Summary

Transcriptionally düzenlenmiş uyku güzellik sistem entegrasyon arızalı Lentiviral vektör paketlenmiş bir verimli Vitro transpozisyonu yöntemle

Published: January 12, 2018
doi:

Summary

Bu iletişim kuralı tarafından transcriptionally düzenlenmiş Uyuyan güzel sistem istikrarlı bir gen ilgi entegrasyonu insan genomu ulaşmak için bir yöntem açıklanır. Arızalı lentiviral Vektörler, vitro iletim insan hücre ve moleküler tahlil transduced hücrelerde entegrasyonu hazırlanması rapor edilmektedir.

Abstract

Uyuyan güzel (SB) transposon gen transferi ve fonksiyonel genomik için kanıtlanmış etkinliği ile viral entegre bir sistemdir. SB transposon makine en iyi duruma getirmek için bir transcriptionally düzenlenmiş hiperaktif transposase (SB100X) ve T2 tabanlı transposon istihdam edilmektedir. Genellikle, transposase ve transposon geçici plazmid transfection tarafından sağlanır ve SB100X ifade bir bünye düzenleyici tarafından tahrik edilmektedir. Burada, SB100X ifade denetlemek ve stabil bir gen ilgi (GOI) “kes ve Yapıştır” SB ile tümleştirmek için çeşitli fiziksel ve kimyasal transfection yöntemler dayanıklıdır insan hücreleri SB bileşenleri sunmak için verimli bir yöntem tarif mekanizma. Hiperaktif transposase ifade sıkı gen ekspresyonu 1992’den beri denetlemek için yaygın olarak kullanılan Tet-ON sistem tarafından kontrol edilir. Gen ilgi ters yineler (IR) T2 transposon tarafından çevrili olduğunu. Her iki SB bileşenleri arızalı lentiviral vektörler geçici HEK293T hücrelerinde üretilen entegre olarak paketlenir. İnsan hücreleri, hücre hatları veya Primer hücre insan dokusundan vitro geçici viral Vektörler ile transduced vardır. Doksisiklin (dox, tetrasiklin analog) ek kültür orta içine, üzerine bir transposase ifade ince ayar ölçülür ve gen tedavi hücre genomu ilgi uzun ömürlü entegrasyonunu sonuçları. Bu yöntem etkili ve uygulanabilir hücre kültürünü (örneğin, HeLa hücreleri) ve Primer hücre (örneğin, insan birincil lenfositi) ve böylece genetik mühendisliği ve tedavi gen transferi için değerli bir araç temsil eder.

Introduction

T2-esaslı transposon birleştiğinde hiperaktif SB100X transposase preklinik gen terapisi uygulamaları1,2,3‘ te, genom değişiklikler4,5, zaten kullanılmış ve İndüklenmiş pluripotent kök hücre (IPSC)6,7yeniden programlama. Genellikle, SB bileşenleri geçici plazmid transfection tarafından sağlanır ve güçlü bir bünye organizatörü transposase ifade ediyor. Ancak, transfection gelişmiş yeni yöntemler rağmen birçok uygulama için bir meydan okuma iki bileşenli sistemi teslimini kalır. Böylece, yeni bir teslim iletişim kuralı geliştirilmesi artan ilgi vardır. Plazmid8 ve mRNA9transfection yöntemlerinin yanı sıra, viral teslim dayalı adenoviral10,11, adeno ilişkili viral (AAV)12, Baculovirus13, gammaretroviral14 ve lentiviral vektörler15 geçmişte önerdi. Özellikle, seçim sistemi viral vektör entegrasyonunu olmadan SB bileşenlerinin geçici bir teslimatlar garantilemelidir. Yine de, transposase kurucu ifade güvenlik kaygıları nedeniyle kontrol edilemeyen transposon rehopping riskini yükseltir.

