Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Espressione transiente di geni estranei in cellule di insetto (sf9) per analisi funzionale della proteina

Published: February 22, 2018 doi: 10.3791/56693
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University, 2Department of Agricultural Biology, College of Agriculture Life Sciences, Chonbuk National University, 3Department of Entomology, National Taiwan University

Summary

Questo protocollo descrive un sistema di espressione di proteina indotta da scossa di calore (sistema pDHsp/V5-His/sf9 cellulare), che può essere utilizzato per esprimere proteine straniere o per valutare l'attività anti-apoptotica di potenziali proteine straniere e loro troncato amminico acidi in cellule di insetto.

Abstract

Il sistema di espressione genica transitoria è una delle tecnologie più importanti per l'esecuzione di analisi funzionale della proteina in baculovirus in vitro sistema di coltura cellulare. Questo sistema è stato sviluppato per esprimere stranieri geni sotto il controllo del promotore baculovirus in plasmidi di espressione transiente. Inoltre, questo sistema può essere applicato a un'analisi funzionale del baculovirus sé o proteine straniere. Il sistema di espressione genica transitoria più ampiamente e commercialmente disponibile è sviluppato sul promotore del gene immediati-presto (IE) di Orgyia pseudotsugata virus nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Tuttavia, è stato osservato un livello basso di espressione di geni estranei in cellule di insetto. Di conseguenza, un sistema di espressione genica transitoria è stato costruito per migliorare l'espressione della proteina. In questo sistema, plasmidi ricombinanti sono stati costruiti per contenere la sequenza di destinazione sotto il controllo del promotore (Dhsp70) 70 di Drosophila calore shock. Questo protocollo presenta l'applicazione di questo calore shock-base pDHsp/V5-His (epitopo V5 con 6 istidina) /Spodoptera frugiperda cell sistema (sf9 cella); Questo sistema è disponibile non solo per l'espressione genica ma anche per valutare l'attività anti-apoptotica di candidato proteine in cellule di insetto. Inoltre, questo sistema può essere sia transfected con un plasmide ricombinante o co-trasfettate due plasmidi ricombinanti potenzialmente funzionalmente antagonistiche in cellule di insetto. Il protocollo dimostra l'efficienza di questo sistema e fornisce un caso pratico di questa tecnica.

Introduction

Due sistemi di espressione della proteina sono stati comunemente utilizzati per la produzione di proteine: sistemi di espressione proteica prokaryote (sistema di espressione del gene diEscherichia coli ) e sistemi di espressione della proteina dell'eucariota. Un sistema di espressione della proteina eucariote popolare è il baculovirus espressione vettoriale sistema (BEVS)1. Baculoviridae in primo luogo sono stati usati come agenti di controllo biologico in tutto il mondo dell'agricoltura e della foresta di parassiti. Negli ultimi decenni, Baculoviridae sono stati sviluppati come strumenti biotecnologici per vettori di espressione di proteine pure. I genomi di Baculoviridae sono costituiti da DNA circolare a doppia elica e avvolti i nucleocapsids2. Ad oggi, più di settantotto baculovirus isolati sono state sequenziate3. Basato sulla cascata temporale di baculovirus espressioni di gene in cellule di insetto ospitante, trascrizione genica poteva essere classificata in quattro cascate temporale, compreso immediati-presto, geni di in ritardo-inizio, fine e molto fine4.

BEVSs sono stati indicati in modo che i promotori di geni molto tardi (cioè, poliedro o p10 promotore) sono stati usati per guidare i geni bersaglio, mentre il baculovirus ricombinanti è stato generato da una ricombinazione omologa. Espressione delle proteine straniere in cellule di insetto di baculovirus ricombinanti è simile a quella delle proteine dei mammiferi a modificazioni post-traduzionali (adatti per la produzione di glicoproteina). Così, il baculovirus è stato ampiamente usato5,6,7. Tuttavia, una limitazione è la presenza di vie di N-glicosilazione differenti in cellule di insetto7.

