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Genetics

प्रोटीन कार्यात्मक परख के लिए कीट कोशिकाओं (sf9) में विदेशी जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति

Published: February 22, 2018 doi: 10.3791/56693
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University, 2Department of Agricultural Biology, College of Agriculture Life Sciences, Chonbuk National University, 3Department of Entomology, National Taiwan University

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक गर्मी सदमे-प्रेरित प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली (pDHsp/V5-His/sf9 सेल सिस्टम), जो या तो विदेशी प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या संभावित विदेशी प्रोटीन और उनके कटा हुआ अमीनो के विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि का मूल्यांकन कीट कोशिकाओं में एसिड होता है ।

Abstract

क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रणाली baculovirus में प्रोटीन कार्यात्मक विश्लेषण में प्रदर्शन के लिए सबसे महत्वपूर्ण प्रौद्योगिकियों में से एक है इन इन विट्रो सेल संस्कृति प्रणाली । इस प्रणाली को परिवर्तनीय अभिव्यक्ति plasmids में baculoviral प्रमोटर के नियंत्रण में विदेशी जीन व्यक्त करने के लिए विकसित किया गया था । इसके अलावा, इस प्रणाली या तो baculovirus ही या विदेशी प्रोटीन की एक कार्यात्मक परख के लिए लागू किया जा सकता है । सबसे व्यापक रूप से और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रणाली के आधार पर विकसित की है तत्काल जल्दी जीन (IE) के प्रमोटर के Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) । हालांकि, कीट कोशिकाओं में विदेशी जीन की एक कम अभिव्यक्ति स्तर मनाया गया । इसलिए प्रोटीन एक्सप्रेशन में सुधार के लिए एक क्षणिक जीन एक्सप्रेशन सिस्टम का निर्माण किया गया । इस प्रणाली में, रिकॉमबिनेंट plasmids को Drosophila हीट शॉक ७० (Dhsp70) प्रवर्तक के नियंत्रण में लक्ष्य अनुक्रम को शामिल करने के लिए निर्माण किया गया था । इस प्रोटोकॉल के आवेदन प्रस्तुत करता है इस गर्मी सदमे-आधारित pDHsp/V5-आमा (V5 epitope with 6 histidine)/धब् frugiperda सेल (sf9 cell) प्रणाली; यह प्रणाली न केवल जीन अभिव्यक्ति के लिए बल्कि कीट कोशिकाओं में उंमीदवार प्रोटीन के विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि के मूल्यांकन के लिए उपलब्ध है । इसके अलावा, इस प्रणाली या तो एक रिकॉमबिनेंट प्लाज्मिड या सह transfected दो संभावित कार्यात्मक विरोधी रिकॉमबिनेंट कीट कोशिकाओं में plasmids के साथ transfected जा सकता है । प्रोटोकॉल इस प्रणाली की क्षमता को दर्शाता है और इस तकनीक का एक व्यावहारिक मामला प्रदान करता है ।

Introduction

दो प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणालियों सामांयतः प्रोटीन के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया है: prokaryote प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली (ई कोलाई जीन अभिव्यक्ति प्रणाली) और यूकेरियोट प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली । एक लोकप्रिय यूकेरियोट प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली baculovirus अभिव्यक्ति वेक्टर सिस्टम (BEVS)1है । Baculoviruses पहले कृषि और वन कीट के दुनिया भर में जैविक नियंत्रण एजेंटों के रूप में इस्तेमाल किया गया । पिछले कुछ दशकों में, baculoviruses प्रोटीन के रूप में अच्छी तरह से अभिव्यक्ति वैक्टर के लिए प्रौद्योगिकी के रूप में विकसित उपकरण थे । baculoviruses के जीनोम से मिलकर दोहरे-फंसे परिपत्र डीएनए और nucleocapsids2को ढंक दिया. तिथि करने के लिए, से अधिक ७८ baculovirus अलग अनुक्रम किया गया है3। मेजबान कीट कोशिकाओं में baculoviral जीन अभिव्यक्ति का अस्थाई झरना के आधार पर, जीन प्रतिलेखन चार अस्थाई झरने में वर्गीकृत किया जा सकता है, तत्काल जल्दी, देरी, जल्दी, देर से, और बहुत देर जीन4सहित ।

BEVSs को इसलिए नामित किया गया था कि बहुत देर से जीन प्रवर्तकों (अर्थात, polyhedron या p10 प्रवर्तक) का लक्ष्य जीन का चालन किया जाता था, जबकि रिकॉमबिनेंट baculovirus द्वारा मुताबिक़ पुनर्संयोजन उत्पन्न किया जाता था. रिकॉमबिनेंट baculovirus द्वारा कीट कोशिकाओं में विदेशी प्रोटीन की अभिव्यक्ति के बाद अनुवादात्मक संशोधनों में स्तनधारी प्रोटीन की है कि (ग्लाइकोप्रोटीन उत्पादन के लिए अनुकूल) के समान है । इस प्रकार, baculovirus व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है5,6,7। हालांकि, एक सीमा कीट कोशिकाओं में अलग एन-glycosylation रास्ते की उपस्थिति है7।

