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Genetics

Expression transitoire de gènes étrangers dans des cellules d’insecte (sf9) pour l’analyse fonctionnelle de la protéine

Published: February 22, 2018 doi: 10.3791/56693
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University, 2Department of Agricultural Biology, College of Agriculture Life Sciences, Chonbuk National University, 3Department of Entomology, National Taiwan University

Summary

Ce protocole décrit un système d’expression de protéine induite par le choc de chaleur (système de pile à pDHsp/V5-His/sf9), qui peut être utilisé pour exprimant des protéines étrangères ou évaluation de l’activité anti-apoptotique de protéines étrangères potentiels et leur tronqué amine acides dans les cellules d’insectes.

Abstract

Le système d’expression de gène transitoire est une des technologies plus importantes permettant d’effectuer l’analyse fonctionnelle de protéines dans le baculovirus in vitro système de culture cellulaire. Ce système a été développé pour des gènes étrangers expriment sous le contrôle du promoteur baculoviral dans les plasmides d’expression transitoire. En outre, ce système peut être appliqué à un test fonctionnel du baculovirus lui-même ou des protéines étrangères. Le système d’expression génétique transitoire plus largement et commercialement disponible est développé basé sur le promoteur du gène précoce immédiat (IE) de Orgyia pseudotsugata pourcentage nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Cependant, un niveau faible expression de gènes étrangers dans des cellules d’insectes a été observé. Par conséquent, un système d’expression de gène transitoire a été construit pour améliorer l’expression de la protéine. Dans ce système, les plasmides recombinants furent construits pour contenir la séquence cible sous le contrôle du Drosophila chaleur choc 70 (Dhsp70) promoteur. Ce protocole présente l’application de cette chaleur axée sur le choc pDHsp/V5-His (épitope V5 avec 6 histidine) /Spodoptera frugiperda cellule système (cellules sf9) ; ce système est disponible non seulement pour l’expression des gènes mais aussi pour évaluer l’activité anti-apoptotique des protéines de candidat dans des cellules d’insecte. En outre, ce système peut être soit transfecté avec un plasmide recombinant ou transfectées conjointement deux plasmides recombinants potentiellement fonctionnellement antagonistes dans des cellules d’insecte. Le protocole montre l’efficacité de ce système et fournit un cas pratique de cette technique.

Introduction

Deux systèmes d’expression de protéines ont été couramment utilisées pour produire des protéines : systèmes d’expression de protéine procaryote (système d’expression géniqueEscherichia coli ) et des systèmes d’expression protéine eucaryote. Un système d’expression de protéine eucaryote populaire est les baculovirus expression vector system (BEVS)1. Les baculovirus ont été utilisées comme agents de lutte biologique dans le monde entier d’agricoles et sylvicoles nuisibles. Dans les dernières décennies, les baculovirus ont été élaborés comme des outils biotechnologiques pour les vecteurs d’expression protéique ainsi. Le génome des baculovirus composé d’ADN à double brin circulaire et enveloppé de nucléocapsides2. À ce jour, plus de soixante dix-huit baculovirus isolats ont été séquencées3. Se fondant sur la cascade temporelle des baculoviral expressions de gènes dans des cellules d’insecte hôte, la transcription des gènes pouvait être classée dans quatre cascades temporelles, dont précoces immédiats, gènes retardé, début, fin et très fin4.

BEVSs ont été désignées pour que les promoteurs de gènes très fin (c.-à-d.polyèdre ou p10 promoteur) ont été utilisées pour conduire les gènes cibles, tandis que le baculovirus recombinant a été généré par recombinaison homologue. Expression des protéines étrangères dans des cellules d’insecte de baculovirus recombinant est similaire à celle des protéines de mammifères aux modifications post-traductionnelles (adaptées pour la production de glycoprotéines). Ainsi, le baculovirus a été largement utilisé5,6,7. Toutefois, l’une des limites sont la présence de différentes voies de la N-glycosylation dans des cellules d’insecte7.

