Summary
In questo articolo, presentiamo metodi per isolare e differenziare cellule stromali del midollo osseo e cellule staminali ematopoietiche da ossa lunghe del mouse. Due differenti protocolli sono presentati ottenendo diverse popolazioni cellulari adatte per espansione e differenziazione in osteoblasti, adipociti e gli osteoclasti.
Abstract
Cellule stromali del midollo osseo (BMSC) costituiscono una popolazione di cellule ordinariamente utilizzata come rappresentazione delle cellule staminali mesenchimali in vitro. Essi risiedono all'interno della cavità del midollo osseo al fianco di cellule staminali ematopoietiche (HSCs), che possono dare origine a globuli rossi, dei progenitori immuni e gli osteoclasti. Così, le estrazioni delle popolazioni delle cellule dai risultati del midollo osseo in un mix eterogeneo di varie popolazioni di cellule, che possono presentare sfide nel disegno sperimentale e confondere l'interpretazione dei dati. Diversi di isolamento e tecniche di coltura sono state sviluppate nei laboratori al fine di ottenere popolazioni più o meno omogenee di BMSC e HSCs invitro. Qui, presentiamo due metodi per l'isolamento di BMSC e HSCs da ossa lunghe del mouse: un metodo che produce una popolazione mista di BMSC e HSCs e un metodo che tenta di separare le due popolazioni di cellule basato su aderenza. Entrambi i metodi forniscono adatto per le cellule osteogeniche e adipogenico differenziazione esperimenti saggi anche come funzionali.
Introduction
BMSCs murino primario sono comunemente usati come modello in vitro di cellule staminali mesenchimali fin dalla loro scoperta nel primi anni 19801. Infatti, colture di cellule di plastica-aderente svuotate dalla cavità del midollo osseo delle ossa lunghe mantengono la capacità di differenziarsi in osteoblasti, osteoclasti, condrociti o adipociti in molti studi2,3, 4 , 5. Tuttavia, il midollo osseo è un tessuto unico composto di molte popolazioni differenti delle cellule, tra cui, ma non limitato a, BMSC, HSCs, cellule endoteliali ed immuni. Così, isolamento e tecniche di coltura possono portare a popolazioni di cellule con diverse omogeneità. Utilizzando tali tecniche per testare il potenziale di differenziazione dalle cellule può essere impegnativo. Ad esempio, quando si confrontano le cellule dai topi con genotipi differenti, a partire con una popolazione di cellule miste limita l'interpretazione dei dati. Al contrario, ottenere popolazioni omogenee di BMSC e HSCs può essere tecnicamente difficile e potrebbe non essere più rappresentativo di un modello ex vivo .
Nel nostro laboratorio, siamo principalmente interessati nell'utilizzazione di BMSCs a causa del loro potenziale di differenziarsi in osteoblasti, osteoclasti e adipociti. Qui, presentiamo tecniche di isolamento BMSCs e HSCs e impostazioni cultura utilizzate per valutare osteoblastogenesis o adipogenesis in vitro, così come le culture di HSCs per differenziarsi in osteoclasti. Un metodo utilizza una popolazione mista di cellule del midollo osseo (BMC) contenente BMSCs e HSCs direttamente adatto per adipogenesis, osteoblastogenesis e osteoclastogenesis (chiamato BMCs totale). Questo metodo è una rappresentazione più vicina ex vivo dell'eterogeneità tra le cellule del microambiente midollare. Un altro metodo separa aderente da cellule non aderenti nel tentativo di popolazioni "pure" coltura di BMSC e HSC (chiamato aderente BMSCs). Il metodo successivo consente la coltura delle cellule esperimenti per iniziare con un numero più preciso di BMSCs o HSCs e riduce il potenziale di effetti complessi indiretti di altre popolazioni di cellule che rimangono nella cultura. Entrambi i metodi sono stati precedentemente pubblicati e utilizzati per indirizzo ricerca diverse domande6,7,8,9.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato di utilizzo presso il Maine Medical Center Research Institute e istituzionali Animal Care.
