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Genetics

Expressão transiente de estrangeiros Genes em células de inseto (sf9) para o ensaio funcional da proteína

Published: February 22, 2018 doi: 10.3791/56693
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University, 2Department of Agricultural Biology, College of Agriculture Life Sciences, Chonbuk National University, 3Department of Entomology, National Taiwan University

Summary

Este protocolo descreve um calor induzida por choque proteína expressão (sistema pDHsp/V5-His/sf9 célula), que pode ser usado para expressar proteínas estranhas ou avaliando a atividade anti-apoptotic de potenciais proteínas estranhas e seus truncado amino ácidos em células de inseto.

Abstract

O sistema de expressão de gene transiente é uma das tecnologias mais importantes para a realização de análise funcional da proteína do baculovirus em vitro sistema de cultura celular. Este sistema foi desenvolvido para os genes expressam estrangeiros sob o controle do promotor baculoviral em plasmídeo de expressão transiente. Além disso, este sistema pode ser aplicado a um ensaio funcional de baculovirus em si ou proteínas estranhas. O sistema de expressão de gene transiente mais amplamente e comercialmente disponível é desenvolvido com base no promotor do gene imediata-início (IE) da Orgyia pseudotsugata multicapsid Membros (OpMNPV). No entanto, observou-se um nível de baixa expressão de genes estrangeiros em células de inseto. Portanto, um sistema de expressão de gene transiente foi construído para melhorar a expressão da proteína. Neste sistema, o plasmídeo recombinante foram construído para conter a sequência alvo sob o controle do promotor Drosophila calor choque 70 (Dhsp70). Este protocolo apresenta a aplicação deste calor baseada em choque pDHsp/V5-His (epítopo V5 com 6 histidina) /Spodoptera frugiperda celular sistema (sf9 celular); Este sistema está disponível não só para a expressão de gene, mas também para avaliar a atividade anti-apoptotic de proteínas de candidato em células de inseto. Além disso, este sistema pode também ser transfected com um plasmídeo recombinante ou transfectadas co dois funcionalmente potencialmente antagônico plasmídeo recombinante em células de inseto. O protocolo demonstra a eficiência deste sistema e fornece um caso prático desta técnica.

Introduction

Dois sistemas de expressão da proteína tem sido comumente usados para a produção de proteínas: sistemas de expressão da proteína de procarionte (sistema de expressão de gene deEscherichia coli ) e sistemas de expressão da proteína eucariota. Um sistema de expressão de proteínas eucariota popular é a expressão de baculovirus vetor sistema (BEVS)1. Baculoviruses primeiro foram usados como agentes em todo o mundo controle biológico de produtos agrícolas e florestais pragas. Nas últimas décadas, baculoviruses foram desenvolvidas como ferramentas biotecnológicas para vetores da expressão da proteína também. Os genomas de baculoviruses consistem de DNA circular de dupla-hélice e envoltos envelopada2. Até à data, mais de setenta e oito baculovirus isolados foram sequenciados3. Baseado em cascata temporal de expressões de gene baculoviral em células de inseto hospedeiro, a transcrição do gene pode ser classificada em quatro cascatas temporais, incluindo imediata-início, início atrasado, atrasado e muito tarde genes4.

BEVSs, foram designados para que os promotores de genes muito tarde (ou seja, Poliedro ou p10 promotor) foram usados para conduzir os genes-alvo, enquanto o baculovirus recombinante foi gerado pelo recombination homologous. Expressão de proteínas extrangeiras em células de inseto pelo baculovirus recombinante é similar de proteínas de mamíferos em modificações borne-translational (adequadas para a produção de glicoproteína). Assim, o baculovirus tem sido amplamente utilizado5,6,7. No entanto, uma limitação é a presença de diferentes percursos de N-glicosilação em células de inseto7.