Par conséquent, un nouveau système d’expression baculovirus, le système d’expression génétique transitoire, a été développé. Ce système exprime des gènes étrangers dans le lecteur de baculoviral promoteurs précoces immédiats (c’est à dire 1 promoteur) dans des cellules d’insecte. En utilisant ce système, la protéine-cible peut être exprimée immédiatement sous le contrôle du promoteur c’est à dire 1 tout en modifiant la voie N-glycosylation dans des cellules d’insecte, résultant en une meilleure oligosaccharides liés à N7. En outre, baculoviral gènes précoces immédiats sont transcrits par l’ARN polymérase II la cellule-hôte et ne nécessitent pas de n’importe quel facteur viral pour activation4. Par conséquent, protéines étrangères peuvent être exprimées dans des cellules d’insecte dans de brefs délais. À ce jour, le transitoire, système d’expression génique est une des technologies plus importantes permettant d’effectuer des tests fonctionnels de protéine dans le baculovirus in vitro système de culture cellulaire. Le système peut être appliqué pour analyser la fonction de baculovirus ou de protéines étrangères. Parmi les systèmes d’expression génétique transitoire disponibles dans le commerce repose sur les promoteurs de gènes précoces immédiats (IE) de Orgyia pseudotsugata pourcentage nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (promoteurs de OpIE2 et OpIE1).

Cependant, le plus faible niveau d’expression de gènes étrangers dans des cellules d’insecte était toujours un problème lorsque le système d’expression de gène transitoire axée sur le promoteur OpIE a été utilisé8,9,10. Ainsi, un autre système d’expression de gène transitoire a été construit selon le promoteur de la drosophile chaleur choc protéine 70 (hsp70) gène8,9. Le promoteur de hsp70 fonctionne plus efficacement que le promoteur baculoviral IE lorsque induite par choc thermique dans des cellules d’insecte10. Dans ce système, les gènes cibles ont été exprimés dans le lecteur de 70 (Dhsp70) promoteur de Drosophila chaleur choc. Des gènes étrangers peuvent être facilement clonés dans le plasmide d’expression génétique transitoire par clonage des méthodes basées sur la PCR. En outre, le contrôle du moment pour l’expression des gènes peut être effectué par induction de choc thermique.

Dans ce rapport, nous suivons la démarche et exprimer trois troncatures différentes du gène baculoviral (inhibiteur de l’apoptose 3, iap3 de Lymantria xylina MNPV) en utilisant le système d’expression de protéine transitoire axée sur le choc thermique et d’appliquer ces protéines exprimées sur l’analyse de l’activité anti-apoptotique. Ce système peut exprimer soit rapidement de protéines étrangères ou être davantage appliqué à l’évaluation de l’activité de la protéine anti-apoptotique dans les cellules sf9, tout en ayant le potentiel pour être appliquée à d’autres tests d’activité protéine.

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Protocol

1. les préparatifs

  1. Culture cellulaire insectes
    1. Préparer 50 mL de milieu de culture cellulaire. Pour ce faire, ajouter 500 µL d’antibiotiques (amphotéricine B = 0,25 µg/mL, la pénicilline = 100 unités/mL, streptomycine = 100 µg/mL) et 5 mL de sérum bovin fœtal inactivés par la chaleur dans le milieu de culture sans sérum cellulaire (sans antibiotiques ou FBS).
      Remarque : Faire chauffer le sérum de veau fœtal à 65 ° C pendant 30 min dans un bain d’eau avant utilisation.
    2. Maintenir Spodoptera frugiperda (Lepidoptera : Noctuidae), des cellules d’insecte sf9. Détacher environ 80 % des cellules du flacon de culture cellulaire 25 cm2 en agitant le flacon et vérifiez sous microscopie optique. Ensuite, transférer 50 % de la suspension cellulaire dans un nouveau flacon de culture 25 cm2 cellulaire et permettent les cellules attacher pendant 15 min à température ambiante. Remplacez le support par 5 mL de milieu de culture cellulaires fraîches et de grandir dans un incubateur à 28 ° C. Cellules de passage tous les 2 à 3 jours selon la croissance cellulaire.
  2. Préparation des plasmides pour la transfection de cellules
    1. Insérez les fragments d’ADN cible (par exemple, Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gène et ses constructions de suppression) dans pDHsp/V5-His par PCR-based clonage méthode11. Vérifier la croissance des colonies transformées en colonie PCR à l’aide de la PCR Master Mix (2 X) et l’amorce de pDhsp-F2/Op-IE2R défini. Confirmez les séquences de plasmide en service commercial de séquençage.
      Remarque : Le tableau 1 répertorie les amorces utilisées pour PCR et les constructions correspondantes.
    2. La culture unique séquencé des colonies bactériennes, qui contiennent les constructions de plasmide susmentionnés (étape 1.2) dans 200 mL LB moyen contenant choisi antibiotiques (50 µg/mL), respectivement.
    3. Extraire les plasmides de la cultivé e. coli à l’aide de Kit de plasmide Midi selon les instructions de fabricant12.
  3. Préparer médium placage en mélangeant 1,5 mL de milieu de culture cellulaire et 8,5 mL de milieu de culture sans sérum cellulaire.
  4. Préparer le milieu de culture cellulaire de l’actinomycine D (ActD) en ajoutant 1,5 µL de ActD stock (1 mg/mL) dans 10 mL de milieu de culture cellulaire (concentration finale = 150 ng/mL). Conserver à 4 ° C.