1. la raccolta di tubi preparazione
- Rendere i terreni di coltura BMSC completando α Medium essenziale minimo (MEM α) con 10% siero bovino fetale e l'1% di penicillina/streptomicina.
- Posto 100 µ l di terreno di coltura BMSC in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. 3 ossa solitamente si adattano in una singola provetta così prepararsi di conseguenza.
- Tagliare le estremità di 200 µ l puntali per abbastanza così che si inseriscono le provette da centrifuga. Inserire le punte all'interno dei tubi e accertarsi che i coperchi possono chiudere prima di posizionare i tubi sul ghiaccio.
Nota: In alternativa, microcentrifuga 0,75 mL con il taglio di estremità può essere inserito nel tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.
2. raccolta delle ossa da topi
- Eutanasia degli animali usando CO2 seguita da dislocazione cervicale e spruzzateli con etanolo al 70%.
Nota: Assicurarsi che gli animali da stesso sesso e, preferibilmente, della stessa età sono usati. Utilizziamo abitualmente animali di età 7-8 settimane. Si consiglia di pool di cellule da almeno 3 animali per gruppi sperimentali per produrre una popolazione di cellule rappresentative e riproducibile migliore. -
Posizionare il mouse eutanasizzato sulla sua schiena su una tavola di dissezione. Utilizzare pinze per creare una tenda di pelle sull'addome. Praticare una piccola incisione (1 cm circa) utilizzando forbici per dissezione sterili. Stacchi la pelle verso gli arti e i piedi dal taglio al fine di esporre la parte inferiore dell'addome e le gambe.
- Tagliare sotto la caviglia giunto a rimuovere il piede. Tagliare lungo la cresta iliaca dell'anca per separare la testa del femore dalla pelvi. Mentre il mouse è ancora sulla sua schiena, fare un'incisione al centro la pelvi per separare le due ossa iliache.
- Utilizzando salviette privo di lanugine, rimuovere con cautela il muscolo da femori, delle tibie e ossa iliache.
Nota: Il taglio tanto di tendini e muscolo dall'osso come possibile rende la pulizia più veloce e più facile con le salviettine pelucchi (ad es., kimwipes). Prestare attenzione quando si manipolano le ossa come essi tendono a rompersi facilmente e la loro fragilità può essere aumentato con determinati genotipi. - Una volta che tutti i campioni sono stati sezionati, metterli in PBS su ghiaccio e spostare in una cappa di coltura sterile per i passaggi rimanenti di isolamento.
Nota: Lavorando in modo asettico per quanto possibile ridurrà il potenziale di contaminazione nelle culture. - Fare piccoli tagli (circa 1-2 mm) a entrambe le estremità prossimale e distale delle ossa prima della loro immissione nelle punte sezionate all'interno dei tubi di centrifuga.
Nota: Assicurarsi di tagliare una quantità sufficiente in modo che midollo possa essere centrifugato fuori; Tuttavia, si deve prestare attenzione per evitare di tagliare troppo, come le popolazioni delle cellule tendono a variare basata sulla vicinanza all'interno dello spazio del midollo. - Centrifuga a 10.000 x g per 15 s a temperatura ambiente. Assicurarsi che il midollo è svuotato e pellettato nella parte inferiore del tubo da 1,5 mL, mentre le ossa sono all'interno degli inserti (entrambi 200 µ l dispensare suggerimento o 0,75 mL tubo del microcentrifuge). Una volta raccolti tutti il midollo, rimuovere gli inserti con le ossa dai tubi di raccolta.
Nota: Se il midollo viene svuotato, le ossa apparirà bianche. Tuttavia, se midollo rimane in determinate ossa, riprovare le estremità di taglio e centrifugare.
3. sospensione cellulare
- Utilizzando un ago 25 G, tirare la cella pellet su e giù lentamente per spezzare ciuffi e combinare tutti i campioni in un tubo conico di soli 15ml. Aggiungere 10 mL di terreno di coltura di BMSC su 500 µ l di campioni.