Portanto, um novo sistema de expressão de baculovirus, o sistema de expressão de gene transiente, foi desenvolvido. Este sistema expressa genes estrangeiros sob a unidade de baculoviral imediata-primeiros promotores (promotorou seja,-1 ) em células de inseto. Usando este sistema, a proteína do alvo pode ser imediatamente expressa sob o controle do promotor ou seja-1 ao modificar o caminho de N-glicosilação em células de inseto, resultando em melhor oligossacarídeos N-ligados7. Além disso, baculoviral imediata-primeiros genes são trascritos pela RNA polimerase II a pilha de anfitrião e não requerem qualquer fator viral para ativação4. Portanto, proteínas estranhas podem ser expressa em células de inseto dentro de um curto período de tempo. Até à data, o transitório, sistema de expressão de gene é uma das tecnologias mais importantes para a realização de ensaios funcionais da proteína do baculovirus em vitro sistema de cultura celular. O sistema pode ser aplicado para analisar a função de baculovirus ou proteínas estranhas. Um dos sistemas de expressão de gene transiente comercialmente disponível é baseado nos promotores de gene início imediato (IE) de medicamentos multicapsid de Orgyia pseudotsugata (OpMNPV) (promotores de OpIE2 e OpIE1).

No entanto, o menor nível de expressão de genes estrangeiros em células de inseto ainda era um problema quando o sistema de expressão de gene transiente baseado no promotor OpIE foi usado8,9,10. Assim, um outro sistema de expressão de gene transiente foi construído com base no promotor da drosófila calor choque proteína 70 (hsp70) gene8,9. O promotor da hsp70 funciona mais eficientemente do que o promotor baculoviral IE quando induzida por choque térmico em células de inseto10. Neste sistema, os genes-alvo foram expressos sob a unidade de Drosophila 70 (Dhsp70) promotor de calor choque. Genes estrangeiros podem ser facilmente clonados em plasmídeo de expressão do gene transitória por métodos de clonagem baseados em PCR. Além disso, o controle de sincronismo para a expressão do gene pode ser executado por indução de choque do calor.

Neste relatório, vamos seguir a abordagem e expressar três truncamentos diferentes do gene baculoviral (inibidor da apoptose 3, iap3 de mariposa Ksýlina MNPV) usando o sistema de expressão de proteína transiente baseada em choque de calor e aplicam-se ainda mais estas proteínas expressas na análise da atividade anti-apoptotic. Este sistema também pode expressar proteínas estranhas rapidamente ou ainda ser aplicado para a avaliação da atividade anti-apoptotic de proteína nas células sf9, tendo também o potencial para ser aplicado a outros ensaios de atividade da proteína.

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Protocol

1. preparações

  1. Cultura de células de inseto
    1. Prepare-se 50 mL de meio de cultura celular. Para fazer isso, adicione 500 µ l de antibióticos (Anfotericina B = 0,25 µ g/mL, penicilina = 100 unidades/mL, estreptomicina = 100 µ g/mL) e 5 mL de soro de bovino fetal inactivadas pelo calor em meio de cultura celular isento de soro (sem FBS ou antibióticos).
      Nota: Aquece o soro bovino fetal a 65 ° C por 30 min em um banho de água antes da utilização.
    2. Manter a Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Arctiidae), células de inseto sf9. Desanexar ca. 80% das células do frasco de cultura 25cm2 célula agitando o balão e verificar sob microscopia de luz. Em seguida, transferir 50% de suspensão de célula para um frasco de cultura celular de2 novos 25 cm e permitir que as células anexar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Substituir o meio com 5 mL meio de cultura de células frescas e crescer em uma incubadora a 28 ° C. Células de passagem cada 2 a 3 dias dependendo do crescimento da célula.
  2. Elaboração de plasmídeos de transfecção celular
    1. Inserir os fragmentos de DNA alvo (por exemplo, a mariposa Ksýlina MNPV (LyxyMNPV) iap3 gene e suas construções de exclusão) em pDHsp/V5-His baseados em PCR clonagem método11. Verifique o crescimento de colônias transformados pela colônia PCR usando PCR Master Mix (2 X) e o primer pDhsp-F2/Op-IE2R definido. Confirme as sequências de plasmídeo pelo serviço comercial de sequenciamento.
      Nota: A tabela 1 lista os primers utilizados para PCR e as construções de correspondentes.
    2. Os colônias bacterianas sequenciados único de cultura, que contêm as construções acima do plasmídeo (etapa 1.2) em 200 mL LB médio contendo selecionado antibióticos (50 µ g/mL), respectivamente.
    3. Extrai os plasmídeos do culto Escherichia coli usando o Kit de plasmídeo de Midi de acordo com instruções12 a fabricante.
  3. Prepare o chapeamento médio misturando 1,5 mL de meio de cultura celular e 8,5 mL de meio de cultura celular livre de soro.
  4. Preparar o meio de cultura celular de actinomicina D (ActD) adicionando 1,5 µ l de estoque ActD (1 mg/mL) em 10 mL de meio de cultura celular (concentração final = 150 ng/mL). Loja a 4 ° C.

