Summary

Isolement, Culture et différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse et les ostéoclastes progéniteurs de souris

Published: January 06, 2018
doi:

Summary

Dans cet article, nous présentons des méthodes pour isoler et de différencier les cellules stromales de la moelle osseuse et de cellules souches hématopoïétiques des os longs de souris. Deux protocoles différents sont présentés agronomiques différentes populations cellulaires appropriées pour l’expansion et la différenciation dans les ostéoblastes, les ostéoclastes et les adipocytes.

Abstract

Cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) constituent une population de cellules utilisée couramment comme une représentation de cellules souches mésenchymateuses in vitro. Ils résident dans la cavité de la moelle osseuse aux côtés de cellules souches hématopoïétiques (CSH), qui peut donner lieu à des globules rouges, progéniteurs immunitaires et les ostéoclastes. Ainsi, les extractions de populations de cellules des moelle osseuse des résultats dans un mélange très hétérogène de diverses populations de cellules, qui peuvent présenter des défis dans une conception expérimentale et confondre l’interprétation des données. Plusieurs d’isolement et des techniques de culture ont été développés dans les laboratoires afin d’obtenir des populations plus ou moins homogènes de BMSC et csh invitro. Nous présentons ici deux méthodes pour isoler BMSC et GPX des os longs souris : une méthode qui génère une population mixte de BMSC et csh et une méthode qui tente de séparer les populations de deux cellules basées sur le respect. Les deux méthodes offrent adapté aux cellules ostéogéniques et différenciation adipocytaire expérimente des essais ainsi que fonctionnels.

Introduction

BMSC murine primaires est utilisées comme modèle in vitro de cellules souches mésenchymateuses depuis leur découverte dans le début des années 19801. En effet, les cultures de cellules adhérentes plastique vidées de la cavité de la moelle osseuse des os longs maintiennent la capacité à être se différencient en ostéoblastes, les ostéoclastes, chondrocytes ou adipocytes dans nombreuses études2,3, 4 , 5. Toutefois, la moelle osseuse est un tissu unique composé de plusieurs différentes populations cellulaires y compris, mais non limité à, BMSC, CSH, les cellules endothéliales et immunitaires. Ainsi, d’isolement et des techniques de culture peuvent produire des populations de cellules avec différente homogénéité. En utilisant ces techniques pour tester la potentiel de différenciation des cellules peut être difficile. Par exemple, lorsque l’on compare les cellules des souris avec des génotypes différents, commençant par une population de cellules mixtes limite l’interprétation des données. À l’inverse, obtention des populations homogènes de BMSC et csh peut être techniquement difficile et ne peut pas être aussi représentatif d’un modèle ex vivo .

Dans notre laboratoire, nous nous intéressons principalement à l’utilisation du BMSC en raison de leur potentiel à être se différencient en ostéoblastes, les ostéoclastes et les adipocytes. Nous présentons ici les techniques d’isolement BMSC et GPX et de la culture utilisée pour évaluer l’osteoblastogenèse ou l’adipogenèse le in vitro, ainsi que des cultures de CSH se différencier en ostéoclastes. Une méthode utilise une population mixte de cellules de moelle osseuse (BMC) contenant BMSC et GPX directement adapté pour l’adipogenèse, osteoblastogenèse et osteoclastogenesis (appelé ca Total). Cette méthode est une représentation plus proche ex vivo de l’hétérogénéité trouvée parmi les cellules du microenvironnement de la moelle osseuse. Une autre méthode sépare adhérentes de cellules non adhérentes dans une tentative de culture plus « pur » des populations de BMSC et csh (appelé adhérent BMSC). La méthode plus tard autorise la culture cellulaire des expériences pour démarrer avec un nombre plus précis du BMSC ou GPX et réduit le potentiel des effets indirects complexes des autres populations de cellules qui restent dans la culture. Les deux méthodes ont été précédemment publiés et utilisés pour traiter différents recherche questions6,7,8,9.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité de l’urbanisme à l’Institut de recherche Centre médical du Maine et d’institutionnels animalier. 1. collection de Tubes de préparation Rendre les milieux de culture BMSC en complétant un milieu Minimum essentiel α (α MEM) avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de la pénicilline/streptomycine. Déposer 100 µL de milieux de culture BMSC en tubes de microcentrifuge de 1,5 mL. 3 OS corr…

Representative Results

Aperçu des Cultures cellulairesLes techniques de deux culture permettent l’évaluation de la différenciation sur une population mixte de BMC composé BMSC et csh (ca Total, Figure 1 a) ou d’une population de BMSC se sépare du CSH (BMSC Adherent, Figure 1 b). 48 h après que les cellules de la moelle sont isolés et plaqués (Figure 1), ils attachent au fond de la plaque de…

Discussion

Dans cet article, deux méthodes de culture de BMSC sont présentées avec leurs avantages et leurs limites. Isoler les cellules provenant de la moelle osseuse est un processus relativement sans effort. Cependant, il peut être difficile en raison de l’environnement cellulaire diverse de la cavité de moelle d’obtenir une population de cellules représentante des cellules souches mésenchymateuses ou progéniteurs ostéoclastiques.

Cultivant l’intégralité du contenu de la moelle osseus…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (R01 AR061164-01 a 1).

Materials

200μL pipet tips  Rainin 17014401
1.5mL centrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
15mL conical tube  VWR 89039-668
50mL conical tube VWR 89039-660
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Sigma-Aldrich 21-040-CM
Ethanol Fisher Science 04-355-451
Dissection tools
70μm filters BD Falcon 352350
0.25% trypsin Gibco 25200
Kimwipe VWR 82003-820
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
Alkaline Phosphatase kit Sigma-Aldrich 86R
Silver Nitrate Sigma-Aldrich S6506
Sodium Thiosulfate Sigma-Aldrich S7026
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764
10% Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
Whatman filter Grade 1 Sigma-Aldrich Z274852
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit Sigma-Aldrich 387A
Glutaraldehyde Electron 16220
MEMα Gibco 12571
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
β-glycerol phosphate Sigma-Aldrich G9891
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
DMEM High Glucose  Sigma-Aldrich D5796
Rosiglitazone Cayman Chemical 717410
Insulin Sigma-Aldrich I6634
IBMX Sigma-Aldrich I5879
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
RANKL Peprotech 310-01
mCSF Peprotech 315-02
Axio Observer inverter microscope Zeiss

References

  1. Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
  2. Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
  3. Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
  4. Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
  5. Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
  6. DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
  7. Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
  8. Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
  9. Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  10. Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
  11. Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
  12. Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?. Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).

Play Video

Cite This Article
Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice. J. Vis. Exp. (131), e56750, doi:10.3791/56750 (2018).

View Video