Summary
В этой статье мы представляем методы изоляции и дифференцировать стромальных клеток костного мозга и стволовых гемопоэтических клеток от мыши длинных костей. Две различные протоколы представлены приносит различных клеточных популяций, пригодных для расширения и дифференцировку в остеобластов, адипоциты и остеокласты.
Abstract
Клетки стромы костного мозга (BMSCs) являются популяции клеток, обычно используется как представление мезенхимальных стволовых клеток в пробирке. Они находятся внутри полости костного наряду с гемопоэтических стволовых клеток (СКК), которые могут породить красные кровяные клетки, иммунных прародителями и остеокласты. Таким образом экстракции популяции клеток из костного мозга результатов в весьма разнородный набор различных клеточных популяций, которые могут представлять вызовы в экспериментальный дизайн и смешаем интерпретации данных. Несколько изоляции и культуры методы были разработаны в лабораториях для того чтобы получить более или менее однородной популяции BMSCs и СКК Инвитро. Здесь мы представляем два метода для изоляции BMSCs и СКК от мыши длинных костей: один метод, который дает смешанное население BMSCs и СКК и один метод, который пытается разделить два клеточных популяций на основе соблюдения. Оба метода предоставляют клетки для Остеогенные и адипогенном дифференциация экспериментов, а также функциональные анализы.
Introduction
Основная мышиных BMSCs обычно используются как модель в vitro мезенхимальных стволовых клеток с момента их открытия в начале 1980-х1. Действительно культуры клеток пластик сторонник, покраснел от полости костного длинных костей поддерживать способность быть продифференцированным в остеобластов, остеокласты, хрящевые клетки или адипоцитов многих исследований в2,3, 4 , 5. Однако, костного мозга является уникальная ткань состоит из многих различных клеточных популяций, включая, но не ограничиваясь, BMSCs, СКК, эндотелия и иммунные клетки. Таким образом изоляции и культуры методы могут принести клеточных популяций с различными однородности. Использование таких методов для проверки потенциальных дифференциации от клеток может быть сложным. Например при сравнении клетки от мышей с различными генотипами, начиная с населением смешанного клеток ограничивает интерпретации данных. И наоборот, получение однородной популяции BMSCs и СКК может быть технически сложным и не может быть как представитель модели ex vivo .
В нашей лаборатории мы в первую очередь заинтересованы в использовании BMSCs из-за их потенциал быть продифференцированным остеобластов, остеокластов и адипоцитов. Здесь мы представляем методов изоляции BMSCs и СКК и культуры, используемые для оценки osteoblastogenesis или adipogenesis в vitro, а также культур СКК дифференцироваться в остеокластов. Один метод использует смешанное население клеток костного мозга (BMC), содержащие BMSCs и СКК непосредственно подходит для adipogenesis, osteoblastogenesis и osteoclastogenesis (так называемый общий BMC). Этот метод является ex vivo представление ближе гетерогенности среди клеток костного мозга микроокружения. Другой метод отделяет приверженца от non сторонник клеток в попытке «чище» населения культуры BMSCs и СКК (называемых приверженцев BMSCs). Более поздних метод позволяет культуры клеток экспериментов, чтобы начать с более точное количество BMSCs или СКК и уменьшает потенциал комплекса косвенные эффекты других клеточных популяций, которые остаются в культуре. Оба метода были ранее опубликованы и используется для решения различных исследовательских вопросов6,,78,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были утверждены институциональный уход животных и использование Комитета Мэн медицинский центр научно-исследовательском институте.
1. Коллекция трубок подготовка
- Сделать BMSC Культура СМИ, дополняющего минимум основных средних α (MEM α) с 10% плода Bovine сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина.
- Место 100 мкл BMSC культуры средств массовой информации в 1,5 мл пробирок microcentrifuge. 3 кости обычно помещается в одном однотрубные так подготовить соответствующим образом.
- Отрезать концы 200 мкл наконечники достаточно, таким образом, чтобы они вписываются в пробирок. Вставьте советы внутри трубы и убедитесь, что перед укладкой труб на льду можно закрыть крышками.
Примечание: в качестве альтернативы, 0,75 мл microcentrifuge трубы с Срезанные концы могут быть вставлены в пробки microcentrifuge 1,5 мл.
2. урожай костей от мышей
- Усыпить животных, с использованием CO2 следуют шейки матки вывихов и распылить их с 70% этиловом спирте.