- Inserire un filtro di 70 µm sulla cima di una provetta conica da 50 mL e passare la sospensione cellulare attraverso questo filtro per rimuovere i frammenti di osso possibile.
4. placcatura e la cultura di popolazioni miste di cellule del midollo osseo (Totale BMCs)
Nota: Le cellule sono coltivate a 37 ° C in un incubatore con 5% CO2.
- Calcolare il numero di cellule e impiattatelo a 1,0 x 106 cellule/cm2 in terreni di coltura. Consentire 72h di coltura mista per le celle da collegare.
Nota: Si consiglia di diluire il 20x di sospensione cellulare in terreni di coltura e diluire nuovamente in trypan blu prima di contare le celle utilizzando un emocitometro. Per topi C57Bl6/J maschi 7-settimana-vecchio, cediamo ordinariamente un numero di cellulare di circa 50 x 106 cellule ma età, sesso e ceppo può influire cella numero notevolmente.
Nota: Una popolazione di miscela delle cellule dovrebbe allegare bene nella parte inferiore della cultura. - Dopo 72 h, rimuovere il supporto e sostituirlo con mezzi freschi. Proseguire cambiando i media ogni altro giorno e cerca confluency. Quando le cellule raggiungono confluency di 80-100%, sono pronti per la differenziazione.
Nota: Perché questa cultura si mescola con BMSCs sia HSCs, può essere direttamente utilizzato per osteoblastogenesis, adipogenesis come pure osteoclastogenesi.
5. placcatura e la cultura della popolazione Split di BMSCs (aderente BMSCs)
Nota: Le cellule sono coltivate a 37 ° C in un incubatore con 5% CO2.
- Piastra di tutte le celle raccolte dai femori, delle tibie e ossa iliache di un topo in una piastra di coltura di 10 cm (55 cm2 di zona della coltura).
Nota: Quando il pool 2-3 i topi C57BL/6J, abbiamo in genere piastra questa popolazione 'totale' del midollo osseo in un pallone da2 di 150 cm. - Dopo 48 h di coltura mista, rimuovere il supporto di cultura (contenente le HSCs non aderente). Se osteoclastogenesi esperimenti devono essere eseguiti, impostare questa popolazione di cellule non aderenti a parte (Vedi sezione 7), in caso contrario, aspirare e scartare queste cellule.
- Lavare la piastra/boccetta con PBS con attenzione per non disturbare le cellule allegate.
- Rimuovere PBS e sollevare le cellule aggiungendo 0.25% tripsina e incubare a 37 ° C per un minimo di 1-3 estigue la tripsina aggiungendo cell supporti per la sospensione delle cellule. A questo punto, BMSC, che ora vengono sollevati, che può essere contato (come precedentemente fatto nel punto 4.1) e placcato per futuri esperimenti.
- Calcolare il numero di cellule necessarie per la placcatura. Centrifugare il volume richiesto di sospensione cellulare a 1.000 x g per 5 min a temperatura ambiente.
Nota: Le cellule sono placcate tipicamente basato su esperimenti di end-point. Ad esempio, se proteina/RNA deve essere isolato abbiamo piastra in genere a una maggiore densità (~1.0-2.0 x 106 cellule/pozzetto in piastre da 6). - Rimuovere il supporto e risospendere il pellet cellulare del volume di media cultura necessaria per la placcatura. Le cellule in coltura secondo gli esperimenti del piatto e consentire loro di fissare per un paio di giorni. Quando le BMSC raggiunge la confluenza, procedere per eseguire la differenziazione.
6. differenziazione delle BMSCs
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Osteoblasti
- Fai media differenziazione degli osteoblasti aggiungendo 800 µ l di 1 M β-glicerolo fosfato in PBS e 200 µ l di acido ascorbico 0,5 M in PBS a 99 mL di terreno di coltura BMSC (Vedi punto 1.1 per la composizione dei terreni di coltura BMSC).
- Una volta confluenti BMSCs culture (Totale BMCs dal punto 4.3) o aderente BMSCs dal punto 5.6, li differenziano in osteoblasti commutando i terreni di coltura ai media di differenziazione degli osteoblasti.
- Sostituire il supporto di differenziazione ogni altro giorno. Le cellule iniziano a produrre noduli bianchi di mineralizzazione. Visualizzarli con l'occhio nudo sul fondo del pozzo; Questo processo può verificarsi entro pochi giorni a 3 settimane.
- Al fine di valutare osteoblastogenesis, eseguire colorazione della fosfatasi alcalina e/o Von Kossa colorazione sui pozzi come descritto nella sezione 8.
Nota: Cambiare il supporto attentamente inclinando le piastre con una leggera angolazione per evitare turbative di strato monomolecolare della cellula.
- Al fine di valutare osteoblastogenesis, eseguire colorazione della fosfatasi alcalina e/o Von Kossa colorazione sui pozzi come descritto nella sezione 8.
- Fai media differenziazione degli osteoblasti aggiungendo 800 µ l di 1 M β-glicerolo fosfato in PBS e 200 µ l di acido ascorbico 0,5 M in PBS a 99 mL di terreno di coltura BMSC (Vedi punto 1.1 per la composizione dei terreni di coltura BMSC).
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Adipociti
- Fai del adipocyte base media mescolando insieme 90 mL di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) alto glucosio, 10 mL di siero fetale bovino, 1 mL di penicillina/streptomicina, 100 µ l 20 mM Rosiglitazone e 100 µ l di 2 mM dell'insulina. Se necessario, è possibile memorizzare questo media a 4 ° C per tutta la settimana durante l'esperimento di differenziazione.
- Fanno del adipocyte induzione media con l'aggiunta di 200 µ l di 62,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) e 25 µ l di 1 mM desametasone a 25 mL di Adipocyte Base Media.
- Una volta confluenti BMSCs culture (Totale BMCs dal punto 4.3) o aderente BMSCs dal punto 5.6, cambiare il supporto ai media di induzione del adipocyte. Considera questo giorno 0 di differenziazione.
- Dopo 48 h, è necessario rimuovere il supporto e aggiornare la cultura con i media di induzione del adipocyte.
- Il giorno 4, passare alla media base degli adipociti.
Nota: Le goccioline del lipido possono iniziano ad apparire più presto giorno 2 o 4 giorni. - Il giorno 7, osservare che le cellule hanno accumulato le goccioline del lipido massimo e visualizzano un fenotipo simile a un adipocita maturo. Cultura non oltre questo punto, che possono causare morte cellulare/distacco.
7. differenziazione di HSCs in osteoclasti
- Rendere Media differenziazione degli osteoclasti aggiungendo 50 µ l di 25 µ g/mL di recettore attivatore di NFKB Ligand (RANKL) e 15 µ l di 25 µ g/mL di macrophage Colony Stimulating Factor (mCSF) a 25 mL di terreno di coltura di BMSC.
- Una volta che il BMC totale (dal punto 4.3) o le cellule non-aderenti (dal punto 5.2) sono attaccate al pozzo, terreni di coltura può essere commutato a Media differenziazione degli osteoclasti. Ricostituire la media di differenziazione ogni altro giorno.
- Osservare le culture degli osteoclasti ogni giorno con un microscopio a ingrandimento 10x. Osservare che gli osteoclasti fondono e formano cellule multinucleate, tipicamente intorno a 5-7 ° giorno di differenziazione.
8. colorazione
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Osteoblasti
Nota: Per la colorazione della fosfatasi alcalina (AP), abbiamo spesso utilizzare una macchiatura AP kit (Vedi Tabella materiali) secondo le linee guida.- Eseguire AP macchiatura seguendo le linee guida del produttore di kit.
- Media di aspirare e lavare le cellule con PBS. Fissare le cellule con 4% paraformaldeide (PFA) in PBS per 12 min a temperatura ambiente.
- Nel frattempo, rendono la soluzione AP utilizzando i reagenti da AP kit di colorazione aggiungendo 500 µ l nitrito di sodio in 500 µ l di soluzione alcalina FRV e mescolando delicatamente; Lasciate riposare per 2 min. aggiungere 22,5 mL dH2O e 500 µ l naftolo AS-BI alcalina. Mescolare delicatamente.
Attenzione: PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura. - Una volta che le cellule sono fissi, risciacquare con PBS e aggiungere soluzione AP ad ogni pozzetto (1-2 mL per pozzetto). Coprire con foglio di alluminio e lasciate che la macchia per 30 min a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Aspirare la soluzione, lavare con acqua distillata e fate asciugare la piastra.
- Acquisire immagini delle colonie macchiati usando una macchina fotografica al fine di osservare le cellule positive della fosfatasi alcalina.
- In alternativa è possibile eseguire Von Kossa invece di macchiatura della fosfatasi alcalina. Per questo, pozzi di lavare accuratamente con acqua distillata come qualsiasi restante PBS precipiterà con nitrato d'argento.
- Fissare le cellule con 4% PFA in PBS per 12 min a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere la soluzione di nitrato d'argento abbastanza 5% per coprire il pozzo ed esporre alla luce forte per 1 h a temperatura ambiente.
- Rimuovere la soluzione di nitrato d'argento e sciacquare ogni pozzetto con acqua distillata. Aggiungere la soluzione di tiosolfato di sodio 5% alle cellule e lasciate riposare per 3 minuti.
- Il tiosolfato di sodio di aspirare e lavare con acqua distillata. Lasciate la piastra asciugare e osservare il deposito minerale colorato in marrone scuro/nero con occhio nudo.
- Eseguire AP macchiatura seguendo le linee guida del produttore di kit.
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Adipociti
- Per la colorazione di olio rosso O (ORO), fissare le cellule con 10% neutra tamponata formalina per 1 h a temperatura ambiente.
- Nel frattempo, rendono la soluzione di Stock di ORO sciogliendo 0,035 g in 10 mL di isopropanolo. Questo è sufficiente per una piastra a 6 pozzetti. Mescolare e filtrare la soluzione utilizzando un filtro di carta (poro taglia 11 µm).
- Rendere la soluzione di lavoro di ORO diluendo 9 mL di soluzione di riserva di ORO con 6 mL di acqua distillata. Lasciare la soluzione su un agitatore meccanico fino a che pronto per l'uso.
- Preparare 60% isopropanolo in acqua distillata (fare abbastanza per coprire ogni bene).
- Una volta che le cellule sono fissi, rimuovere una volta fissativa e lavare con acqua distillata. Sostituire l'acqua con la soluzione di isopropanolo 60% per 1 min.
Nota: Aggiungere il liquido lentamente mentre le mance la piastra; adipociti sloggiare molto facilmente. - Rimuovere l'isopropanolo e aggiungere la soluzione di lavoro abbastanza ORO per coprire tutte le celle. Incubare per 15 minuti su un rocker di bassa velocità a temperatura ambiente. ORO di rimuovere e lavare due volte con acqua distillata.
Nota: A questo punto, le goccioline del lipido tinto ORO possono essere visualizzate sotto il microscopio. - Per quantificare i ORO, decolorare l'ORO aggiungendo 1 mL di isopropanolo 100% ad ogni pozzetto e da dondolo lentamente per 10 min.
- Nel frattempo, preparare una serie di diluizioni per creare una curva standard basata sui seguenti 8 standard utilizzando la soluzione di lavoro di ORO (2.100 µ g/mL) e isopropanolo come diluente: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 e 0 µ g/mL.
- Caricare 200 µ l di standard e i campioni destained in triplici copie su un piatto e leggere l'assorbanza a 490 nm.
- Determinare la concentrazione di ORO per ogni campione basato sulla curva standard.
Nota: Si consiglia di normalizzare la concentrazione di ORO al numero di cellulare. Numero di cellulare può essere quantificato di cristalvioletto macchiatura o quantità del DNA.
- Determinare la concentrazione di ORO per ogni campione basato sulla curva standard.
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Osteoclasti
Nota: Quando si è pronti, si consiglia di macchiatura osteoclasti per tartrato-resistente acido fosfatasi (trappola) usando la macchiatura trappola kit (Vedi Tabella materiali).- Per trappola macchiatura, Difficoltà cellule per 30 min a temperatura ambiente con 2,5% glutaraldeide in PBS. Nel frattempo, fare la soluzione di trappola mescolando insieme 50 µ l di soluzione di Base Fast granati, 50 µ l di nitrito di sodio, 4,55 mL di acqua distillata, 50 µ l di Napthol AS-Biphosphate, 200 µ l di soluzione di acetato e 100 µ l di soluzione di tartrato.
- Aspirate fuori fissativo e sciacquare le cellule con PBS due volte prima di aggiungere la soluzione di trappola per 1h a 37 ° C.
- Lavare con acqua distillata prima di contare gli osteoclasti al microscopio (ingrandimento 10x). Le cellule di trappola+ compaiono viola con 3 o più nuclei.
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Representative Results
Panoramica delle colture cellulari
Le tecniche di due cultura permettono la valutazione di differenziazione su una popolazione mista di BMCs composto da BMSC e HSC (BMCs totale, Figura 1A) o di una popolazione di BMSCs diviso da HSC (BMSCs aderente, Figura 1B). 48 ore dopo che le cellule dal midollo sono isolate e placcato (Figura 1), essi rapidamente fissare alla parte inferiore della piastra cultura plastica e tendono a formare un monostrato. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza (Figura 1), sono utilizzabili per le analisi di differenziazione.
BMSCs differenziate in osteoblasti
Confluenti culture di BMSCs possono essere differenziate in osteoblasti utilizzando un media osteogenica composto di acido ascorbico e β-glicerolo fosfato (Figura 2A, B). Dopo pochi giorni di differenziazione, osteoblasti iniziano esprimendo la fosfatasi alcalina (Figura 2). Ulteriore differenziazione attiverà produzione di matrice osteoide e in definitiva la mineralizzazione di questa matrice (Figura 2D). È interessante notare che, solo una parte delle cellule sarà differenziarsi in osteoblasti in vitro. Infatti, colorazione con cristalvioletto (Figura 2E) rivela che non tutte le cellule express della fosfatasi alcalina o mineralizzano la piastra.
BMSCs differenziate in adipociti
Adipogenesis può essere testato su colture di BMCs misto nonché sulla popolazione cellulare più omogenea. Come osservato con differenziazione degli osteoblasti, se vengono utilizzate le popolazioni miste (Figura 3A) o le popolazioni di Spalato (Figura 3B), solo una parte delle cellule sono adipogenic. Adipociti appaiono rotondi con vacuoli lipidici multipli che possono essere colorati in rosso con ORO (Figura 3). Nella nostra esperienza, in vitro adipociti sempre appaiono multi-vacuolati a differenza di in vivo bianco adipocytes. Differenze nelle condizioni di genotipo o cultura potrebbero aumentare adipogenesis in un punto dove adipocytes staccare e galleggiare nella piastra di coltura. Per risolvere questo problema, l'esperimento di adipogenesis può essere interrotto in un punto di tempo precedente.
HSC differenziate in osteoclasti
Osteoclastogenesis può essere indotta nelle culture completando i media con mCSF e RANKL. HSC iniziano a fondere rapidamente per formare cellule multinucleated che macchia positive per trappola (Figura 4A). Gli osteoclasti sono capaci di resorbing matrice minerale in vitro e pertanto possono essere utilizzati per valutare l'attività osteoclastica (Figura 4B).
Figura 1: Schematica timeline dei protocolli per la coltura di BMSC e HSCs. Tecniche di coltura differenti per produrre BMCs totale è composto da una popolazione mista di cellule (A) o aderente BMSCs (B). Immagine rappresentativa della cultura BMSCs isolata da topi C57B6/J 48 ore dopo la loro placcatura (C) e dopo sono divisi da HSC (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Immagini dei pozzi delle culture BMSCs differenziano in osteoblasti. BMSC prima (A) e dopo (B) essere immessi nei media osteogenico. Osteoblasti possono essere tinto per espressione di fosfatasi alcalina in rosa (C) e per deposito di minerali in marrone (D). Viola di cristallo può essere utilizzato per rappresentare il numero delle cellule dopo la differenziazione (E). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immagini rappresentative delle culture di BMSCs differenziano nei adipocytes. ORO-macchiato adipociti ottenuti da una popolazione mista di BMSCs (A) e di una cultura di Spalato (B) dopo 7 giorni adipogenico media. Immagine di un adipocita macchiato con ORO (C). Quantificazione dell'ORO dopo 7 giorni in media adipogenico prima (D) e dopo (E) normalizzazione al cristalvioletto assorbanza. I dati vengono presentati come mezzi con barre di errore rappresenta l'errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: HSCs culture differenziano in osteoclasti. TRAPPOLA di colorazione degli osteoclasti che appaiono come grandi rosa-porpora multinucleated le cellule (A). Superficie mineralizzata tinto in nero di Von Kossa con riassorbimento fosse lasciato dagli osteoclasti differenziati da HSCs dopo 7 giorni (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo articolo, sono disponibili due metodi di coltura di BMSC con i loro vantaggi e limitazioni. Isolamento di cellule provenienti dal midollo osseo è un processo relativamente semplice. Tuttavia, ottenere una popolazione di cellule rappresentativa della cellule staminali mesenchimali o progenitori osteoclastic può essere difficile a causa di vario ambiente cellulare della cavità del midollo.
La totalità del contenuto del midollo osseo la coltura fornisce una rappresentazione stretta del microambiente in vivo . Ancora, isolando le cellule da diversi gruppi di topi (genotipi, trattamenti, età, ecc.) può comportare un numero molto differente di BMSCs o HSCs all'inizio dell'esperimento in vitro . Di conseguenza, separando BMSCs e HSCs e ri-placcatura li permettono un migliore controllo sopra il numero di cellulare all'inizio dell'esperimento differenziazione. Tuttavia, ridurre l'eterogeneità della coltura delle cellule potrebbe influenzare i risultati delle BMSCs o HSCs come entrambi secernono fattori che influenzano la differenziazione mesenchymal e osteoclastica. È importante considerare tali limitazioni quando si progetta l'isolamento e la cultura delle BMSCs e HSC.
La moltitudine di popolazioni di cellule presenti nel midollo osseo può comportare alcune difficoltà nell'interpretazione dei dati. Oltre a HSCs e BMSCs, microambiente midollare contiene anche cellule immunitarie differenziate, globuli rossi, cellule endotelialiecc. Quelle popolazioni potrebbero rimanere nella frazione aderente o non aderenti e così possono influenzare i risultati sperimentali. L'ordinamento BMSCs può essere un'opzione al fine di ottenere una popolazione cellulare "pura". Infatti, BMSC sono pensati per esprimere CD34 mentre HSCs fare non10. Tuttavia, è stato anche suggerito che la mancanza di CD34 sulla superficie delle BMSCs può essere il risultato della cultura e uno studio ha dimostrato che un sottoinsieme non aderente di CD34+ BMSCs potrebbe differenziarsi in osteoblasti, adipociti e condrociti11, 12. quindi, se si considera l'ordinamento per isolare BMSCs, una matrice degli indicatori ben definiti dovrebbe essere progettata in anticipo. Altri ostacoli all'ordinamento delle cellule sono tempi e costi. Infatti, l'aggiunta di un passaggio di ordinamento potrebbe aumentare il tempo dell'isolamento protocollo notevolmente così come un significativo aumento dei costi. In sintesi, cellule di ordinamento presentano sfide tecniche che possono ridurre la resa e la qualità di BMSCs.
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Disclosures
Gli autori divulgare che non hanno nessuna finanziaria conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (R01 AR061164-01A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70 μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
References
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