Transcriptionally düzenlenmiş uyku güzellik sistem entegrasyon arızalı Lentiviral vektör paketlenmiş bir verimli Vitro transpozisyonu yöntemle

Summary

Bu iletişim kuralı tarafından transcriptionally düzenlenmiş Uyuyan güzel sistem istikrarlı bir gen ilgi entegrasyonu insan genomu ulaşmak için bir yöntem açıklanır. Arızalı lentiviral Vektörler, vitro iletim insan hücre ve moleküler tahlil transduced hücrelerde entegrasyonu hazırlanması rapor edilmektedir.

Abstract

Uyuyan güzel (SB) transposon gen transferi ve fonksiyonel genomik için kanıtlanmış etkinliği ile viral entegre bir sistemdir. SB transposon makine en iyi duruma getirmek için bir transcriptionally düzenlenmiş hiperaktif transposase (SB100X) ve T2 tabanlı transposon istihdam edilmektedir. Genellikle, transposase ve transposon geçici plazmid transfection tarafından sağlanır ve SB100X ifade bir bünye düzenleyici tarafından tahrik edilmektedir. Burada, SB100X ifade denetlemek ve stabil bir gen ilgi (GOI) “kes ve Yapıştır” SB ile tümleştirmek için çeşitli fiziksel ve kimyasal transfection yöntemler dayanıklıdır insan hücreleri SB bileşenleri sunmak için verimli bir yöntem tarif mekanizma. Hiperaktif transposase ifade sıkı gen ekspresyonu 1992’den beri denetlemek için yaygın olarak kullanılan Tet-ON sistem tarafından kontrol edilir. Gen ilgi ters yineler (IR) T2 transposon tarafından çevrili olduğunu. Her iki SB bileşenleri arızalı lentiviral vektörler geçici HEK293T hücrelerinde üretilen entegre olarak paketlenir. İnsan hücreleri, hücre hatları veya Primer hücre insan dokusundan vitro geçici viral Vektörler ile transduced vardır. Doksisiklin (dox, tetrasiklin analog) ek kültür orta içine, üzerine bir transposase ifade ince ayar ölçülür ve gen tedavi hücre genomu ilgi uzun ömürlü entegrasyonunu sonuçları. Bu yöntem etkili ve uygulanabilir hücre kültürünü (örneğin, HeLa hücreleri) ve Primer hücre (örneğin, insan birincil lenfositi) ve böylece genetik mühendisliği ve tedavi gen transferi için değerli bir araç temsil eder.

Introduction

T2-esaslı transposon birleştiğinde hiperaktif SB100X transposase preklinik gen terapisi uygulamaları^1,2,3‘ te, genom değişiklikler^4,5, zaten kullanılmış ve İndüklenmiş pluripotent kök hücre (IPSC)^6,7yeniden programlama. Genellikle, SB bileşenleri geçici plazmid transfection tarafından sağlanır ve güçlü bir bünye organizatörü transposase ifade ediyor. Ancak, transfection gelişmiş yeni yöntemler rağmen birçok uygulama için bir meydan okuma iki bileşenli sistemi teslimini kalır. Böylece, yeni bir teslim iletişim kuralı geliştirilmesi artan ilgi vardır. Plazmid⁸ ve mRNA⁹transfection yöntemlerinin yanı sıra, viral teslim dayalı adenoviral^10,11, adeno ilişkili viral (AAV)¹², Baculovirus¹³, gammaretroviral¹⁴ ve lentiviral vektörler¹⁵ geçmişte önerdi. Özellikle, seçim sistemi viral vektör entegrasyonunu olmadan SB bileşenlerinin geçici bir teslimatlar garantilemelidir. Yine de, transposase kurucu ifade güvenlik kaygıları nedeniyle kontrol edilemeyen transposon rehopping riskini yükseltir.

Bu nedenle, bir rafine Tet-ON sistem tarafından transkripsiyon düzenleme SB100X, ilk mücadeledir. Herpes simpleks virüs-1 (HSV-1)¹⁶, Timidine kinaz (TK) gen en az organizatörü (-81) ile orijinal gelişmiş en az Sitomegalovirüs (CMV) düzenleyici yerine kullanarak elde edilen bir değiştirilmiş Tet-duyarlı organizatörü klonlanmış, ters yönde SB100X cDNA (pTetOTKSB100X). Mutasyona uğramış ters-tetrasiklin-transactivator rtTA2^s-M2¹⁷ farklı bir plazmid klonlanmış güçlü kurucu organizatörü (phosphoglycerate organizatörü, PGK) kontrolü altında ifade edilir (pCCL-PGKrtTA2^S-M2). Kültür ortamına eklendiğinde rtTA2^sdox bağlar-M2 modülatör ve karmaşık veya SB100X ifade¹⁸sıkıca düzenlenmiş indüksiyon sonuçlanan Tet organizatörü tethers.