2. expressão transitória da proteína

  1. Célula de semeadura
    1. Colher as células sf9 agitando o frasco de cultura, derrubar e cair a suspensão de eritrócitos ao tubo de 50 mL e pipeta, transferir 10 µ l de hemocytometer uma P10. Conte o número de células em um microscópio de luz.
    2. Placa de 3 × 105 sf9 células em cada poço em uma placa de 24 para 15 min à temperatura ambiente. Substitua o médio 0,5 mL do chapeamento médio.
  2. Transfection de plasmídeos
    1. Reagente de Transfeccao de célula diluído: diluir 8 µ l de reagente de Transfeccao de célula em 100 µ l meio de cultura celular isento de soro e misture vortexing por 1 s.
    2. Adicionar 2 µ g do ADN do plasmídeo (pDHsp70-Ac-P35/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3-anel/V5-His) em 100 µ l de meio de cultura celular isento de soro e misture vortexing para 1 s (Figura 2).
    3. Combinar o Plasmídeo diluídos e reagente de Transfeccao de célula diluído (210 µ l) e misture num Vortex durante 1 s. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
    4. Adicione uma pipeta P1000 210 µ l de mistura de reagente de Transfeccao de DNA gota a gota sobre as células. Incube a 28 ° C por 5h.
    5. Substitua o meio de chapeamento com 0,5 mL de meio de cultura celular usando uma pipeta P1000. Selo da placa de 24 com fita e incube as celulas a 28 ° C, durante 16 h.
  3. As células transfectadas de choque do calor: colocar a placa em um banho de água de 42 ° C (flutuando na superfície da água). Aqueça por 30 min e retornar a placa de 24 a 28 ° C a temperatura da incubadora.
  4. Deteção da expressão da proteína
    1. Após 1h ou choque de calor 5h, lave as células com 0,5 mL de tampão de PBS 1 x brevemente três vezes.
      Nota: Diluir 10 x tampão PBS para tampão PBS 1x, adicionando 1 mL de tampão PBS de 10 x 9 mL esterilizado ddH2O
    2. Lise as células com 40 µ l de 1 x tintura de carregamento SDS pipetando para cima e para baixo.
      Nota: Dilua 4 x tintura de carregamento SDS pela mistura de 30 µ l de tampão PBS 1x e 10 µ l de tampão de amostra SDS de 4x.
    3. As amostras da proteína a 98 ° C por 10 min em um bloco de calor de calor, spin para baixo por 1 min e colocar no gelo para ensaio de Western blot.
    4. Western blot-ensaio
      Siga o procedimento de ensaio de Western blot no Eslami e Lujan13. Executar geles de SDS-PAGE14: um gel submetido a azul de Coomassie coloração (controle de carregamento para verificar que a quantidade de amostras da proteína carregadas em cada bem é igual em quantidade) e o outro sujeito a Western blot ensaio, de acordo com Eslami e Lujan13 .
    5. Detectar proteínas da fusão V5-marcados com anticorpos de coelho anti-V5 (5 mg/mL) (diluição 1:5000 no buffer TBST para trabalhar a concentração de 1 µ g/mL) e conjugado de peroxidase (HRP) de anti-coelho IgG-rábano cabra (0,8 mg/mL) (diluição de 1: 10000 em buffer TBST para trabalhar concentração 0,08 µ g/mL).
      Nota: Ajustar a porcentagem de poliacrilamida para 17,5% quando o peso molecular da proteína a ser < 17 kDa.