Di conseguenza, un nuovo sistema di espressione di baculovirus, il sistema di espressione del gene transitoria, è stato sviluppato. Questo sistema esprime geni estranei sotto l'unità di baculovirus immediati-presto promotori (promotore diie-1 ) in cellule di insetto. Utilizzando questo sistema, la proteina bersaglio può essere espresso immediatamente sotto il controllo del promotore ie-1 durante la modifica la via di N-glicosilazione in cellule di insetto, con conseguente migliore oligosaccaridi N-collegati7. Inoltre, geni immediati-presto baculovirus sono trascritti dalla RNA polimerasi II cellula ospite e non richiedono alcun fattore virale per attivazione4. Di conseguenza, proteine straniere possono essere espresso in cellule di insetto in breve tempo. Ad oggi, il transitorio sistema di espressione genica è una delle tecnologie più importanti per l'esecuzione di saggi funzionali della proteina in baculovirus in vitro sistema di coltura cellulare. Il sistema può essere applicato per analizzare la funzione di baculovirus o proteine straniere. Uno dei sistemi di espressione genica transitoria commercialmente disponibile si basa sui promotori di geni immediati-presto (IE) di Orgyia pseudotsugata virus nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 e OpIE1 promotori).

Tuttavia, il livello inferiore di espressione di geni estranei in cellule di insetto era ancora un problema quando il sistema di espressione del gene transitoria basata sul promotore di OpIE è stato usato8,9,10. Così, un altro sistema di espressione genica transitoria è stato costruito in base il promotore della drosofila calore shock protein 70 (hsp70) gene di8,9. Il promotore di hsp70 funziona più efficientemente di baculovirus IE promotore quando indotta da shock termico in cellule di insetto10. In questo sistema, sono stati espressi i geni bersaglio sotto l'unità del promotore di Drosophila heat shock 70 (Dhsp70). Geni estranei possono essere facilmente clonati nel plasmide di espressione genica transitoria con i metodi di clonazione PCR-basati. Inoltre, il controllo di temporizzazione per l'espressione genica può essere eseguito tramite induzione di scossa di calore.

In questo rapporto, seguiamo l'approccio ed esprimere tre diversi troncamenti del gene di baculovirus (inibitore dell'apoptosi 3, iap3 da Lymantria xylina MNPV) utilizzando il sistema di espressione basati su scossa transitoria della proteina di calore e applicare ulteriormente queste proteine espresse sulla analisi delle attività anti-apoptotica. Questo sistema può sia esprimere proteine straniere rapidamente o essere applicato alla valutazione delle attività anti-apoptotica della proteina in cellule sf9, pur avendo anche il potenziale per essere applicato ad altre analisi di attività della proteina.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. preparati

  1. Coltura delle cellule dell'insetto
    1. Preparare 50 mL di mezzo di coltura cellulare. A tale scopo, aggiungere 500 µ l di antibiotici (anfotericina B = 0,25 µ g/mL, penicillina = 100 unità/mL, streptomicina = 100 µ g/mL) e 5 mL di siero bovino fetale inattivati al calore nel mezzo di coltura privo di siero cellulare (senza FBS o antibiotici).
      Nota: Riscaldare il siero bovino fetale a 65 ° C per 30 min in un bagno di acqua prima dell'uso.
    2. Mantenere Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), cellule di insetto sf9. Staccare ca. 80% delle cellule dal matraccio di cultura di 25cm2 cella agitando la beuta e verifica nell'ambito di microscopia. Quindi, trasferire 50% della sospensione delle cellule in un pallone di cultura cellulare di nuovo 25 cm2 e permettono alle cellule di allegare per 15 min a temperatura ambiente. Sostituire il mezzo con terreno di coltura di cellule fresche 5ml e crescere in un incubatore a 28 ° C. Cellule di passaggio ogni 2 o 3 giorni a seconda della crescita delle cellule.
  2. Preparazione di plasmidi per la transfezione delle cellule
    1. Per inserire i frammenti di DNA bersaglio (ad es., Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gene e suoi costrutti di eliminazione) in pDHsp/V5-His PCR-basata clonazione metodo11. Controllare la crescita di colonie trasformate dalla Colonia PCR usando PCR Master Mix (2 X) e il primer pDhsp-F2/Op-IE2R impostata. Confermare le sequenze di plasmide dal servizio commerciale sequenziamento.
      Nota: La tabella 1 elenca i primers utilizzati per PCR e i costrutti corrispondenti.
    2. Colonie batteriche sequenziate unica di cultura, che contengono le costruzioni di cui sopra plasmide (punto 1.2) in 200 mL LB medium contenente selezionato antibiotici (50 µ g/mL), rispettivamente.
    3. Estrarre i plasmidi dalla colta e. coli utilizzando Midi plasmide Kit secondo istruzioni12 del produttore.
  3. Preparare mezzo di placcatura con 1,5 mL di terreno di coltura cellulare e 8,5 mL di mezzo di coltura privo di siero cellulare.
  4. Preparare il terreno di coltura cellulare actinomicina D (ActD) aggiungendo 1,5 µ l di brodo ActD (1 mg/mL) in 10 mL di terreno di coltura cellulare (concentrazione finale = 150 ng/mL). Conservare a 4 ° C.