Bu nedenle, bir rafine Tet-ON sistem tarafından transkripsiyon düzenleme SB100X, ilk mücadeledir. Herpes simpleks virüs-1 (HSV-1)16, Timidine kinaz (TK) gen en az organizatörü (-81) ile orijinal gelişmiş en az Sitomegalovirüs (CMV) düzenleyici yerine kullanarak elde edilen bir değiştirilmiş Tet-duyarlı organizatörü klonlanmış, ters yönde SB100X cDNA (pTetOTKSB100X). Mutasyona uğramış ters-tetrasiklin-transactivator rtTA2s-M217 farklı bir plazmid klonlanmış güçlü kurucu organizatörü (phosphoglycerate organizatörü, PGK) kontrolü altında ifade edilir (pCCL-PGKrtTA2S-M2). Kültür ortamına eklendiğinde rtTA2sdox bağlar-M2 modülatör ve karmaşık veya SB100X ifade18sıkıca düzenlenmiş indüksiyon sonuçlanan Tet organizatörü tethers.

İkinci büyük sorun insan Primer hücre verimsiz transfection çeşitli fiziksel ve kimyasal yöntemlerle ortaya çıkar. Transposase transfection, SB100X ve rtTA2sdayanıklı insan hücrelerinde verimli bir şekilde teslim etmek-M2 ifade kaset iki Tümleştirme arızalı lentiviral vektörler (IDLVs)19paketlenir: IDLVTKSB ve IDLVrtTA2s– M2. Viral vektörler geçici olarak üçüncü nesil vektörel çizimler HEK293T hücreleri20 ve pseudotyped Vescicular Stomatit virüs (VSV-G), hangi enfeksiyon geniş bir yelpazede confers glikoprotein G ile üretilmektedir. Vektör parçacıklar tarafından ultrasantrifüj konsantre ve HIV-1 Gag p24 immunocapture tarafından titre. Hücre satırları ve Primer hücre transduce için vektör parçacıklar polybrene ile complexed ve hedef hücreleri ile dox içinde inkübe. SB100X ifade transduced hücrelerin aktivasyonu uyuşturucu bağımlı kantitatif RT-PCR (qRT-PCR)18tarafından ölçülür.

Tet düzenlenir SB100X ifadesi gösterdi sonra GOI (örneğin, yeşil flüoresan protein, GFP) transpozisyonu hedef hücre genomu içine Bak ve Mikkelsen21tarafından açıkça kapsamlıdır moleküler olayları izler. Üçüncü bir IDLV vektör taşıyan bir ifade kaset T2-transposon IRS (IDLVT2) arasında klonlanmış GOI için inşa ve yukarıda da belirtildiği gibi paketlenmiş vardır. Son olarak, üç IDLV vektörler verimli bir şekilde insan hücreleri (örneğin, birincil lenfositi) vitro transduce ve Doksisiklin18huzurunda GOI tümleştirmek için kullanılabilir.

Protocol

1. plazmid istihdam Not: Plazmid pCCL-PGKrtTA2S-M2 lütfen Prof. Zappavigna (üniversite, Modena ve Reggio Emilia, Modena, İtalya) tarafından sağlanan. Hiperaktif transposase kodlama dizisi taşıyan pCMVSB100X Plazmid ve pT2/BH transposon plazmid nazikçe Prof Z. Ivics (Paul Ehrlich Enstitüsü, Langen, Almanya) ve Prof. Dr. Z. Izvak (Max Delbruck Merkezi moleküler tıp, Berlin, tarafından verilmiştir Almanya). Tüm klonlama için Escherichia Coli içinde (…

Representative Results

Yordamı kullanarak sunulan burada, üç IDLV vektörler düzenlenmiş SB bileşenleri taşıma (SB100X, rtTA2S-M2 ve T2-GFP transposon) paketlenmiş ve verimli bir şekilde teslim ve sıkıca SB sistem insan hücrelerinde düzenlenmesi için kullanılır. Şekil 1A ( Tablo 2′ de bildirilen) iki IDLV vektörler iyi doz kombinasyonu ile SB transposase transkripsiyon Yönetmeliği değerlendirmek için yapılan vitro iletim …