İkinci büyük sorun insan Primer hücre verimsiz transfection çeşitli fiziksel ve kimyasal yöntemlerle ortaya çıkar. Transposase transfection, SB100X ve rtTA2^sdayanıklı insan hücrelerinde verimli bir şekilde teslim etmek-M2 ifade kaset iki Tümleştirme arızalı lentiviral vektörler (IDLVs)¹⁹paketlenir: IDLVTKSB ve IDLVrtTA2^s– M2. Viral vektörler geçici olarak üçüncü nesil vektörel çizimler HEK293T hücreleri²⁰ ve pseudotyped Vescicular Stomatit virüs (VSV-G), hangi enfeksiyon geniş bir yelpazede confers glikoprotein G ile üretilmektedir. Vektör parçacıklar tarafından ultrasantrifüj konsantre ve HIV-1 Gag p24 immunocapture tarafından titre. Hücre satırları ve Primer hücre transduce için vektör parçacıklar polybrene ile complexed ve hedef hücreleri ile dox içinde inkübe. SB100X ifade transduced hücrelerin aktivasyonu uyuşturucu bağımlı kantitatif RT-PCR (qRT-PCR)¹⁸tarafından ölçülür.

Tet düzenlenir SB100X ifadesi gösterdi sonra GOI (örneğin, yeşil flüoresan protein, GFP) transpozisyonu hedef hücre genomu içine Bak ve Mikkelsen²¹tarafından açıkça kapsamlıdır moleküler olayları izler. Üçüncü bir IDLV vektör taşıyan bir ifade kaset T2-transposon IRS (IDLVT2) arasında klonlanmış GOI için inşa ve yukarıda da belirtildiği gibi paketlenmiş vardır. Son olarak, üç IDLV vektörler verimli bir şekilde insan hücreleri (örneğin, birincil lenfositi) vitro transduce ve Doksisiklin¹⁸huzurunda GOI tümleştirmek için kullanılabilir.

Protocol

1. plazmid istihdam Not: Plazmid pCCL-PGKrtTA2S-M2 lütfen Prof. Zappavigna (üniversite, Modena ve Reggio Emilia, Modena, İtalya) tarafından sağlanan. Hiperaktif transposase kodlama dizisi taşıyan pCMVSB100X Plazmid ve pT2/BH transposon plazmid nazikçe Prof Z. Ivics (Paul Ehrlich Enstitüsü, Langen, Almanya) ve Prof. Dr. Z. Izvak (Max Delbruck Merkezi moleküler tıp, Berlin, tarafından verilmiştir Almanya). Tüm klonlama için Escherichia Coli içinde (…

Representative Results

Yordamı kullanarak sunulan burada, üç IDLV vektörler düzenlenmiş SB bileşenleri taşıma (SB100X, rtTA2S-M2 ve T2-GFP transposon) paketlenmiş ve verimli bir şekilde teslim ve sıkıca SB sistem insan hücrelerinde düzenlenmesi için kullanılır. Şekil 1A ( Tablo 2′ de bildirilen) iki IDLV vektörler iyi doz kombinasyonu ile SB transposase transkripsiyon Yönetmeliği değerlendirmek için yapılan vitro iletim …

Discussion

Burada, stabil bir GOI genom Uyuyan güzeltarafından hedef hücrelerin içine entegre etmek için yaygın olarak erişilebilir bir metodoloji açıklayan-hukuka aracılı. SB sistem genom düzenlemek için nonviral bir yöntem sağlamak için geliştirilmiştir, verimli bir şekilde teslim (transposase ve T2 transposon) tümleştirme makinelerin zorunlu olsa da. Bu nedenle, SB sistem pek transfectable Primer hücre üzerinde kullanmak için viral SB bileşenlerinin teslimatlar son yıllarda^10<…

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine	Lonza	BE12-614F	Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline	Lonza	BE17-737E	Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5%	Merck	106580	Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid – ACS reagent 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection	Fresenius Kabi	–	Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter	Whatman	10462100	Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes	Beckman Coulter	326823	Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit	Perkin Elmer	NEK50001KT	Kit for IDLV particle titration.
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	100938B	AnalaR BDH	Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)	GIBCO	15400-054	Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin	GIBCO	16030-074	Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media	GIBCO	21765	Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum	Lonza	DE14-801F	Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin	GIBCO	10099-141	Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	Reagents for keratinocyte growth.
Adenine	VWR	1152-25	Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone	VWR	3867-1	Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T5516	Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF	Austral Biological	GF-010-9	Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody	Miltenyi Biotech	130-096-099	To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase	Life Technologies	18080051	Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	(any)	–	Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase	Promega	M740B	Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology	Sigma-Aldrich	A9539	Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X	Invitrogen	15581028	Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D-9891	drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile	Falcon Corning	352096	Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile	Falcon Corning	353025	Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile	Falcon Corning	353046	Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free	(any)	–	Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystem	4346906	96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap	BD Falcon	352052	Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)	(any)	–	Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)	(any)	–	Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter	(any)	–	Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler	(any)	–	Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment	(any)	–	Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD	–	Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	7900HT	Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.	(any)	–	Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor	Beckman Coulter	–	Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.