2. espressione transiente proteina

  1. Semina cellulare
    1. Raccogliere le cellule sf9 agitando il matraccio di cultura, rovesciare e cadere la sospensione cellulare per tubo da 50 mL e trasferire 10 µ l in emocitometro mediante una pipetta P10. Contare il numero delle cellule al microscopio ottico.
    2. Piastra 3 × 105 sf9 cellule in tutti i pozzetti in una piastra a 24 pozzetti per 15 min a temperatura ambiente. Sostituire il mezzo con 0,5 mL di mezzo di placcatura.
  2. Transfezione di plasmidi
    1. Reagente di transfezione cellulare diluito: diluire 8 µ l di reagente di transfezione delle cellule in 100 µ l mezzo di coltura privo di siero cella e mescolare nel Vortex per 1 s.
    2. Aggiungere 2 µ g del DNA del plasmide (pDHsp70-Ac-P35/V5-His o pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His o pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His o pDHsp70-Ly-IAP3-anello/V5-His) in 100 µ l di terreno di coltura cellulare privo di siero e mescolare nel Vortex per 1 s (Figura 2).
    3. Combinare il DNA del plasmide diluito e reagente di transfezione delle cellule diluito (210 µ l) e mescolare nel Vortex per 1 s. Incubare per 30 min a temperatura ambiente.
    4. Aggiungere 210 µ l di miscela di reagente di transfezione del DNA goccia a goccia sulle celle mediante una pipetta P1000. Incubare a 28 ° C per 5 h.
    5. Sostituire il mezzo di placcatura con 0,5 mL di mezzo di coltura cellulare utilizzando una pipetta P1000. La piastra a 24 pozzetti con nastro adesivo ed incubare le cellule a 28 ° C per 16 h.
  3. Le cellule trasfettate di scossa di calore: mettere il piatto in un bagno d'acqua di 42 ° C (galleggianti sulla superficie dell'acqua). Riscaldare per 30 min e riporre la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore di 28 ° C.
  4. Rilevazione dell'espressione della proteina
    1. Dopo 1 h o shock termico 5h, lavare le cellule con 0,5 mL di tampone PBS 1X brevemente tre volte.
      Nota: Diluire il tampone PBS 1x tampone PBS 10X aggiungendo 1 mL di tampone PBS 10X a 9 mL sterilizzato ddH2O
    2. Lisare le cellule con 40 µ l di 1 x tintura di caricamento SDS pipettando su e giù.
      Nota: Diluire 4 x tintura di caricamento SDS miscelando 30 µ l di tampone PBS 1X e 10 µ l di tampone campione SDS: 4x.
    3. I campioni della proteina a 98 ° C per 10 min in un blocco di calore di calore, rotazione verso il basso per 1 min e messo sul ghiaccio per l'analisi di Western blot.
    4. Western blot analisi
      Seguire la procedura di analisi occidentale della macchia da Eslami e Lujan13. Eseguire gel SDS-PAGE14: un gel sottoposto al blu di Coomassie macchiatura (controllo di carico per verificare che la quantità di proteina campioni caricati in ogni bene è uguale in quantità) e l'altro sottoposti a Western blot test, secondo Eslami e Lujan13 .
    5. Rilevare le proteine di fusione V5-taggati con anticorpo di coniglio anti-V5 (5 mg/mL) (diluizione 1: 5000 nel buffer di TBST a lavorare concentrazione 1 µ g/mL) e coniugato di capra anti-coniglio IgG-rafano perossidasi (HRP) (0,8 mg/mL) (diluizione 1: 10000 nel buffer TBST per lavoro concentrazione 0.08 µ g/mL).
      Nota: Regolare la percentuale di poliacrilammide al 17,5% quando il peso molecolare della proteina sia < 17 kDa.