इसलिए, एक नई baculovirus अभिव्यक्ति प्रणाली, क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रणाली, विकसित किया गया था । इस प्रणाली baculoviral तत्काल के अभियान के तहत विदेशी जीन एक्सप्रेस-जल्दी प्रमोटरों (ie-1 प्रमोटर) कीट कोशिकाओं में । इस प्रणाली का उपयोग करके, लक्ष्य प्रोटीन तुरंत ie-1 प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किया जा सकता है, जबकि कीट कोशिकाओं में एन glycosylation मार्ग को संशोधित करने, बेहतर n में जिसके परिणामस्वरूप-oligosaccharides7से जुड़े । इसके अलावा, baculoviral तत्काल जल्दी जीन मेजबान सेल आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय द्वारा लिखित और सक्रियकरण4के लिए किसी भी वायरल कारक की आवश्यकता नहीं है । इसलिए, विदेशी प्रोटीन एक कम समय के भीतर कीट कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है । तारीख करने के लिए, क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रणाली baculovirus में प्रोटीन कार्यात्मक परख में प्रदर्शन के लिए सबसे महत्वपूर्ण प्रौद्योगिकियों में से एक है इन विट्रो सेल संस्कृति प्रणाली । प्रणाली या तो baculovirus या विदेशी प्रोटीन के समारोह का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रणालियों में से एक तत्काल जल्दी जीन (IE) के प्रवर्तकों पर आधारित है Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus (OpMNPV) (OpIE2 और OpIE1 प्रवर्तकों) ।

हालांकि, कीट कोशिकाओं में विदेशी जीन के निचले अभिव्यक्ति स्तर अभी भी एक समस्या है जब OpIE प्रमोटर आधारित क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रणाली8,9,10इस्तेमाल किया गया था । इस प्रकार, एक और क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्रणाली का निर्माण Drosophila हीट शॉक प्रोटीन ७० (hsp70) जीन8,9के प्रवर्तक के आधार पर किया गया । hsp70 के प्रवर्तक baculoviral IE प्रमोटर से अधिक कुशलता से काम करता है जब कीट कोशिकाओं में गर्मी सदमे से प्रेरित10। इस प्रणाली में, लक्ष्य जीन Drosophila हीट शॉक ७० (Dhsp70) प्रमोटर की ड्राइव के तहत व्यक्त किए गए थे । विदेशी जीन आसानी से पीसीआर आधारित क्लोनिंग तरीकों से क्षणिक जीन अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में क्लोन किया जा सकता है । इसके अलावा, जीन अभिव्यक्ति के लिए समय का नियंत्रण गर्मी सदमे प्रेरण द्वारा किया जा सकता है ।

इस रिपोर्ट में, हम दृष्टिकोण का पालन करें और गर्मी सदमे आधारित क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके baculoviral जीन (apoptosis 3 के अवरोधक, iap3 से Lymantria xylina MNPV) के तीन अलग जनचेतना व्यक्त और इसके अलावा विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि विश्लेषण पर इन व्यक्त प्रोटीन लागू होते हैं । इस प्रणाली या तो विदेशी प्रोटीन जल्दी व्यक्त कर सकते है या आगे sf9 कोशिकाओं में प्रोटीन विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि के मूल्यांकन के लिए आवेदन किया है, जबकि भी क्षमता होने के लिए अंय प्रोटीन गतिविधि परख के लिए लागू किया जाएगा ।