3. anti-apoptotic ensaio da atividade

  1. Apoptose celular induzida pelo gene: repita o procedimento acima de 2.1 para 2.3. Co transfect 1 µ g de pDHsp/D-rpr/bandeira-His plasmídeo (contendo gene de indutor de apoptose) com 1 µ g de DNA de plasmídeo [pDHsp70/V5-seu vetor (controle negativo), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (controle positivo), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3-anel/V5-His, respectivamente... Às 5h pós-calor tratamento de choque, conduza o ensaio da viabilidade celular (Figura 2).
  2. Apoptose celular induzida por substância química: repita o procedimento acima de 2.1 para 2.3. Na etapa 2.1.2, chapa de 1 x 106 células de sf9 em cada poço em uma placa de 6. Transfect 4 µ g de DNA de plasmídeo [pDHsp70/V5-seu vetor (controle negativo), pDHsp70-Ac-P35/V5-His (controle positivo), pDHsp70-Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70-Ly-IAP3-BIR/V5-His ou pDHsp70-Ly-IAP3-anel/V5-His, respectivamente... Em choque de pós-calor 5h, tratar sf9 células com 2 mL de meio de cultura celular ActD para 16 h e realizar o ensaio da viabilidade celular (Figura 2).
    Nota: Volume mínimo para cobrir um poço de placa de 6 é de 1 mL.
  3. Execute as acima anti-apoptotic atividade ensaio experiências, incluindo 3.1 e 3.2 no triplica.

4. ensaio da viabilidade celular

  1. Lave as células tratadas com a adição de 1 mL de tampão de PBS x 1 por 1 min 3 vezes. Ressuspender as células pipetando 1 mL 1X PBS de tampão contendo 0,04% trypan azul e mancha por 3 min à temperatura ambiente. Transferi a suspensão de células em um microtubo de 1,5 mL.
    Nota: Dilua a solução de azul de Tripan 0,4% pela mistura de 9 mL de 1X PBS buffer e 1 mL 0,4% azul trypan solução.
  2. Transferência de 10 µ l trypan azul manchado de suspensão para o hemocytometer com uma pipeta de P10 e contar as células viáveis intactas sob um microscópio de luz.
  3. Análise estatística
    1. Calcular os dados gravados e apresentar como os meios ± S.D. para todas as acusações.
    2. Analise os dados usando o teste de Student bicaudal t por com o Microsoft Excel. Definir dados estatisticamente significativos como P-valor < 0,05.

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Representative Results

O comprimento total e outros dois truncamentos (domínios BIR e anel) de Ly-IAP3 de LyxyMNPV foram overexpressed em células sf9, baseia o calor baseada em choque pDHsp/V5-His /Spodoptera frugiperda celular sistema (sf9 celular). O pDHsp/V5-His contido uma drosófila calor choque proteína promotora, que impulsiona a expressão gênica a jusante a uma temperatura de 42 ° C condição usando celulares fatores transcricionais e a tradução sistema (Figura 1)8 ,9,11. O fluxograma todo tecnológico é mostrado na Figura 2. Após 1h ou choque de calor 5h, as células foram lysed com tampão de amostra de proteína e submetidas ao ensaio de Western blot, para confirmar a expressão da proteína. Os resultados indicaram que as proteínas completos, AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR e Ly-IAP3-anel, poderiam ser detectadas em células transfectadas em choque de pós-calor 1 h ou 5h. Além disso, o acúmulo de proteína foram encontrado em choque de pós-calor 5h (Figura 3). Assim, de acordo com os dados, o ensaio funcional da proteína foi realizado no ponto de tempo de expressão máxima de proteína (choque de pós-calor 5h).