3. anti-apoptotiche analisi di attività

  1. Apoptosi cellulare indotta da gene: ripetere la procedura di cui sopra da 2.1 a 2.3. Co-transfect 1 µ g di DNA (gene di induttore di apoptosi contenenti) pDHsp/D-rpr/bandiera-His plasmide con 1 µ g di DNA plasmidico [pDHsp70/V5-His vector (controllo negativo), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (controllo positivo), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His o pDHsp70-Ly-IAP3-anello/V5-His, rispettivamente.]. Alle 5h post-calore trattamento d'urto, condurre l'analisi di attuabilità delle cellule (Figura 2).
  2. Apoptosi cellulare indotta da chimica: ripetere la procedura di cui sopra da 2.1 a 2.3. Al punto 2.1.2, piastra 1 x 106 sf9 celle in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Transfect 4 µ g di DNA plasmidico [pDHsp70/V5-His vector (controllo negativo), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (controllo positivo), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His o pDHsp70-Ly-IAP3-anello/V5-His, rispettivamente.]. A scossa di post-calore 5h, trattiamo sf9 cellule con 2 mL di terreno di coltura cellulare ActD per 16 h e condurre l'analisi di attuabilità delle cellule (Figura 2).
    Nota: Volume minimo per coprire un pozzetto della piastra a 6 pozzetti è di 1 mL.
  3. Eseguire gli esperimenti di analisi attività anti-apoptotica sopra, tra cui 3.1 e 3.2 in triplici copie.

4. cellule

  1. Lavare le cellule trattate con l'aggiunta di 1 mL di tampone PBS 1X per 1 min 3 volte. Risospendere le cellule pipettando 1 mL di tampone di PBS 1x contenente blu di trypan 0,04% e macchia per 3 min a temperatura ambiente. Trasferire la sospensione cellulare in una microprovetta 1,5 mL.
    Nota: 0,4% trypan blu soluzione diluita da 9 mL di 1X PBS buffer e 1 mL 0,4% trypan blu soluzione di miscelazione.
  2. Trasferire 10 µ l trypan blu-macchiato cella sospensione per l'emocitometro con una pipetta P10 e contare le cellule vitali intatti sotto un microscopio chiaro.
  3. Analisi statistica
    1. Calcolare i dati registrati e presentare come il mezzo ± S.D. per tutti i conteggi.
    2. Analizzare i dati utilizzando il test di Student a due code t di con Microsoft Excel. Definire i dati statisticamente significativi come P-valore < 0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

L'intera lunghezza e altri due troncamenti (domini BIR e anello) di Ly-IAP3 da LyxyMNPV overexpressed in cellule sf9, basato sul calore shock-base pDHsp/V5-His /Spodoptera frugiperda (sf9 cella) sistema di celle. Il pDHsp/V5-His conteneva un promotore di un proteina di scossa calore di Drosophila , che aziona l'espressione genica a valle ad una temperatura di 42 ° C condizione utilizzando fattori trascrizionali cellulari e la traduzione del sistema (Figura 1)8 ,9,11. Il diagramma di flusso complesso tecnologico è illustrato nella Figura 2. Dopo 1 h o shock termico 5h, le cellule erano lisate con tampone del campione della proteina e sottoposti ad analisi Western blot per confermare l'espressione della proteina. I risultati hanno indicato che le proteine full-length, AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR e Ly-IAP3-RING, potrebbero essere rilevate in cellule trasfettate shock post-riscaldamento o 1 h o h 5. Inoltre, gli accumuli di proteina sono stati trovati a scossa di post-calore 5h (Figura 3). Così, secondo i dati, l'analisi funzionale della proteina è stata eseguita al punto di tempo espressione massima della proteina (scossa di post-calore 5h).