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Protocol

1. तैयारी

  1. कीट कोशिका संस्कृति
    1. सेल कल्चर मीडियम के ५० एमएल तैयार करें । ऐसा करने के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं के ५०० µ एल जोड़ें (Amphotericin B = ०.२५ µ g/ml, पेनिसिलिन = १०० इकाई/एमएल, Streptomycin = १०० µ g/एमएल) और सीरम मुक्त सेल संस्कृति मध्यम (FBS या एंटीबायोटिक दवाओं के बिना) में गर्म निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम के 5 मिलीलीटर ।
      नोट: उपयोग करने से पहले एक पानी स्नान में 30 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण गोजातीय सीरम गर्मी ।
    2. धब् frugiperda (Lepidoptera: भुट्टे), sf9 कीट कोशिकाओं को बनाये रखें । अलग कै. ८०% कोशिकाओं से 25 सेमी2 सेल कल्चर कुप्पी मिलाकर कुप्पी और प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत जांच करें । फिर, एक नया 25 सेमी2 सेल संस्कृति कुप्पी के लिए सेल निलंबन के ५०% हस्तांतरण और कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए संलग्न करने की अनुमति । 5 मिलीलीटर ताजा सेल संस्कृति माध्यम के साथ मध्यम बदलें और 28 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में हो जाना । सेल के विकास के आधार पर हर 2 से 3 दिन के लिए यात्रा कोशिकाओं ।
  2. सेल अभिकर्मक के लिए plasmids की तैयारी
    1. लक्ष्य डीएनए टुकड़े डालें (जैसे, Lymantria xylina MNPV (LyxyMNPV) iap3 जीन और उसके विलोपन निर्माण) में pDHsp/V5-अपने द्वारा पीसीआर आधारित क्लोनिंग विधि11। कॉलोनियों में तब्दील कालोनियों के विकास की जांच पीसीआर पीसीआर मास्टर मिक्स (2x) और pDhsp-F2/सेशन-IE2R प्राइमर सेट का उपयोग कर । व्यावसायिक sequencing सेवा द्वारा प्लाज्मिड अनुक्रम की पुष्टि करें ।
      नोट: तालिका 1 पीसीआर और इसी निर्माण के लिए इस्तेमाल प्राइमरों की सूची ।
    2. संस्कृति एकल अनुक्रम बैक्टीरियल कालोनियों, जो aforementioned प्लाज्मिड निर्माण (चरण १.२) में २०० मिलीलीटर पौंड के माध्यम से चयनित एंटीबायोटिक दवाओं (५० µ g/एमएल), क्रमशः शामिल हैं ।
    3. निर्माता के निर्देश12के अनुसार मिडी प्लाज्मिड किट का उपयोग कर कल्चरल ई. कोलाई से plasmids निकालें.
  3. सेल संस्कृति माध्यम के १.५ मिलीलीटर और सीरम मुक्त सेल संस्कृति माध्यम के ८.५ मिलीलीटर मिश्रण से चढ़ाना मध्यम तैयार करें ।
  4. सेल कल्चर मीडियम (अंतिम एकाग्रता = १५० एनजी/एमएल) के 10 मिलीलीटर में ActD स्टॉक (1 मिलीग्राम/एमएल) के १.५ µ l को जोड़कर Actinomycin डी (ActD) सेल कल्चर मीडियम तैयार करें । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।

2. प्रोटीन क्षणिक अभिव्यक्ति

  1. सेल सीडिंग
    1. sf9 कोशिकाओं को मिलाकर संस्कृति कुप्पी, गिराने और गिर सेल निलंबन करने के लिए ५० मिलीलीटर ट्यूब, और हस्तांतरण 10 µ l एक P10 पिपेट द्वारा hemocytometer करने के लिए । एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सेल संख्या गिनती ।
    2. प्लेट 3 × 105 sf9 कोशिकाओं में प्रत्येक अच्छी तरह से 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक 24-अच्छी तरह से थाली में । मध्यम चढ़ाना के ०.५ मिलीलीटर के साथ माध्यम बदलें ।
  2. अभिकर्मक ऑफ plasmids
    1. सेल अभिकर्मक रिएजेंट पतला: 1 एस के लिए भंवर द्वारा १०० µ एल सीरम मुक्त सेल संस्कृति मध्यम और मिश्रण में सेल अभिकर्मक रिएजेंट के 8 µ एल पतला ।
    2. प्लाज्मिड डीएनए के 2 µ g को जोड़ें (pDHsp70-Ac-P35/V5-आमा या pDHsp70-IAP3/V5-आमा या pDHsp70--IAP3-बीर/V5-आमा वा pDHsp70-IAP3-अंगूठी/V5-अपने) में १०० µ एल सीरम मुक्त सेल संस्कृति मध्यम और 1 के लिए भंवर द्वारा मिश्रण (चित्रा 2) ।
    3. पतला प्लाज्मिड डीएनए और पतला सेल अभिकर्मक एजेंट (२१० µ एल) का मिश्रण है, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1 एस के लिए भंवर द्वारा मिक्स ।
    4. एक P1000 पिपेट द्वारा कोशिकाओं पर डीएनए अभिकर्मक रिएजेंट मिश्रण dropwise के २१० µ एल जोड़ें । 5 एच के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    5. एक P1000 पिपेट का उपयोग कर सेल संस्कृति माध्यम के ०.५ मिलीलीटर के साथ चढ़ाना मध्यम बदलें । टेप के साथ 24-खैर प्लेट सील और 16 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को मशीन ।
  3. गर्मी सदमे transfected कोशिकाओं: एक ४२ ° c पानी स्नान (पानी की सतह पर तैर) में थाली रखो । 30 मिनट के लिए हीट और 28 डिग्री सेल्सियस मशीन के लिए 24 अच्छी तरह से थाली वापस ।
  4. प्रोटीन की अभिव्यक्ति का पता लगाने
    1. 1 ज या 5 एच गर्मी सदमे के बाद, ०.५ 1x पंजाबियों बफर के संक्षेप में तीन बार एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
      नोट: 10x पंजाबियों बफर के लिए 1 मिलीलीटर को जोड़ने के द्वारा 1x पंजाबस बफर को पतला 10x पंजाबियों बफर के 9 मिलीलीटर निष्फल ddH2O
    2. लाइसे ४० µ एल के साथ कोशिकाओं 1x एसडीएस लोड हो रहा है डाई ऊपर और नीचे pipetting से ।
      नोट: 1x पंजाबियों बफर और 4x एसडीएस नमूना बफर के 10 µ एल के 30 µ एल मिश्रण से 4x एसडीएस लोडिंग डाई पतला ।
    3. ९८ डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी ब्लॉक में 10 मिनट के लिए प्रोटीन के नमूनों गर्मी, 1 मिनट के लिए नीचे स्पिन, और पश्चिमी दाग परख के लिए बर्फ पर डाल दिया ।
    4. पश्चिमी ब्लाट परख
      Eslami और इन् क्लूजन13 से पश्चिमी दाग परख की प्रक्रिया का पालन करें । भागो एसडीएस-पृष्ठ जैल14: एक जेल Coomassie ब्लू धुंधला (जांच के लिए कि प्रोटीन के नमूनों की मात्रा में एक अच्छी तरह से लोड मात्रा में बराबर है) और अंय पश्चिमी दाग परख करने के लिए अधीन, Eslami और इन् क् लूजन के अनुसार के लिए लोडनियंत्रण 13 .
    5. पता लगाएँ V5-खरगोश विरोधी V5 एंटीबॉडी के साथ फ्यूजन प्रोटीन (5 मिलीग्राम/एमएल) (1:5000 कमजोर पड़ने TBST बफर में एकाग्रता काम करने के लिए 1 µ जी/एमएल) और बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी-सहिजन peroxidase (एचआरपी) संयुग्मी (०.८ मिलीग्राम/एमएल) (1:10000 कमजोर पड़ने TBST बफर में काम करने के लिए एकाग्रता ०.०८ µ g/mL).
      नोट: polyacrylamide का प्रतिशत समायोजित करने के लिए १७.५% जब प्रोटीन आणविक वजन करने के लिए < 17 केडीए ।

3. विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि परख

  1. जीन प्रेरित सेल apoptosis: २.१ से २.३ के लिए aforementioned प्रक्रिया दोहराएं । Co-transfect 1 µ g of pDHsp/D-rpr/झंडा-अपने प्लाज्मिड डीएनए (युक्त apoptosis उत्प्रेरण जीन) के साथ 1 µ जी के प्लाज्मिड डीएनए [pDHsp70/V5-अपने वेक्टर (नकारात्मक नियंत्रण), pDHsp70-Ac-P35/V5-आमा (सकारात्मक नियन्त्रण), pDHsp70--IAP3/V5-आमा, pDHsp70---IAP3-बीर/V5-आमा या pDHsp70-IAP3-छल्ला/V5-आमा, क्रमशः.]. पर 5 एच के बाद गर्मी सदमे उपचार, सेल व्यवहार्यता परख आचरण (चित्रा 2) ।
  2. रासायनिक प्रेरित सेल apoptosis: aforementioned प्रक्रिया २.१ से २.३ करने के लिए दोहराएँ । चरण 2.1.2 में, प्लेट 1 x 106 sf9 कोशिकाओं में एक अच्छी तरह से एक 6-अच्छी तरह से थाली में । Transfect 4 µ g का प्लाज्मिड डीएनए [pDHsp70/V5-उसका सदिश (ऋणात्मक नियंत्रण), pDHsp70-Ac-P35/V5-आमा (सकारात्मक नियंत्रण), pDHsp70--IAP3/V5-आमा, pDHsp70--IAP3-बीर/V5-आमा वा pDHsp70--IAP3-वलय-V5-आमा, क्रमशः.]. 5 घंटे के बाद गर्मी सदमे में, 16 घंटे के लिए ActD सेल संस्कृति माध्यम के 2mL के साथ sf9 कोशिकाओं का इलाज और सेल व्यवहार्यता परख (चित्रा 2) आचरण ।
    नोट: एक अच्छी तरह से 6 अच्छी प्लेट की एक कवर करने के लिए ंयूनतम मात्रा 1 मिलीलीटर है ।
  3. triplicates में ३.१ और ३.२ सहित उपरोक्त विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि परख प्रयोगों, प्रदर्शन ।

4. सेल व्यवहार्यता परख

  1. 1 मिनट 3 बार के लिए 1x पंजाबियों बफर के 1 मिलीलीटर जोड़कर इलाज कोशिकाओं को धो लें । pipetting 1 मिलीलीटर 1x पंजाबियों बफर ०.०४% trypan नीले और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए दाग युक्त द्वारा कोशिकाओं reसस्पेंड । सेल सस्पेंशन को १.५ एमएल microtube में ट्रांसफर कर दीजिये ।
    नोट: 1x पंजाबियों बफर और 1 मिलीलीटर ०.४% trypan ब्लू समाधान के 9 मिलीलीटर मिश्रण से ०.४% trypan ब्लू समाधान पतला ।
  2. एक P10 पिपेट के साथ hemocytometer के लिए 10 µ एल trypan नीले दाग सेल निलंबन हस्तांतरण और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत व्यवहार्य बरकरार कोशिकाओं गिनती ।
  3. सांख्यिकीय विश्लेषण
    1. दर्ज आंकड़ों की गणना और सभी गिनती के लिए मतलब ± S.D. के रूप में उपस्थित ।
    2. Microsoft Excel के साथ छात्र के दो-पुच्छीय t-परीक्षण का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें. P-मान < 0.05 के रूप में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण डेटा निर्धारित करें ।