Tanto apoptose induzida pelo gene celular e apoptose celular induzida por substância química pode ser adaptado a este sistema para avaliar a atividade anti-apoptotic (Figura 2). Para apoptose celular induzida pelo gene, duas construções (apoptose indutor e alvo gene plasmídeo construções) foram transfectadas co em sf9 células e, em seguida, calor chocado a expressão de gene activite. Além disso, a proteína anti-apoptotic Ac-P35 (controle positivo) e uma proteína de indutor de apoptose (D-RPR) também foram expressos usando este sistema de expressão transiente de choque do calor.

Após o choque térmico, ambos os genes começaram a ser expressa e traduzido em proteínas. Em comparação com o vetor/D-RPR, o controlo positivo (Ac-P35/D-RPR) mostrou atividade anti-apoptotic alta, que chegou até 80% da taxa de viabilidade. Partir dos resultados de viabilidade celular das outras construções, os investigadores poderiam comparar a atividade anti-apoptotic para os outros ou com o controle positivo (Figura 4A). Para apoptose celular induzida por produto químico, apenas uma construção foi transfectada em células sf9. Após choque de post-calor h 5, os produtos químicos (ActD) foram adicionados, e a viabilidade celular foi mensurada após 16 h (Figura 2). Comparados com os de controlo positivo (AC-P35) ou o controlo negativo (vetor), cada construção mostrou os diversos efeitos sobre a atividade anti-apoptotic (Figura 4B).

Figure 1
Figura 1: Diagrama e do nucleotide sequências de ly-iap3 construções de plasmídeo relativo baseadas no vetor pDHsp/V5-His. o códon de início (ATG) é mostrado em negrito. Sublinhado indica os locais de corte de enzima de restrição (HindIII na cor vermelha; BamHI na cor azul); a sequência na cor verde indica a região promotora de Dhsp70. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: fluxograma de choque do calor induzido proteína expressão (sistema celular pDHsp/V5-His/sf9). Apoptose celular induzida pelo gene e tratamentos de apoptose celular induzida por substância química foram indicados para a etapa inicial (co do transfection com plasmídeo de gene de indutor de apoptose) ou para a etapa posterior depois de choque do calor (apoptose induzida por substância química), respectivamente, para ensaio de antiapoptose. Figura modificada e lenda reproduzido com permissão da Springer11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: superexpressão de AC-P35, Ly-IAP3, Ly-IAP3-BIR e Ly-IAP3-anel usar o choque do calor induzido proteína expressão (sistema celular pDHsp/V5-His/sf9). Em 1 h ou h 5 post calor choque, os lisados celulares foram colhidos e submetidos a ensaio de Western blot e SDS/PAGE. (A) ensaio de Western blot com anticorpo α-V5 e (B) SDS/PAGE corado com azul de Coomassie, como o controle de carregamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Ensaios de viabilidade para D-rpr ou apoptose induzida por actinomicina D. (A) sf9 células foram transfectadas com pDHsp70/V5-seu vetor (Vector apenas) e co transfectadas pDHsp70/drpr/bandeira-His com vector pDHsp70/V5-seu pDHsp70/Ac-P35/V5-His, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-His, pDHsp70 / Ly-IAP3-anel/V5-His, respectivamente. As diferenças entre vetor e P35 e entre vetor e Ly-IAP3 são estatisticamente significativas (t-teste; P < 0,05). (B) sf9 células foram transfectadas com ou pDHsp70/V5-seu vetor ou pDHsp70/Ac-P35/V5-His, pDHsp70/Ly-IAP3/V5-His, pDHsp70/Ly-IAP3-BIR/V5-His, pDHsp70/Ly-IAP3-anel/V5-His, respectivamente, às 5h após choque térmico, ActD foi adicionado e 16 h mais tarde, a viabilidade celular foi mensurada. A diferença entre vetor e P35 é estatisticamente significativa (t-teste; P < 0,05). Figura modificada e lenda reproduzido com permissão da Springer11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome Sequências de
pDHsp-IAP3-HindIII-F 5´-GGAAGCTTACCATGGACGACGAACGACGCAG-3´
pDHsp-IAP3-BamHI-R GC-5´GGATCCCGGATGTAGGAACACCTTGA-3´
iap3-BIR-BamHI-r CG-5´GGATCCCGGCAGATCGCCGCCGCGGA-3´
iap3-anel-HindIII-F 5´-GGAAGCTTACCGAGCTCATAAAAAGGCCCGT-3´
pDhsp70-F2 5´-CTGCAACTACTGAAATCAACCAAG-3´
Op-IE2R 5´-GACAATACAAACTAAGATTTAGTCAG-3´