Sia l'apoptosi cellulare indotta da gene e apoptosi cellulare indotta da chimica potrebbero essere adattato a questo sistema per valutare l'attività anti-apoptotica (Figura 2). Per apoptosi cellulare indotta su gene, due costrutti (apoptosi induttore e destinazione costrutti genici a plasmide) erano co-trasfettate nelle cellule sf9 e quindi calore scioccato di espressione genica activite. Inoltre, la proteina anti-apoptotica Ac-P35 (controllo positivo) e una proteina di apoptosis-induttore (D-RPR) sono state anche espresse utilizzando questo sistema di espressione transitoria scossa di calore.

Dopo la scossa di calore, entrambi i geni cominciarono ad essere espresse e tradotto in proteine. Rispetto al vettore/D-RPR, il controllo positivo (Ac-P35/D-RPR) hanno mostrato l'attività di alta anti-apoptotici, che ha raggiunto fino all'80% del tasso di redditività. Dai risultati di attuabilità delle cellule dei altri costrutti, i ricercatori hanno potevano confrontare l'attività anti-apoptotica a vicenda o il controllo positivo (Figura 4A). Per apoptosi cellulare indotta da chimica, solo un costrutto è stato transfected nelle cellule sf9. Dopo 5 h shock di post-riscaldamento, i prodotti chimici (ActD) sono stati aggiunti e attuabilità delle cellule è stata misurata dopo 16 h (Figura 2). Confrontati con quelli del controllo positivo (AC-P35) o il controllo negativo (vettore), ogni costrutto ha mostrato i vari effetti sull'attività anti-apoptotica (Figura 4B).

Figure 1
Figura 1: Diagramma e del nucleotide sequenze di ly-iap3 costrutti di plasmide relativo basati sul vettore pDHsp/V5-His. Il codone di inizio (ATG) viene visualizzato in grassetto. Sottolineatura indica i siti di taglio degli enzimi di limitazione (HindIII nel colore rosso; BamHI in colore blu); la sequenza di colore verde indica la regione del promotore Dhsp70. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: il diagramma di flusso di scossa di calore indotto da sistema di espressione della proteina (sistema cellulare pDHsp/V5-His/sf9). Apoptosi cellulare indotta da gene e trattamenti di apoptosi indotta da chimica delle cellule sono stati indicati per la fase iniziale (co-transfezione con il plasmide gene induttore di apoptosi) o per il passaggio successivo dopo shock termico (apoptosi indotta da sostanze chimiche), rispettivamente, per test anti-apoptosi. Modificata figura e leggenda riprodotto con permesso di Springer11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: la sovraespressione di AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR e Ly-IAP3-RING mediante shock termico indotto da sistema di espressione della proteina (sistema cellulare pDHsp/V5-His/sf9). A 1 h o h 5 post calore shock, i lisati cellulari sono state raccolte e sottoposti ad analisi occidentale della macchia e SDS/PAGE. (A) analisi Western blot con l'anticorpo α-V5 e (B) SDS/PAGE colorati con blu di Coomassie come il controllo di caricamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Analisi di redditività per D-rpr o apoptosi indotta da actinomicina D. (A) sf9 cellule sono state trasfettate con pDHsp70/V5-His vector (vettore solo) e co-trasfettate pDHsp70/drpr/bandiera-His con pDHsp70/V5-His vettoriale, pDHsp70/Ac-P35/V5-His, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-His, pDHsp70 / Ly-IAP3-anello/V5-His, rispettivamente. Le differenze tra vettore e P35 e tra vettore e Ly-IAP3 sono statisticamente significative (t-test; P < 0,05). (B) sf9 cellule transfected con pDHsp70/V5-His vettoriale o pDHsp70/Ac-P35/V5-His, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-His, pDHsp70/Ly-IAP3-anello/V5-His, rispettivamente, a 5 h dopo shock termico, ActD è stato aggiunto e più successivamente, 16 h l'attuabilità delle cellule è stata misurata. La differenza tra vettore e P35 è statisticamente significativa (t-test; P < 0,05). Modificata figura e leggenda riprodotto con permesso di Springer11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome Sequenze
pDHsp-IAP3-HindIII-F A 5 minuti-GGAAGCTTACCATGGACGACGAACGACGCAG-3 ´
pDHsp-IAP3-BamHI-R A 5 minuti-GCGGATCCCGGATGTAGGAACACCTTGA-3 ´
iap3-BIR-BamHI-r A 5 minuti-CGGGATCCCGGCAGATCGCCGCCGCGGA-3 ´
iap3-anello-HindIII-F A 5 minuti-GGAAGCTTACCGAGCTCATAAAAAGGCCCGT-3 ´
pDhsp70-F2 A 5 MINUTI-CTGCAACTACTGAAATCAACCAAG-3 ´
Op-IE2R A 5 MINUTI-GACAATACAAACTAAGATTTAGTCAG-3 ´