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Representative Results

LyxyMNPV से IAP3 की पूर्ण लम्बाई एवं अन्य दो जनचेतना (बीर एवं वलय डोमेन) sf9 कोशिकाओं में दब गए थे, ताप आघात आधारित pDHsp/V5-His/धब् frugiperda सेल (sf9 cell) प्रणाली के आधार पर । pDHsp/V5-उसकी एक Drosophila गर्मी सदमे प्रोटीन प्रमोटर, जो सेलुलर transcriptional कारकों और अनुवाद प्रणाली का उपयोग करके ४२ ° c हालत के तापमान पर बहाव जीन अभिव्यक्ति ड्राइव निहित (चित्रा 1)8 ,9,11. संपूर्ण तकनीकी फ़्लोचार्ट चित्रा 2में दिखाया गया है । 1 ज या 5 एच गर्मी सदमे के बाद, कोशिकाओं प्रोटीन नमूना बफर के साथ लीजड ड और पश्चिमी दाग परख के अधीन करने के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति की पुष्टि कर रहे थे । परिणामों से संकेत दिया कि पूर्ण लंबाई प्रोटीन, एसी-P35, IAP3, IAP3-बीर, और IAP3-अंगूठी, transfected कोशिकाओं में या तो 1 एच या 5 एच पोस्ट गर्मी सदमे में पता लगाया जा सकता है । इसके अलावा, प्रोटीन संचय 5 एच बाद गर्मी सदमे (चित्रा 3) में पाया गया । इस प्रकार, डेटा के अनुसार, प्रोटीन कार्यात्मक परख अधिकतम प्रोटीन अभिव्यक्ति समय बिंदु पर प्रदर्शन किया था (5 एच के बाद गर्मी सदमे) ।

दोनों जीन प्रेरित सेल apoptosis और रासायनिक प्रेरित सेल apoptosis विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि (चित्रा 2) के मूल्यांकन के लिए इस प्रणाली के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । जीन प्रेरित सेल apoptosis के लिए, दो constructs (apoptosis उत्प्रेरण और लक्ष्य जीन प्लाज्मिड constructs) थे सह sf9 कोशिकाओं में transfected और फिर गर्मी activite जीन अभिव्यक्ति को चौंका दिया । इसके अलावा, विरोधी अपोप्तोटिक प्रोटीन एसी P35 (सकारात्मक नियंत्रण) और एक apoptosis-उत्प्रेरण प्रोटीन (डी RPR) भी इस गर्मी सदमे क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग कर व्यक्त किया गया ।

हीट शॉक के बाद दोनों जीन व्यक्त होने लगे और प्रोटीन का अनुवाद किया । सदिश/डी-RPR की तुलना में, सकारात्मक नियंत्रण (Ac-P35/d-RPR) ने उच्च विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि दिखाई, जो व्यवहार्यता दर के ८०% तक पहुंच गई । अंय निर्माणों की कोशिका व्यवहार्यता परिणामों से, शोधकर्ताओं ने विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि एक दूसरे या सकारात्मक नियंत्रण (चित्र 4a) की तुलना कर सकते हैं । रासायनिक प्रेरित सेल apoptosis के लिए, केवल एक निर्माण sf9 कोशिकाओं में transfected था । 5 एच बाद गर्मी सदमे के बाद, रसायन (ActD) जोड़ा गया है, और सेल व्यवहार्यता 16 घंटे (चित्रा 2) के बाद मापा गया था । सकारात्मक नियंत्रण (एसी P35) या नकारात्मक नियंत्रण (वेक्टर) के उन लोगों के साथ तुलना में, प्रत्येक निर्माण विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि पर विभिंन प्रभाव (चित्रा 4B) दिखाया ।