2. expression transitoire de la protéine

  1. Cellule de semis
    1. Récolter les cellules sf9 en agitant le flacon de culture, renverser et tomber la suspension cellulaire au tube de 50 mL, transférer 10 µL dans hémocytomètre par une pipette P10. Compter le nombre de cellule sous un microscope optique.
    2. Plaque de 3 cellules sf9 de5 × 10 dans chaque puits dans une plaque 24 puits pendant 15 min à température ambiante. Remplacez le support par 0,5 mL de milieu de placage.
  2. Transfection des plasmides
    1. Réactif de transfection de cellules diluées : diluer 8 µL de réactif de transfection de cellules dans 100 µL un milieu de culture sans sérum cellulaire et mélanger au Vortex pendant 1 s.
    2. Ajouter 2 µg d’ADN (pDHsp70-Ac-P35/V5-His pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His ou ou pDHsp70-Ly-IAP3-bague/V5-His) plasmidique dans 100 µL de milieu de culture sans sérum cellulaire et mélanger au Vortex pendant 1 s (Figure 2).
    3. Combiner l’ADN de plasmide dilué et réactif de transfection de cellules dilué (210 µL) et mélanger au Vortex pendant 1 s. Incuber pendant 30 min à température ambiante.
    4. Ajouter 210 µL du mélange de réactif de transfection d’ADN goutte à goutte sur les cellules par une pipette P1000. Incuber à 28 ° C pendant 5 h.
    5. Remplacer le médium placage avec 0,5 mL de milieu de culture cellulaire à l’aide d’une pipette P1000. Sceller la plaque 24 puits avec du ruban adhésif et incuber les cellules à 28 ° C pendant 16 h.
  3. Les cellules transfectées de choc thermique : mettre la plaque dans un bain d’eau de 42 ° C (flottant à la surface de l’eau). Faire chauffer pendant 30 min et remettez la plaque 24 puits dans l’incubateur de 28 ° C.
  4. Détection de l’expression des protéines
    1. Après 1 h ou choc thermique 5 h, laver les cellules avec 0,5 mL de solution tampon PBS 1 x brièvement trois fois.
      NOTE : Diluer 10 x tampon PBS 1 x tampon PBS en ajoutant 1 mL de tampon PBS 10 x 9 mL stérilisé ddH2O
    2. Lyser les cellules avec 40 µL de 1 x SDS chargement colorant par pipetage de haut en bas.
      NOTE : Diluer 4 x SDS chargement colorant en mélangeant 30 µL de 1 x tampon PBS et 10 µL de 4 x SDS solution tampon.
    3. Chauffer les échantillons de protéine à 98 ° C pendant 10 min dans un bloc chauffant, tournez vers le bas pendant 1 min et mettre sur la glace pour l’analyse par transfert Western.
    4. Western blot assay
      Suivez la procédure d’essai par transfert Western du Eslami et Lujan13. Exécuter des gels de SDS-PAGE14: un gel soumis au bleu de Coomassie (contrôle de chargement pour vérifier que la quantité d’échantillons de protéines chargés dans chaque bien est égale au montant) et l’autre soumis à Western blot assay, selon Eslami et Lujan13 .
    5. Détecter des protéines de fusion V5 marquées avec des anticorps de lapin anti-V5 (5 mg/mL) (dilution 1 : 5000 dans un tampon TBST à travailler la concentration de 1 µg/mL) et chèvre anti-lapin IgG-raifort peroxydase de raifort (HRP) conjugué (0,8 mg/mL) (dilution 1 : 10000 dans un tampon TBST au travail concentration de 0,08 µg/mL).
      Remarque : Ajustez le pourcentage de polyacrylamide à 17,5 % lorsque le poids moléculaire de protéine d’être < 17 kDa.