Tabella 1: I set di primer utilizzati per metodo di clonazione basata sulla PCR. * Le coppie di basi del DNA sottolineate indicato i siti degli enzimi di limitazione. L'elenco di primer modificati riprodotto con il permesso di Springer11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Il concetto di sistema basati su shock cellulare pDHsp/V5-His/sf9 calore era in primo luogo descritto da Clem et nel 19948. Confronto del promotore del gene di baculovirus (IE1) e Drosophila hsp70 ha mostrato che quel hsp70 aveva una maggiore efficienza nella zanzara cellule10. Inoltre, a causa dell'induzione di scossa di calore, la tempistica dell'espressione della proteina potrebbe essere controllata precisamente dopo trattamento di shock termico. Questo sistema è stato quindi applicato per le analisi funzionali della proteina di gamberi e nucleopolyhedrovirus (NPV) proteine IAP9,11. In questo protocollo, sono stati utilizzati un totale di 6 costruzioni di plasmide: tre (pDHsp/V5-His, pDHsp/Ac-p35/V5-His e pDHsp/D-rpr/bandiera-His) sono stati forniti da Jian-Horng Leu9e le altre tre costruzioni (pDHsp-iap3/V5-His, pDHsp-iap3-BIR/V5-His, e pDHsp-iap3-anello/V5-His) sono stati costruiti da Nai et al., 201611. Sembra che questo promotore nell'insetto cellule opere più efficientemente dei promotori di geni di baculovirus. Tuttavia, durante la manipolazione del presente protocollo, ci sono diversi punti che devono essere considerati. Prima di transfezione di plasmide, controllando l'inserimento della sequenza del DNA è importante per l'espressione genica; così, dovrebbe essere fusa con l'epitopo V5 per formare una proteina di fusione V5-tag alla fine della sequenza di destinazione. Inoltre, tag di fusione diversi (cioè, bandiera epitopo) potrebbe essere progettato anche nel vettore basato su pDHsp per un'analisi in vitro della proteina obbligatoria. Questa procedura di estensione sarebbe utile indagare ulteriormente di interazioni proteina-proteina9. Pertanto, l'anticorpo policlonale di V5 commerciale potrebbe essere utilizzata per la rilevazione di proteine. Il rapporto di transfezione in cellule di insetto diversi deve essere testato prima dell'esperimento. Tassi più bassi di transfezione potrebbero comportare non rilevabile dell'espressione della proteina; così, un vettore di pDHsp contenente un gene adatto rapporto (cioè, verde reagiscono in gene) potrebbe essere transfected nelle cellule di insetto per valutare l'efficienza di trasfezione.

La limitazione principale di questa piattaforma di espressione scossa di calore è il livello di espressione della proteina. In alcuni casi, un livello di espressione della proteina bassa è stato trovato. Secondo uno studio pilota, non c'era nessun significativo effetto dose-dipendente che si è verificato quando più il DNA del plasmide è stato transfected nelle cellule sf9 (dati non mostrati). Così, questo effetto può essere causato dal proteasoma ubiquitina (UPP) o altri meccanismi sconosciuti11. I ricercatori dovrebbero esaminare l'espressione di proteine in presenza di inibitore del proteosoma (cioè, MG-132) per chiarire e recolve questo numero11. L'altra limitazione è che la produzione sostenibile di proteina connessa con il virus ricombinante non poteva essere raggiunto. Così, la stabilizzazione e la quantità di espressione della proteina sono inoltre preoccupazioni per quanto riguarda questo sistema. Pertanto, un corso di tempo di produzione di proteine deve essere testato anche dall'analisi di Western blot prima l'analisi funzionale. In questo protocollo, abbiamo confrontato due punti temporali (1 e 5 h dopo shock termico) e osservate l'accumulo di produzione di proteine bersaglio da 1 h a 5 h. Un aumento in intervalli di tempo è suggerito al fine di determinare le migliori condizioni di temporizzazione per l'analisi funzionale della proteina.