Discussion

Burada, stabil bir GOI genom Uyuyan güzeltarafından hedef hücrelerin içine entegre etmek için yaygın olarak erişilebilir bir metodoloji açıklayan-hukuka aracılı. SB sistem genom düzenlemek için nonviral bir yöntem sağlamak için geliştirilmiştir, verimli bir şekilde teslim (transposase ve T2 transposon) tümleştirme makinelerin zorunlu olsa da. Bu nedenle, SB sistem pek transfectable Primer hücre üzerinde kullanmak için viral SB bileşenlerinin teslimatlar son yıllarda10<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Prof. Zappavigna, Üniversitesi, Modena ve Reggio Emilia, Modena, İtalya ile pCCL-PGKrtTA2Sbize sağlamak için teşekkür ederiz-M2 plazmid. Biz de Prof Z. Ivics (Paul Ehlrich Enstitüsü, Langen, Almanya) ve Prof. Dr. Z. Izvak (Max Delbruck merkezi için moleküler tıp, Berlin, Almanya) için pCMVSB100X ve pT2/BH plazmidleri kabul edersiniz. Bu eser DEBRA uluslararası ve İtalyanca üniversite ve araştırma Bakanlığı tarafından desteklenmiştir.

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine Lonza BE12-614F Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized GE Healthcare Life Sciences SH30071.03 Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml Lonza DE17-602E Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM Lonza BE17-605E Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653 Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline Lonza BE17-737E Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5% Merck 106580 Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid – ACS reagent 37% (HCl) Sigma-Aldrich 320331 Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection Fresenius Kabi Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter Whatman 10462100 Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes Beckman Coulter 326823 Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg Lonza BE17-516F Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 (Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit Perkin Elmer NEK50001KT Kit for IDLV particle titration.
Polybrene Sigma-Aldrich 107689 Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg GIBCO BE17-160E Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) 100938B AnalaR BDH Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X) GIBCO 15400-054 Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin GIBCO 16030-074 Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media GIBCO 21765 Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum Lonza DE14-801F Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin GIBCO 10099-141 Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas Sigma-Aldrich I5500 Reagents for keratinocyte growth.
Adenine VWR 1152-25 Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone VWR 3867-1 Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae Sigma-Aldrich C8052 Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine Sigma-Aldrich T5516 Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF Austral Biological GF-010-9 Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody Miltenyi Biotech 130-096-099 To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134 RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase Life Technologies 18080051 Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP) Sigma-Aldrich D7295 Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water (any) Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase Promega M740B Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology Sigma-Aldrich A9539 Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X Invitrogen 15581028 Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E1510 Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline Sigma-Aldrich D-9891 drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystem 4304437 TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile Falcon Corning 352096 Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile Falcon Corning 353025 Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile Falcon Corning 353046 Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL Eppendorf 0030 120.086 Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL Eppendorf 0030 120.094 Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free (any) Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL Applied Biosystem 4346906 96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap BD Falcon 352052 Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes) (any) Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes) (any) Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter (any) Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler (any) Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment (any) Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2 BD Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 7900HT Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets. (any) Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor Beckman Coulter Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.

References

  1. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
  2. Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).
  3. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  4. Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
  5. Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).
  6. Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).
  7. Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).
  8. Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9 (11), e112712 (2014).
  9. Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).
  10. Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).
  11. Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8 (10), e75344 (2013).
  12. Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8 (10), e76771 (2013).
  13. Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).
  14. Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).
  15. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  16. Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
  17. Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).
  18. Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038 (2016).
  19. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).
  20. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  21. Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A laboratory Manual. , (2012).
  23. Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).

Play Video

Cite This Article
Benati, D., Cocchiarella, F., Recchia, A. An Efficient In Vitro Transposition Method by a Transcriptionally Regulated Sleeping Beauty System Packaged into an Integration Defective Lentiviral Vector. J. Vis. Exp. (131), e56742, doi:10.3791/56742 (2018).

View Video