3. anti-apoptotique analyse d’activité

  1. L’apoptose cellulaire induite par le gène : répéter la procédure précitée de 2.1 à 2.3. Transfecter Co 1 µg d’ADN (gène d’inducteur de l’apoptose contenant) pDHsp/D-rpr/pavillon-His plasmidique avec 1 µg d’ADN plasmidique [pDHsp70/V5-His vector (témoin négatif), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (contrôle positif), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3-bague/V5-His, respectivement.]. À 5 h chaleur après un traitement de choc, procéder à l’analyse de viabilité de cellules (Figure 2).
  2. L’apoptose cellulaire induite par le produit chimique : répéter la procédure précitée de 2.1 à 2.3. À l’étape 2.1.2, plaque 1 x 106 cellules sf9 dans chaque puits dans une plaque 6 puits. Transfecter 4 µg d’ADN plasmidique [pDHsp70/V5-His vector (témoin négatif), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (contrôle positif), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3-bague/V5-His, respectivement.]. À un choc thermique après 5 h, traiter les cellules sf9 avec 2 mL de milieu de culture cellulaire ActD pendant 16 h et procéder à l’analyse de viabilité de cellules (Figure 2).
    Remarque : Volume minimum pour couvrir un puits de la plaque 6 puits est de 1 mL.
  3. Réaliser les expériences dosage de l’activité anti-apoptotique ci-dessus, y compris les points 3.1 et 3.2 en géométrie.

4. analyse de viabilité de cellules

  1. Laver les cellules traitées en ajoutant 1 mL de solution tampon PBS 1 x pour 1 min 3 fois. Remettre en suspension les cellules en pipette 1 mL 1 x la solution tampon PBS contenant 0,04 % bleu trypan et tache pendant 3 min à température ambiante. Transférer la suspension cellulaire dans un microtube 1,5 mL.
    Remarque : Diluer la solution de bleu de trypan 0,4 % en mélangeant 9 mL de PBS de 1 x tampon et 1 mL bleu trypan de 0,4 % solution.
  2. Transférer 10 suspension de cellules colorées au bleu de trypan µL à l’hémocytomètre avec une pipette de P10 et de compter les cellules intactes viables sous un microscope optique.
  3. Analyse statistique
    1. Calculer les données enregistrées et de présenter les moyens ± S.D. pour chaque chef d’accusation.
    2. Analyser les données en utilisant le test de Student bilatéral t par avec Microsoft Excel. Qualifier les données statistiquement significatives P-valeur < 0,05.

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Representative Results

Toute la longueur et autres deux troncatures (domaines BIR et anneau) de Ly-IAP3 de LyxyMNPV étaient surexprimés dans les cellules sf9, basée sur la chaleur axée sur le choc pDHsp/V5-His /Spodoptera frugiperda cellulaire (cellules sf9). Le pDHsp/V5-His contenait un drosophile chaleur choc promoteur de la protéine, qui entraîne l’expression des gènes en aval à une température de 42 ° C condition en utilisant des facteurs de transcriptionnelles cellulaires et la translation system (Figure 1)8 ,9,11. L’organigramme d’ensemble technologique est illustré à la Figure 2. Après 1 h ou choc thermique 5 h, les cellules ont été lysées avec tampon protéique et soumis à l’essai par transfert Western pour confirmer l’expression de la protéine. Les résultats indiquent que les protéines pleine longueur, AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR et Ly-IAP3-RING, pourraient être détectés dans les cellules transfectées à un choc thermique après 1 h ou 5 h. En outre, l’accumulation de la protéine ont été trouvées à un choc thermique après 5 h (Figure 3). Ainsi, selon les données, l’analyse fonctionnelle de la protéine a été réalisée au moment de l’expression protéique maximale (5 h après un choc thermique).