Примечание: Убедитесь, что используются животные из того же пола и желательно того же возраста. Мы регулярно использовать животных в возрасте от 7 до 8 недель. Мы рекомендуем, объединение клетки от по крайней мере 3 животных в экспериментальной группы приносить лучше популяции представительным и воспроизводимые клеток. -
Место Усыпленных мышь на его обратно на доске рассечения. Используйте щипцы для создания палатке кожи на животе. Сделайте небольшой надрез (около 1 см) с использованием рассечения стерильными ножницами. Отогните кожи конечностей и ноги от отрезока чтобы разоблачить нижней части живота и ног.
- Вырежьте ниже лодыжки совместных чтобы удалить подножия. Разрезать вдоль подвздошный гребень на бедра, чтобы отделить головку бедренной кости от другой. В то время как указатель мыши находится все еще на его спине, сделайте надрез в середине другой для разделения двух подвздошных костей.
- С помощью безворсовой салфетки, осторожно удалите мышцы бедра, tibias и подвздошных костей.
Примечание: Резка столько сухожилий и мышц от кости как можно делает очистку быстрее и проще с безворсовой салфетки (например, kimwipes). Осторожность при обработке кости, как они, как правило, легко ломаются и их неустойчивость может быть увеличено с определенным генотипов. - После того, как все образцы были расчленены, поместите их в PBS на льду и перейти к стерильной культуры капот для оставшихся шагов изоляции.
Примечание: Работает асептически как можно больше будет уменьшить потенциал для загрязнения в культурах. - Сделать небольшие порезы (примерно 1-2 мм) на оба проксимальном и дистальном концы костей перед помещением их в секционного советы в пределах пробирок.
Примечание: Убедитесь в том, сократить в достаточном количестве, так что костного мозга может быть центрифугировали Однако, следует избегать резки слишком много, как популяции клеток, как правило, различаются на основе близости в пространстве костного мозга. - Центрифуга на 10000 x g 15 s при комнатной температуре. Убедитесь, что все костного мозга покраснел и гранулированных в нижней части трубки 1,5 мл, в то время как кости находятся внутри вставки (или 200 мкл накапайте отзыв или 0,75 мл microcentrifuge трубки). После сбора всех костного мозга, выньте заглушку с костями из коллекции трубок.
Примечание: Если очищены все костного мозга, костей появится белый. Однако если костного мозга остается в некоторых костей, попробуйте резки концы и центрифуги.
3. клетки подвеска
- С помощью иглы 25 G, тянуть ячейки гранул вверх и вниз медленно порвать пряди и объединить все образцы в одной 15 мл Конические трубки. Добавьте 10 мл BMSC средства массовой информации культуры на 500 мкл образцов.
- Место 70 мкм фильтром на вершине 50 мл Конические трубки и пройти суспензию клеток через этот фильтр, чтобы удалить возможные костных фрагментов.
4. обшивка и культуры смешанных популяций клеток костного мозга (всего BMC)
Примечание: При 37 ° C в инкубаторе с 5% CO2культивируемых клеток.
- Рассчитать количество клеток и их пластины на 1,0 x 106 клеток/см2 в культуре средств массовой информации. Позвольте 72 h смешанные культуры для клеток для присоединения.
Примечание: Мы рекомендуем, разбавляя клеток подвеска 20 x в культуре средств массовой информации и разбавления снова в Трипановый синий до подсчета клеток с использованием Горяева. Для 7-week-old мышей-самцов C57Bl6/J мы регулярно дают клеток, количество около 50 x 106 клеток, но возраст, пол и штамм может повлиять на количество клеток значительно.
Примечание: Смеси популяция клеток должны приложить в нижней части культуры также. - После 72 ч удалите средства массовой информации и замените свежим СМИ. Продолжить изменение средств массовой информации каждый день и проверить confluency. Когда клетки достигают 80-100% confluency, они готовы к дифференциации.
Примечание: Потому что эта культура смешивается с BMSCs и СКК, он может непосредственно использоваться для osteoblastogenesis, adipogenesis, а также osteoclastogenesis.
5. покрытие и культуры населения Сплит BMSCs (Адгезивная BMSCs)
Примечание: При 37 ° C в инкубаторе с 5% CO2культивируемых клеток.
- Пластина все клетки, собранных от бедра, tibias и подвздошной кости одной мыши в 10 см культуры блюдо (55 см2 зона культуры).
Примечание: При объединении мышей C57BL/6J 2-3, мы обычно пластины населения этот «всего» костный мозг в колбе2 150 см. - После 48 ч смешанные культуры удалите носитель культуры (содержащие non сторонник СКК). Если osteoclastogenesis эксперименты должны быть обработаны, установите это население не сторонник клетки в сторону (см. раздел 7), если не аспирата и отбросить эти клетки.