Per la proteina analisi funzionale, la proteina anti-apoptotica Ac-P35 (controllo positivo) e una proteina di apoptosis-induttore (D-RPR) inoltre sono state espresse utilizzando questo sistema di espressione transitoria scossa di calore. Queste due proteine sono descritti come antagonisti funzionali9,11,15. Di conseguenza, il vettore/D-RPR e Ac-P35/D-RPR potrebbe servire come un controllo negativo e positivo, rispettivamente. Utilizzando questo confronto, l'attività anti-apoptotica di proteine bersaglio potrebbe essere determinata.

Il protocollo presentato potrebbe fornire una piattaforma per esprimere proteine straniere più rapidamente o poteva essere applicato per valutare l'attività anti-apoptotica della proteina in cellule di insetto. Una volta che i ricercatori ottenere i risultati preliminari della funzione della proteina, questo sistema potrebbe essere utilizzato per ulteriori studi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Si ringrazia il Dr. Jian-Horng Leu dell'Istituto di Biologia Marina, National Taiwan Ocean University per la fornitura di 3 costruzioni di plasmide. Questa ricerca è stata sostenuta da Grant 106-2311-B-197-001 - dal Ministero della scienza e della tecnologia (MOST).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic, 100X Gibco 15240-062 for insect cell culture
Certified Foetal Bovine Serum Bioind 04-001-1A
Sf-900 II SFM Thermo Fisher 10902096 serum-free cell culture medium
Sf9 cells ATCC CRL-1711
25cm2 cell culture flask Nunc, Thermo Fisher 156340
Inverted light microscopy WHITED WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell Bioman RH618-J80 Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller) Bioman LBL407
Agar, Bacteriological Grade Bioman AGR001
Zeocin Invitrogen ant-zn-1 selection antibiotic
PCR Master Mix (2X) ThermoFisher K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Geneaid PIE25
Actinomycin D SIGMA A9415
Corning 50 mL centrifuge tubes SIGMA CLS430829-500EA 50 mL tubes
Hemocytometer Gizmo Supply Co B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 142475 24-well plate
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher 10362100 cell transfectin reagent
PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 Thermo Fisher AM9624
4×SDS Loading Dye Bioman P1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) Merck Milipore IPVH00010 PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell system BIO-RED 1703930 Blotting device
Ponceau S solution SIGMA 6226-79-5
Anti-V5 SIGMA V8137 rabbit anti-V5 antibody
Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) Jackson 111-035-003
Tween 20 Merck 817072
6-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 145380
0.4 % trypan blue solution AMRESCO K940-100ML
P10 pipetman Gilson F144802
P1000 pipetman Gilson F123602
Tape Symbio PPS7 24 well tape ( 19 mm×36 M)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
  2. Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).
  3. Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).
  4. Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).
  5. Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
  6. Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
  7. Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
  8. Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
  9. Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
  10. Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
  11. Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
  12. Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from: http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf (2017).
  13. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017).
  15. Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).

Tags

Genetica problema 132 espressione transiente analisi funzionale della proteina sf9 linea cellulare Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus Ly-inhinbitor di apoptosi-3 Drosophila heat shock 70 promotore pDHsp/V5-His Drosophilia Mietitore actinomicina-D
Espressione transiente di geni estranei in cellule di insetto (sf9) per analisi funzionale della proteina
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, J. C., Lee, S. J., Kim, J.… More

Chang, J. C., Lee, S. J., Kim, J. S., Wang, C. H., Nai, Y. S. Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay. J. Vis. Exp. (132), e56693, doi:10.3791/56693 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter