I denne artikel præsenterer vi metoder for at isolere og differentiere knoglemarv stromale celler og hæmatopoietisk stamceller fra mus lange knogler. To forskellige protokoller præsenteres højtydende forskellige cellepopulationer egnet til udvidelse og differentiering af osteoblaster, adipocytter og osteoklaster.
Knoglemarven stromale celler (BMSCs) udgør en celle population rutinemæssigt anvendes som en repræsentation af mesenkymale stamceller in vitro-. De bor i knoglemarven hulrum sammen med hæmatopoietisk stamceller (HSCs), som kan give anledning til røde blodlegemer, immun ophav og osteoklaster. Således ekstraktioner af cellepopulationer fra knoglemarven resultater i en meget heterogen blanding af forskellige cellepopulationer, der kan præsentere udfordringer i eksperimentelle design og forvirre data fortolkning. Flere isolation og kultur teknikker er blevet udviklet i laboratorier for at opnå mere eller mindre homogene befolkninger af BMSCs og HSCs invitro. Her præsenterer vi to metoder til isolering af BMSCs og HSCs fra mus lange knogler: en metode, der giver en blandet population af BMSCs og HSCs og en metode, der forsøger at adskille to cellepopulationer baseret på overholdelse. Begge metoder giver celler velegnet til osteogenic og adipogenic differentiering eksperimenter såvel som funktionelle assays.
Primære murine BMSCs er almindeligt anvendt som en in vitro- model af mesenkymale stamceller siden deres opdagelse i den tidlige 1980s1. Faktisk, kulturer af plast-tilhænger celler skyllet fra knoglemarven hulrummet af lange knogler opretholde kapacitet skal differentieres i osteoblaster, osteoklaster, chondrocytter eller adipocytter i mange studier2,3, 4 , 5. dog knoglemarven er en unik væv består af mange forskellige cellepopulationer, herunder, men ikke begrænset til, BMSCs, HSCs, endotel og immun celler. Således, isolation og kultur teknikker kan give cellepopulationer med forskellige homogenitet. Ved hjælp af disse teknikker til at teste den potentielle differentiering fra celler kan være udfordrende. For eksempel, når man sammenligner celler fra mus med forskellige genotyper, begyndende med en blandet celle population begrænser fortolkning af data. Omvendt, at opnå homogen populationer af BMSCs og HSCs kan være teknisk vanskeligt og måske ikke som repræsentant for en ex vivo -model.
I vores laboratorium er vi primært interesseret i udnyttelsen af BMSCs på grund af deres potentiale skal differentieres i osteoblaster og osteoklaster adipocytter. Vi præsenterer her, teknikker til BMSCs og HSCs isolation og kultur bruges til at vurdere osteoblastogenesis eller adipogenesis i vitroog kulturer af HSCs til at differentiere i osteoklaster. Én metode bruger en blandet population af knoglemarv celler (BMCs) der indeholder BMSCs og HSCs direkte egnet til adipogenesis, osteoblastogenesis og osteoclastogenesis (kaldet samlede BMCs). Denne metode er en tættere ex vivo repræsentation af heterogenitet fundet blandt cellerne i knoglemarven mikromiljø. En anden metode adskiller tilhænger fra ikke-tilhænger celler i et forsøg på at kultur “renere” populationer af BMSCs og HSCs (kaldet tilhænger BMSCs). Den senere metode tillader cellekultur eksperimenter for at starte med en mere præcis antal BMSCs eller HSCs og reducerer potentiale af komplekse indirekte virkninger af andre cellepopulationer, der forbliver i kulturen. Begge metoder har været tidligere offentliggjort og bruges til at løse forskellige forskning spørgsmål6,7,8,9.
I denne artikel præsenteres to metoder til kultur af BMSCs med deres fordele og begrænsninger. Isolere cellerne fra knoglemarven er en relativt ubesværet proces. Men, at opnå en celle population repræsentative mesenkymale stamceller eller osteoclastic ophav kan være udfordrende på grund af de forskellige cellulære miljø i marv hulrum.
Dyrkning helhed af knoglemarven indholdet giver en tæt repræsentation af i vivo mikromiljø. Alligevel isolerer celler fra forskellige gruppe…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).
200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
1.5mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
15mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
50mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
Dissection tools | |||
70μm filters | BD Falcon | 352350 | |
0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
MEMα | Gibco | 12571 | |
Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
RANKL | Peprotech | 310-01 | |
mCSF | Peprotech | 315-02 | |
Axio Observer inverter microscope | Zeiss |