Tabela 1: os conjuntos de primer usados para método de clonagem baseados em PCR. * Os pares de bases de DNA sublinhados indicado os locais de enzima de restrição. A lista de modificados cartilha reproduzida com permissão de Springer11.

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Discussion

O conceito de sistema de células de pDHsp/V5-His/sf9 baseada em choque de calor foi primeiramente descrito por Clem et al em 19948. Comparação do promotor do gene de baculoviral (IE1) e Drosophila hsp70 mostrou que aquele hsp70 tinha uma eficiência mais elevada em células de mosquito10. Além disso, devido a indução de choque do calor, o momento da expressão da proteína pode ser controlado precisamente após o tratamento de choque térmico. Este sistema foi então aplicado para ensaios funcionais da proteína do camarão e medicamentos (NPV) IAP proteínas9,11. Neste protocolo, foram utilizados um total de 6 construções plasmídeo: três (pDHsp/V5-His, pDHsp/Ac-p35/V5-His e pDHsp/D-rpr/bandeira-His) foram fornecidos por Jian-Horng Leu9e as outras três construções (pDHsp-iap3/V5-His, pDHsp-iap3-BIR/V5-His, e pDHsp-iap3-anel/V5-His) foram construídos por Nai et al., 201611. Parece que este promotor em inseto células funciona mais eficientemente do que os promotores de genes baculoviral. No entanto, durante a manipulação do presente protocolo, existem vários pontos que precisam ser considerados. Antes de transfeccao Plasmideo, verificando a inserção da sequência de DNA é importante para a expressão do gene; assim, ele deve ter se fundido com o epítopo V5 para formar uma proteína de fusão V5-marcados no final da sequência de destino. Além disso, fusao diferentes (ou seja, bandeira epítopo) também poderia ser projetado no vetor pDHsp-baseado para um ensaio de ligação de proteínas em vitro . Este procedimento de extensão ajudaria a investigar mais de interações proteína-proteína9. Portanto, o anticorpo policlonal de V5 comercial pode ser usado para a detecção de proteínas. A taxa de transfecção em diferentes células de insetos deve ser testada antes do experimento. Taxas mais baixas de transfeccao podem resultar em não-detectáveis de expressão da proteína; assim, um vetor de pDHsp contendo um gene relatório apropriado (ou seja, verde fluorescente gene) poderia transfected em células de inseto para avaliar a eficiência do transfection.

A principal limitação desta plataforma de expressão de choque de calor é o nível de expressão de proteínas. Em alguns casos, verificou-se um nível de expressão de baixa proteína. De acordo com um estudo-piloto, não houve nenhum efeito significativo da dose-dependente que ocorreu quando o Plasmídeo mais foi transfectado em células sf9 (dados não mostrados). Assim, este efeito pode ser causado pela via ubiquitina-Proteassoma (UPP) ou outros mecanismos desconhecidos11. Pesquisadores devem examinar a expressão da proteína na presença do inibidor de proteossomo (i.e., MG-132) para esclarecer e recolve esta questão11. A outra limitação é que a produção sustentável de proteínas associadas com os vírus recombinantes não poderia ser alcançada. Assim, a estabilização e a quantidade de expressão de proteínas também são preocupações em relação a este sistema. Portanto, um curso de tempo de produção de proteína também deve ser testado pelo ensaio de Western blot antes o ensaio funcional. Neste protocolo, nós em relação a dois pontos de tempo (1 e 5 h depois de choque do calor) e observou o acúmulo de produção de proteína alvo de 1h a 5h. Sugere-se um aumento nos pontos de tempo a fim de determinar as melhores condições de temporização para o ensaio funcional da proteína.