Fois l’apoptose induite par le gène cellulaire et l’apoptose induite par le produit chimique cellulaire pourrait être adapté à ce système d’évaluation de l’activité anti-apoptotique (Figure 2). Pour l’apoptose induite par le gène, deux constructions (apoptose inducteur et cible gène plasmidique constructions) ont été conjointement transfectées dans des cellules sf9 et puis choc à l’expression des gènes activite thermique. En outre, la protéine anti-apoptotique Ac-P35 (contrôle positif) et une protéine d’apoptosis-inducteur (D-RPR) ont également été exprimées à l’aide de ce système d’expression transitoire de choc thermique.

Après un choc thermique, les deux gènes ont commencé à être exprimée et traduit en protéines. Par rapport au vecteur/D-RPR, le contrôle positif (Ac-P35/D-RPR) a montré une activité élevée anti-apoptotiques, qui atteint jusqu'à 80 % du taux de viabilité. Partir des résultats de la viabilité cellulaire des autres constructions, les chercheurs peuvent comparer l’activité anti-apoptotique à l’autre ou le contrôle positif (Figure 4 a). Pour l’apoptose induite par le produit chimique, qu’une construction a été transfectée dans des cellules sf9. Après un choc thermique après h 5, les produits chimiques (ActD) ont été ajoutés, et la viabilité cellulaire a été mesurée après 16 h (Figure 2). Comparées à celles du contrôle positif (AC-P35) ou le contrôle négatif (vecteur), chaque construction a montré les différents effets sur l’activité anti-apoptotique (Figure 4 b).

Figure 1
Figure 1 : Schéma et nucléotides séquences de ly- constructions de plasmide relativeiap3 basés sur pDHsp/V5-son vecteur. Le codon de début (ATG) est affiché en gras. Soulignement indique les sites de coupe des enzymes de restriction (HindIII en rouge ; BamHI dans la couleur bleue) ; la séquence dans la couleur verte indique la région promotrice de Dhsp70. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : l’organigramme du choc thermique induite par le système d’expression de protéine (système de pile à pDHsp/V5-His/sf9). L’apoptose cellulaire induite par le gène et les traitements de l’apoptose cellulaire induite par le produit chimique ont été indiqués à l’étape initiale (co transfection avec le plasmide de gène inducteur apoptose) ou à l’étape ultérieure après un choc thermique (l’apoptose induite par le produit chimique), respectivement, pour dosage des anti-apoptose. Mis à jour le chiffre et la légende reproduite avec la permission de Springer,11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : surexpression de AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR et Ly-IAP3-bague à l’aide d’un choc thermique induite par le système d’expression de protéine (système de pile à pDHsp/V5-His/sf9). À 1 h ou 5 h après chaleur le choc, les lysats cellulaires ont été récoltées et soumis à l’essai par transfert Western et SDS/PAGE. (A) essai par transfert Western avec anticorps α-V5 et (B) SDS/PAGE colorées au bleu de Coomassie que le contrôle de chargement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Essais de viabilité pour D-rpr ou l’apoptose induite par l’actinomycine D. (A) les cellules sf9 ont été transfectées avec pDHsp70/V5-son vecteur (vecteur seulement) et co transfectées pDHsp70/drpr/pavillon-His avec vecteur pDHsp70/V5-His, pDHsp70/Ac-P35/V5-His, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-His, pDHsp70 / Ly-IAP3-bague/V5-His, respectivement. Les différences entre vecteur et P35 et entre vecteur et Ly-IAP3 sont statistiquement significatives (t-test ; P < 0,05). (B) sf9 cellules ont été transfectées avec pDHsp70/V5-His vecteur ou pDHsp70/Ac-P35/V5-His, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-His, pDHsp70/Ly-IAP3-bague/V5-His, respectivement, à 5 h après un choc thermique, ActD a été ajoutée et 16 h plus tard, la viabilité cellulaire a été mesurée. La différence entre vectoriel et P35 est statistiquement significative (t-test ; P < 0,05). Mis à jour le chiffre et la légende reproduite avec la permission de Springer,11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Nom Séquences
pDHsp-IAP3-HindIII-F 5´-GGAAGCTTACCATGGACGACGAACGACGCAG-3´
pDHsp-IAP3-BamHI-R 5´-GCGGATCCCGGATGTAGGAACACCTTGA-3´
IAP3-BIR-BamHI-r CGGCAGATCGCCGCCGCGGAGGATCC5´-CG-3´
IAP3-anneau-HindIII-F 5´-GGAAGCTTACCGAGCTCATAAAAAGGCCCGT-3´
pDhsp70-F2 5´-CTGCAACTACTGAAATCAACCAAG-3´
Op-IE2R 5´-GACAATACAAACTAAGATTTAGTCAG-3´

