| Scissors | VWR | 82027-582 | Delicate, 4 1/2" |
| Brightfield microscope | Motic | AE31 | Inverted phase contrast |
| Scale | Mettler | PE 3000 |
References
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