Para a proteína ensaio funcional, a proteína anti-apoptotic Ac-P35 (controle positivo) e uma proteína de indutor de apoptose (D-RPR) também foram expressos usando este sistema de expressão transiente de choque do calor. Estas duas proteínas são descritas como antagonistas funcionais de11,9,15. Portanto, o vetor/D-RPR e Ac-P35/D-RPR serviria como um controle negativo e o controle positivo, respectivamente. Usando esta comparação, a atividade anti-apoptotic de proteínas do alvo pode ser determinada.

O protocolo apresentado poderia fornecer uma plataforma para expressar proteínas estranhas mais rapidamente, ou poderia ser mais aplicado para avaliar a atividade de proteína antiapoptose em células de inseto. Uma vez que os pesquisadores obter os resultados preliminares da função da proteína, este sistema poderia ser usado para estudos adicionais.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Agradecemos o Dr. Jian-Horng Leu do Instituto de biologia marinha, Universidade Nacional de Taiwan oceano para fornecer 3 construções de plasmídeo. Esta pesquisa foi apoiada por Grant 106-2311-B-197-001 - do Ministério da ciência e tecnologia (a maioria).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibiotic-Antimycotic, 100X Gibco 15240-062 for insect cell culture
Certified Foetal Bovine Serum Bioind 04-001-1A
Sf-900 II SFM Thermo Fisher 10902096 serum-free cell culture medium
Sf9 cells ATCC CRL-1711
25cm2 cell culture flask Nunc, Thermo Fisher 156340
Inverted light microscopy WHITED WHITED WI-400
RBC HIT Competent Cell Bioman RH618-J80 Escherichia coli (DH5α)
L.B. Broth (Miller) Bioman LBL407
Agar, Bacteriological Grade Bioman AGR001
Zeocin Invitrogen ant-zn-1 selection antibiotic
PCR Master Mix (2X) ThermoFisher K0171
Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) Geneaid PIE25
Actinomycin D SIGMA A9415
Corning 50 mL centrifuge tubes SIGMA CLS430829-500EA 50 mL tubes
Hemocytometer Gizmo Supply Co B-CNT-SLDE-V2
24-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 142475 24-well plate
Cellfectin II Reagent Thermo Fisher 10362100 cell transfectin reagent
PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 Thermo Fisher AM9624
4×SDS Loading Dye Bioman P1001
Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) Merck Milipore IPVH00010 PVDF membranes
Mini Trans-Blot Cell system BIO-RED 1703930 Blotting device
Ponceau S solution SIGMA 6226-79-5
Anti-V5 SIGMA V8137 rabbit anti-V5 antibody
Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) Jackson 111-035-003
Tween 20 Merck 817072
6-Well Multidish Nunc, Thermo Fisher 145380
0.4 % trypan blue solution AMRESCO K940-100ML
P10 pipetman Gilson F144802
P1000 pipetman Gilson F123602
Tape Symbio PPS7 24 well tape ( 19 mm×36 M)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Genética questão 132 expressão transiente o ensaio funcional da proteína sf9 célula linha mariposa Ksýlina vários medicamentos Ly-inhinbitor de apoptose-3 promotor de choque 70 de calor de Drosophila pDHsp/V5-His Drosophilia anjo da morte actinomicina-D
Expressão transiente de estrangeiros Genes em células de inseto (sf9) para o ensaio funcional da proteína
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Chang, J. C., Lee, S. J., Kim, J.… More

Chang, J. C., Lee, S. J., Kim, J. S., Wang, C. H., Nai, Y. S. Transient Expression of Foreign Genes in Insect Cells (sf9) for Protein Functional Assay. J. Vis. Exp. (132), e56693, doi:10.3791/56693 (2018).

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