Figure 1
चित्र 1: आरेख और न्यूक्लियोटाइड के अनुक्रम- iap3 सापेक्ष प्लाज्मिड constructs pDHsp/V5-अपने वेक्टर पर आधारित है । स्टार्ट codon (ATG) को बोल्ड में दिखाया गया है । रेखांकित प्रतिबंध एंजाइम काटने साइटें (हिंदIII लाल रंग में इंगित करता है; नीले रंग में BamHI ); हरे रंग में अनुक्रम Dhsp70 प्रवर्तक क्षेत्र को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: हीट शॉक प्रेरित प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली के प्रवाह चार्ट (pDHsp/V5-His/sf9 सेल सिस्टम) । जीन प्रेरित कोशिका apoptosis और रासायनिक प्रेरित कोशिका apoptosis उपचार प्रारंभिक चरण के लिए संकेत दिया गया (सह apoptosis उत्प्रेरण जीन प्लाज्मिड के साथ अभिकर्मक) या बाद में कदम गर्मी सदमे के बाद (रासायनिक प्रेरित apoptosis), क्रमशः के लिए विरोधी apoptosis परख । संशोधित आंकड़ा और लीजेंड स्प्रिंगर की अनुमति के साथ reproduced11। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एसी-P35, IAP3, IAP3-बीर और IAP3-अंगूठी गर्मी सदमे प्रेरित प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली (pDHsp/V5-His/sf9 सेल प्रणाली) का उपयोग कर का इजहार । 1 ज या 5 एच पोस्ट हीट शॉक, सेल lysates में काटा गया और पश्चिमी दाग परख और एसडीएस के अधीन/ (क) α के साथ पश्चिमी दाग परख-V5 एंटीबॉडी और (ख) एसडीएस/लोड हो रहा है नियंत्रण के रूप में Coomassie ब्लू के साथ सना हुआ पृष्ठ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: डी-rpr या Actinomycin डी प्रेरित apoptosis के लिए व्यवहार्यता परख । (क) sf9 कोशिकाओं के साथ transfected थे pDHsp70/V5-अपने वेक्टर (केवल वेक्टर) और सह transfected pDHsp70/drpr/झंडा-उनके साथ pDHsp70/V5-अपने वेक्टर, pDHsp70/Ac-P35/V5-आमा, pDHsp70/-IAP3/V5-आमा, pDHsp70/।-IAP3-बीर/V5-आमा, pDHsp70/ IAP3-रिंग/V5-उनकी, क्रमशः । वेक्टर और P35 और सदिश और IAP3 के बीच अंतर-सांख्यिकीय महत्वपूर्ण (t-परीक्षण; P < 0.05) । (ख) sf9 कोशिकाओं के साथ transfected थे या तो pDHsp70/V5-उसका वेक्टर या pDHsp70/एसी-P35/V5-आमा, pDHsp70/-IAP3/V5-आमा, pDHsp70/-IAP3-बीर/V5-आमा, pDHsp70/प-IAP3-वलय/V5-उसक, क्रमशः 5 ज पर गर्मी के झटके के बाद, ActD गयी और 16 ज बाद म, कक्ष व्यवहार्यता मापा गया था । सदिश और P35 के बीच अंतर सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण है (t-परीक्षण; P < 0.05) । संशोधित आंकड़ा और लीजेंड स्प्रिंगर की अनुमति के साथ reproduced11। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नाम जुगाड़
pDHsp-IAP3-HindIII-च 5 ´-जीजीAAGCTTACCATGGACGACGAACGACGCAG-3 ´
pDHsp-IAP3-BamHI-R 5 ´-जीसीGGATCCCGGATGTAGGAACACCTTGA-3 ´
iap3-बीर-BamHI-r 5 ´-सीजीGGATCCCGGCAGATCGCCGCCGCGGA-3 ´
iap3-वलय-HindIII-च 5 ´-जीजीAAGCTTACCGAGCTCATAAAAAGGCCCGT-3 ´
pDhsp70-F2 5 ´-CTGCAACTACTGAAATCAACCAAG-3 ´
Op-IE2R 5 ´-GACAATACAAACTAAGATTTAGTCAG-3 ´

तालिका 1: प्राइमरी सेट पीसीआर आधारित क्लोनिंग विधि के लिए इस्तेमाल किया. * रेखांकित डीएनए आधार जोड़े प्रतिबंध एंजाइम साइटों संकेत दिया । संशोधित प्राइमर सूची स्प्रिंगर11की अनुमति के साथ reproduced ।

