I denne artikkelen presenterer vi metoder å isolere og skille benmarg stromal celler og blodkreft stamceller fra musen lange ben. To forskjellige protokoller presenteres gir ulike celle populasjoner egnet for ekspansjon og differensiering inn osteoblasts, adipocytter og osteoklast.
Benmarg stromal celler (BMSCs) utgjør en celle befolkningen rutinemessig brukes som en representasjon av mesenchymal stamceller i vitro. De bor i benmargen hulrom sammen med blodkreft stamceller (HSCs), som kan gi opphav til røde blod celler og immun progenitors osteoklast. Dermed utdrag av celle populasjoner fra benmargen resultatene i en svært heterogen blanding av ulike celle populasjoner, som kan presentere utfordringer i eksperimentell design og forvirre data tolkning. Flere isolasjon og kultur teknikker er utviklet i laboratorier for å få mer eller mindre homogen bestander av BMSCs og HSCs invitro. Her presenterer vi to metoder for isolering av BMSCs og HSCs fra musen lange ben: en metode som gir en blandet befolkning av BMSCs og HSCs og en metode som forsøker å skille to celle populasjoner basert på overholdelse. Begge metodene gir cellene egnet for osteogenic og adipogenic differensiering eksperimenter så vel som funksjonell analyser.
Primære murine BMSCs brukes ofte som en i vitro modell av mesenchymal stamceller siden sin oppdagelse i tidlig 1980-tallet1. Faktisk opprettholde kulturer av plast-tilhenger celler tømmes fra benmargen hulrommet av lange ben kapasitet til å differensieres til osteoblasts, osteoklast, chondrocytes eller adipocytter i mange studier2,3, 4 , 5. benmargen er imidlertid en unik vev består av mange ulike celle populasjoner inkludert, men ikke begrenset til, BMSCs, HSCs, endothelial, og immunsystemet cellene. Dermed kan isolasjon og kultur teknikker gi celle populasjoner med forskjellige homogenitet. Bruk av teknikker for å teste differensiering potensielle fra celler kan være utfordrende. For eksempel når du sammenligner cellene fra mus med ulike genotyper, starter med en mikset-celle befolkningen begrenser tolkningen av dataene. Derimot å oppnå homogene bestander av BMSCs og HSCs kan være teknisk vanskelig og ikke som representant for en ex vivo -modell.
I vårt laboratorium er vi primært interessert i bruken av BMSCs på grunn av deres potensial til differensieres i osteoblasts, osteoklast og adipocytter. Her presenterer vi teknikker for BMSCs og HSCs isolasjon og kultur brukes til å vurdere osteoblastogenesis eller adipogenesis i vitroog kulturer av HSCs til å skille ut osteoklast. En metode bruker en blandet befolkning beinmargen celleområde (BMCs) som inneholder BMSCs og HSCs egnet for adipogenesis, osteoblastogenesis og osteoclastogenesis (kalt Total BMCs). Denne metoden er en nærmere ex vivo representasjon av heterogenitet som er funnet blant cellene i benmargen microenvironment. En annen metoden skiller tilhenger fra ikke-tilhenger celler å kultur “renere” bestander av BMSCs og HSCs (kalt tilhenger BMSCs). Den senere tillater cellekultur eksperimenter for å starte med et mer nøyaktig antall BMSCs eller HSCs og reduserer muligheten av komplekse indirekte effekter av andre celle populasjoner som forblir i kulturen. Begge metodene har vært tidligere publisert og brukes til å håndtere forskjellige forskning spørsmål6,7,8,9.
I denne artikkelen presenteres to metoder av kulturen i BMSCs med sine fordeler og begrensninger. Isolere celler fra benmargen er en relativt enkel prosess. Imidlertid kan skaffe en celle befolkningen representant av mesenchymal stamceller eller osteoclastic progenitors være utfordrende på grunn av ulike mobilnettet miljø av benmarg hulrom.
Dyrking helheten av benmarg innholdet gir en forhåndsvisning av den i vivo microenvironment. Likevel, isolere celler fra ulike grupper av mus …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).
200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
1.5mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
15mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
50mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
Dissection tools | |||
70μm filters | BD Falcon | 352350 | |
0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
MEMα | Gibco | 12571 | |
Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
RANKL | Peprotech | 310-01 | |
mCSF | Peprotech | 315-02 | |
Axio Observer inverter microscope | Zeiss |