Tableau 1 : les amorces utilisées pour la méthode de clonage basée sur la PCR. * Les paires de bases ADN soulignés indiquent les sites de l’enzyme de restriction. La liste mis à jour le primer reproduite avec la permission de Springer,11.

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Discussion

Le concept de système de pile à pDHsp/V5-His/sf9 axée sur le choc thermique a été décrite par Clem et al. , 1994,8. Comparaison du promoteur du gène baculoviral (IE1) et Drosophila hsp70 a montré que hsp70 avaient une plus grande efficacité en moustique cellules10. En outre, en raison de l’induction de choc thermique, le moment d’expression de la protéine pourrait être contrôlé précisément après le traitement de choc thermique. Ce système a ensuite été appliqué pour les essais fonctionnels de protéine de la crevette et les nucleopolyhedrovirus (NPV) IAP protéines9,11. Dans le présent protocole, un total de 6 constructions de plasmide ont été utilisés : trois (pDHsp/V5-His, pDHsp/Ac-p35/V5-His et pDHsp/D-rpr/pavillon-His) ont été fournis par Jian-khoudja Leu9et les trois autres constructions (pDHsp-iap3/V5-His, pDHsp-iap3-BIR/V5-His, et pDHsp-iap3-bague/V5-His) ont été construits par Nai et al., 201611. Il semble que ce promoteur en insecte cellules fonctionne plus efficacement que les promoteurs de gènes baculoviral. Cependant, au cours de la manipulation du présent protocole, il y a plusieurs points qui doivent être prises en considération. Avant la transfection de plasmide, vérifier l’insertion de la séquence d’ADN est important pour l’expression des gènes ; ainsi, il devrait être fusionné avec l’épitope V5 pour former une protéine de fusion V5-tag à la fin de la séquence cible. En outre, balises différentes de fusion (c'est-à-dire, drapeau épitope) pourraient aussi être conçus dans le vecteur de base pDHsp pour un essai de liaison in vitro protéine. Cette procédure de prolongation permettrait d’approfondir l’étude des interactions de protéine-protéine9. Par conséquent, l’anticorps polyclonal de V5 commerciale pourrait servir pour la détection des protéines. Le ratio de transfection dans différentes cellules d’insectes doit être testé avant l’expérience. Des taux plus faibles de transfection peuvent entraîner non détectables d’expression de la protéine ; ainsi, un vecteur de pDHsp contenant un gène de rapport approprié (c.-à-d., vert réagissent en gène) pourrait être transfectés dans afin d’évaluer l’efficacité de la transfection des cellules d’insecte.

La limitation majeure de cette plateforme d’expression de choc thermique est le niveau d’expression de protéine. Dans certains cas, un niveau d’expression de protéine faible a été trouvé. Selon une étude pilote, il n’y avait aucun effet significatif de dose-dépendante qui s’est produite lorsque plus d’ADN plasmide a été transfecté dans des cellules sf9 (données non présentées). Ainsi, cet effet peut être causé par la voie de protéasome ubiquitine (UPP) ou d’autres mécanismes inconnus11. Les chercheurs devraient examiner l’expression de la protéine en présence de l’inhibiteur du protéasome (c.-à-d., MG-132) pour clarifier et recolve cette question11. L’autre limitation est que la production durable de protéine associée au virus recombinants n’était pas possible. Ainsi, la stabilisation et la quantité d’expression de la protéine sont aussi des préoccupations au sujet de ce système. Par conséquent, une évolution de la production de protéines doit également être testée par Western blot avant le dosage fonctionnel. Dans ce protocole, nous avons comparé deux points dans le temps (1 et 5 h après un choc thermique) et observé l’accumulation de la production de protéine cible de 1 h à 5 h. Une augmentation des points dans le temps est proposée afin de déterminer les meilleures conditions de calendrier pour l’analyse fonctionnelle de la protéine.