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Discussion

हीट शॉक-आधारित pDHsp/V5-His/sf9 सेल सिस्टम की अवधारणा पहले भूखों एट अल द्वारा १९९४8में वर्णित किया गया था । baculoviral जीन प्रमोटर (IE1) और Drosophila hsp70 की तुलना से पता चला है कि hsp70 मच्छर कोशिकाओं10में एक उच्च दक्षता था । इसके अलावा, गर्मी सदमे प्रेरण के कारण, प्रोटीन अभिव्यक्ति के समय ठीक गर्मी सदमे उपचार के बाद नियंत्रित किया जा सकता है । इस प्रणाली तो चिंराट और nucleopolyhedrovirus (NPV) आईएपी प्रोटीन9,11के प्रोटीन कार्यात्मक परख के लिए लागू किया गया था । इस प्रोटोकॉल में कुल 6 प्लाज्मिड निर्माणों का उपयोग किया गया: तीन (pDHsp/V5-आमा, pDHsp/Ac-p35/V5-आमा, and pDHsp/D-rpr/झंडा-आमा) द्वारा प्रदान किए गए जीआईपी-Horng लियू9, और अन्य तीन कंस्ट्रक्शन (pDHsp-iap3/V5-आमा, pDHsp-iap3-बीर/V5-आमा, और pDHsp-iap3-अंगूठी/V5-His) नई एट अल., २०१६11द्वारा निर्माण किया गया । ऐसा लगता है कि कीट कोशिकाओं में यह प्रवर्तक baculoviral जीन प्रवर्तकों की तुलना में अधिक कुशलता से काम करता है. हालांकि, इस प्रोटोकॉल के हेरफेर के दौरान, वहां कई बताते है कि जरूरत पर विचार कर रहे हैं । प्लाज्मिड अभिकर्मक से पहले, डीएनए अनुक्रम के सम्मिलन की जाँच जीन अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण है; इस प्रकार, यह V5 epitope के साथ जुड़े होने के लिए एक V5 के रूप में लक्ष्य अनुक्रम के अंत में फ्यूजन प्रोटीन टैग करना चाहिए । इसके अलावा, अलग फ्यूजन टैग (यानी, झंडा epitope) भी pDHsp में डिजाइन किया जा सकता है आधारित सदिश के लिए एक इन विट्रो प्रोटीन बाध्यकारी परख । इस विस्तार प्रक्रिया आगे प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की जांच में मदद मिलेगी9। इसलिए, वाणिज्यिक V5 polyclonal एंटीबॉडी प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रयोग से पहले विभिन्न कीट कोशिकाओं में अभिकर्मक अनुपात का परीक्षण किया जाना चाहिए । कम अभिकर्मक दरों प्रोटीन अभिव्यक्ति का गैर-detectable में परिणाम हो सकता है; इस प्रकार, एक pDHsp वेक्टर युक्त एक उपयुक्त रिपोर्ट जीन (यानी, ग्रीन fluoresce जीन) अभिकर्मक दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए कीट कोशिकाओं में transfected जा सकता है ।

इस गर्मी सदमे अभिव्यक्ति मंच की प्रमुख सीमा प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर है । कुछ मामलों में, कम प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर पाया गया । एक प्रायोगिक अध्ययन के अनुसार, वहां कोई महत्वपूर्ण खुराक-निर्भर प्रभाव है कि जब अधिक प्लाज्मिड डीएनए sf9 कोशिकाओं में transfected था (डेटा नहीं दिखाया गया था) हुआ । इस प्रकार, इस आशय ubiquitin proteasome मार्ग (UPP) या अंय अज्ञात तंत्र11के कारण हो सकता है । शोधकर्ताओं ने इस अंक11को स्पष्ट और recolve करने के लिए proteasome अवरोधक (यानी, एमजी-१३२) की उपस्थिति में प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच करनी चाहिए । दूसरी सीमा यह है कि रिकॉमबिनेंट वायरस से जुड़े प्रोटीन का टिकाऊ उत्पादन हासिल नहीं किया जा सका है. इस प्रकार, प्रोटीन अभिव्यक्ति की स्थिरीकरण और राशि भी इस प्रणाली के बारे में चिंता कर रहे हैं । इसलिए, प्रोटीन उत्पादन का एक समय पाठ्यक्रम भी कार्यात्मक परख से पहले पश्चिमी दाग परख द्वारा परीक्षण किया जाना चाहिए । इस प्रोटोकॉल में, हम दो समय अंक की तुलना में (1 और 5 गर्मी सदमे के बाद एच) और लक्ष्य प्रोटीन के उत्पादन के संचय मनाया 1 से ज 5 ज । समय अंक में वृद्धि के लिए प्रोटीन कार्यात्मक परख के लिए सबसे अच्छा समय की स्थिति निर्धारित करने का सुझाव दिया है ।

प्रोटीन कार्यात्मक परख के लिए, विरोधी अपोप्तोटिक प्रोटीन एसी P35 (सकारात्मक नियंत्रण) और एक apoptosis-उत्प्रेरण प्रोटीन (डी RPR) भी इस गर्मी सदमे क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग कर व्यक्त किया गया । इन दो प्रोटीन कार्यात्मक विरोधी के रूप में वर्णित हैं9,11,15. इसलिए, वेक्टर/d-RPR और Ac-P35/d-RPR एक नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकता है, क्रमशः । इस तुलना का प्रयोग, लक्ष्य प्रोटीन के विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि निर्धारित किया जा सकता है ।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल विदेशी प्रोटीन अधिक जल्दी व्यक्त करने के लिए एक मंच प्रदान कर सकता है या आगे कीट कोशिकाओं में प्रोटीन विरोधी अपोप्तोटिक गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है । एक बार शोधकर्ताओं प्रोटीन समारोह के प्रारंभिक परिणाम प्राप्त करने के लिए, इस प्रणाली को आगे के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम 3 प्लाज्मिड निर्माण प्रदान करने के लिए संस्थान समुद्री जीव विज्ञान, राष्ट्रीय ताइवान महासागर विश्वविद्यालय के Dr. जीआईपी-Horng लियू धंयवाद । इस अनुसंधान अनुदान 106-2311-B-१९७-001 द्वारा समर्थित किया गया था-विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (सबसे) से ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic, 100X Gibco 15240-062 for insect cell culture
Certified Foetal Bovine Serum Bioind 04-001-1A
Sf-900 II SFM Thermo Fisher 10902096 serum-free cell culture medium
Sf9 cells ATCC CRL-1711
25cm2 cell culture flask Nunc, Thermo Fisher 156340
Inverted light microscopy WHITED WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell Bioman RH618-J80 Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller) Bioman LBL407
Agar, Bacteriological Grade Bioman AGR001
Zeocin Invitrogen ant-zn-1 selection antibiotic
PCR Master Mix (2X) ThermoFisher K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Geneaid PIE25
Actinomycin D SIGMA A9415
Corning 50 mL centrifuge tubes SIGMA CLS430829-500EA 50 mL tubes
Hemocytometer Gizmo Supply Co B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 142475 24-well plate
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher 10362100 cell transfectin reagent
PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 Thermo Fisher AM9624
4×SDS Loading Dye Bioman P1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) Merck Milipore IPVH00010 PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell system BIO-RED 1703930 Blotting device
Ponceau S solution SIGMA 6226-79-5
Anti-V5 SIGMA V8137 rabbit anti-V5 antibody
Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) Jackson 111-035-003
Tween 20 Merck 817072
6-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 145380
0.4 % trypan blue solution AMRESCO K940-100ML
P10 pipetman Gilson F144802
P1000 pipetman Gilson F123602
Tape Symbio PPS7 24 well tape ( 19 mm×36 M)

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References

  1. Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
  2. Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Springer Press. New York. 1129-1185 (2005).
  3. Nai, Y. S., Huang, Y. F., Chen, T. H., Chiu, K. P., Wang, C. H. Determination of nucleopolyhedrovirus' taxonomic position. Biological Control of Pest and Vector Insects. Shields, V. D. C. , InTech Press. Rijeka. 169-200 (2017).
  4. Friesen, P. D. Regulation of baculovirus early gene expression. The Baculoviruses. Miller, L. K. , Plenum Press. New York. 141-170 (1997).
  5. Smith, G. E., Summers, M., Fraser, M. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3 (12), 2156-2165 (1983).
  6. Luckow, V. A., Summers, M. D. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 6 (1), 47-55 (1988).
  7. Jarvis, D. L., Finn, E. E. Modifying the insect cell N-glycosylation pathway with immediate early baculovirus expression vectors. Nature Biotechnol. 14 (1996), 1288-1292 (1996).
  8. Clem, R. J., Miller, L. K. Control of programmed cell death by the baculovirus genes p35 and iap. Mol. Cell. Biol. 14, 5212-5222 (1994).
  9. Leu, J. H., Kuo, Y. C., Kou, G. H., Lo, C. F. Molecular cloning and characterization of an inhibitor of apoptosis protein (IAP) from the tiger shrimp, Penaeus monodon. Dev. Comp. Immunol. 32, 121-133 (2008).
  10. Zhao, Y. G., Eggleston, P. E. Comparative analysis of promoters for transient gene expression in cultured mosquito cells. Insect Mol. Biol. 8 (1), 31-38 (1999).
  11. Nai, Y. S., Yang, Y. T., Kim, J. S., Wu, C. Y., Chen, Y. W., Wang, C. H. Baculoviral IAP2 and IAP3 encoded by Lymantria xylina multiple nucleopolyhedrovirus (LyxyMNPV) suppress insect cell apoptosis in a transient expression assay. Appl. Entomol. Zool. 51, 305-316 (2016).
  12. Geneaid™. Geneaid™ Midi Plasmid Kit & Geneaid™ Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Instruction Manual Ver. 05.11.17. , Available from: http://www.geneaid.com/sites/default/files/PI13_0.pdf (2017).
  13. Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359 (2010).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , Cambridge, MA. Available from: https://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2017).
  15. Vucic, D., Kaiser, W. J., Harvey, A. J., Miller, L. K. Inhibition of reaper-induced apoptosis by interaction with inhibitor of apoptosis proteins (IAPs). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 10183-10188 (1997).

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आनुवंशिकी अंक १३२ क्षणिक अभिव्यक्ति प्रोटीन कार्यात्मक परख sf9 सेल लाइन Lymantria xylina एकाधिक nucleopolyhedrovirus inhinbitor के Apoptosis-3 Drosophila हीट शॉक ७० प्रमोटर pDHsp/V5-आमा Drosophilia काटना actinomycin-डी
प्रोटीन कार्यात्मक परख के लिए कीट कोशिकाओं (sf9) में विदेशी जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति
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Chang, J. C., Lee, S. J., Kim, J.… More

Chang, J. C., Lee, S. J., Kim, J. S., Wang, C. H., Nai, Y. S. Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay. J. Vis. Exp. (132), e56693, doi:10.3791/56693 (2018).

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