Pour la protéine test fonctionnel, la protéine anti-apoptotique Ac-P35 (contrôle positif) et une protéine d’apoptosis-inducteur (D-RPR) ont également été exprimées à l’aide de ce système d’expression transitoire de choc thermique. Ces deux protéines sont décrits comme des antagonistes fonctionnels9,11,15. Par conséquent, le vecteur/D-RPR et Ac-P35/D-RPR pourraient servir un contrôle négatif et un témoin positif, respectivement. À l’aide de cette comparaison, l’activité anti-apoptotique de protéines cibles peut être déterminée.

Le protocole présenté susceptibles de fournir une plate-forme pour exprimer les protéines étrangères plus rapidement ou pourrait être davantage appliqué pour évaluer l’activité de la protéine anti-apoptotique dans des cellules d’insecte. Une fois que les chercheurs obtiennent des résultats préliminaires de la fonction de protéine, ce système pourrait être utilisé pour poursuivre ses études.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Jian-khoudja Leu d’Institut de Biologie Marine, National Taiwan Ocean University pour la fourniture de 3 constructions de plasmide. Cette recherche a été financée par Grant 106-2311-B-197-001 - du ministère de la Science et la technologie (MOST).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic, 100X Gibco 15240-062 for insect cell culture
Certified Foetal Bovine Serum Bioind 04-001-1A
Sf-900 II SFM Thermo Fisher 10902096 serum-free cell culture medium
Sf9 cells ATCC CRL-1711
25cm2 cell culture flask Nunc, Thermo Fisher 156340
Inverted light microscopy WHITED WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell Bioman RH618-J80 Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller) Bioman LBL407
Agar, Bacteriological Grade Bioman AGR001
Zeocin Invitrogen ant-zn-1 selection antibiotic
PCR Master Mix (2X) ThermoFisher K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Geneaid PIE25
Actinomycin D SIGMA A9415
Corning 50 mL centrifuge tubes SIGMA CLS430829-500EA 50 mL tubes
Hemocytometer Gizmo Supply Co B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 142475 24-well plate
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher 10362100 cell transfectin reagent
PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 Thermo Fisher AM9624
4×SDS Loading Dye Bioman P1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) Merck Milipore IPVH00010 PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell system BIO-RED 1703930 Blotting device
Ponceau S solution SIGMA 6226-79-5
Anti-V5 SIGMA V8137 rabbit anti-V5 antibody
Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) Jackson 111-035-003
Tween 20 Merck 817072
6-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 145380
0.4 % trypan blue solution AMRESCO K940-100ML
P10 pipetman Gilson F144802
P1000 pipetman Gilson F123602
Tape Symbio PPS7 24 well tape ( 19 mm×36 M)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
  2. Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).
  3. Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).
  4. Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).
  5. Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
  6. Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
  7. Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
  8. Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
  9. Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
  10. Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
  11. Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
  12. Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from: http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf (2017).
  13. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017).
  15. Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).

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Numéro 132 expression transitoire génétique analyse fonctionnelle de la protéine lignée Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus Ly-inhinbitor de l’apoptose-3 Drosophila chaleur choc 70 promoteur pDHsp/V5-His Drosophilia de cellules sf9 Reaper l’actinomycine-D
Expression transitoire de gènes étrangers dans des cellules d’insecte (sf9) pour l’analyse fonctionnelle de la protéine
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Chang, J. C., Lee, S. J., Kim, J. S., Wang, C. H., Nai, Y. S. Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay. J. Vis. Exp. (132), e56693, doi:10.3791/56693 (2018).

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