- Вымойте тарелка/колба с PBS тщательно, чтобы не беспокоить прилагаемый клетки.
- Удаление PBS и поднимите клетки путем добавления трипсин 0.25% и инкубации при 37 ° C 1-3 мин Quench трипсина, добавив ячейки СМИ суспензию клеток. На данный момент BMSCs, которые теперь отменены, могут быть подсчитаны (как ранее делается шаг 4.1) и покрытием для дальнейших экспериментов.
- Рассчитайте количество клеток, необходимых для покрытия. Центрифуга необходимый объем суспензии клеток на 1000 x g 5 мин при комнатной температуре.
Примечание: Клетки обычно покрыты на основе конечной точки экспериментов. Например если необходимо изолировать белка/РНК мы обычно пластины на более высокой плотности (~1.0-2.0 x 106 клеток/хорошо 6-ну пластины). - Удалите средства массовой информации и Ресуспензируйте Пелле клеток в объеме культуры средств массовой информации, необходимой для покрытия. Пластина клетки в культуре средств массовой информации по данным экспериментов и дать им возможность прикрепить на несколько дней. Когда BMSCs confluency, перейдите к выполнить дифференциации.
6. дифференциация BMSCs
-
Остеобласты
- Сделать остеобластов дифференциация СМИ, добавляя 800 мкл 1 M β-глицерин фосфата в PBS и 200 мкл 0,5 М аскорбиновой кислоты в PBS до 99 мл BMSC культуры средств массовой информации (см. шаг 1.1 состав носителей BMSC культуры).
- После того, как BMSCs культур (всего BMC от шаг 4.3) или сторонник BMSCs из шага 5.6 вырожденная, различать их в остеобластов путем переключения СМИ культуры остеобластов дифференциация средствам массовой информации.
- Замените дифференциация средств массовой информации каждый день. Клетки начинают производить белые конкреций минерализации. Визуализировать их с нагим глазом в нижней части скважины; Этот процесс может происходить в течение нескольких дней до 3 недель.
- Для того чтобы оценить osteoblastogenesis, выполняют окрашивание щелочной фосфатазы и/или фон Kossa окрашивания на колодцы, как описано в разделе 8.
Примечание: Измените СМИ тщательно, наклоняя пластины под небольшим углом во избежание срыва монослоя клеток.
- Для того чтобы оценить osteoblastogenesis, выполняют окрашивание щелочной фосфатазы и/или фон Kossa окрашивания на колодцы, как описано в разделе 8.
- Сделать остеобластов дифференциация СМИ, добавляя 800 мкл 1 M β-глицерин фосфата в PBS и 200 мкл 0,5 М аскорбиновой кислоты в PBS до 99 мл BMSC культуры средств массовой информации (см. шаг 1.1 состав носителей BMSC культуры).
-
Адипоцитов
- Сделайте Адипоцит базы СМИ, смешивая вместе 90 мл Дульбекко изменения среднего орла (DMEM) высокая глюкозы, 10 мл плода Bovine сыворотки, 1 мл пенициллина/стрептомицина, 100 мкл 20 мм Росиглитазон и 100 мкл 2 мм инсулина. При необходимости Храните этот СМИ на 4 ° C на неделю в ходе эксперимента дифференциации.
- Сделать Адипоцит индукции СМИ, добавив 200 мкл 62,5 мм 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) и 25 мкл 1 мм дексаметазон 25 мл Адипоцит базы СМИ.
- После того как BMSCs культур (всего BMC от шаг 4.3) или сторонник BMSCs из шага 5.6 вырожденная, измените СМИ Адипоцит индукции СМИ. Рассмотрим этот день 0 дифференциации.
- После 48 ч удалите средства массовой информации и обновления культуры с Адипоцит индукции СМИ.
- На 4 день перейдите к Адипоцит базовых средств массовой информации.
Примечание: Липидного капель могут начать появляться уже в день 2 или 4 день. - На 7 день отмечают, что клетки накопили максимальная липидного капель и отображать фенотип, аналогичный Зрелые Адипоцит. Не культура прошлом этот момент, как это может привести к смерти клетки/отряд.
7. дифференциация СКК в остеокласты
- Сделайте остеокластов дифференциация СМИ, добавляя 50 мкл 25 мкг/мл рецептор активатор NFKB лиганда (RANKL) и 15 мкл 25 мкг/мл макрофагальный колонии стимулирующий фактор (mCSF) до 25 мл BMSC средства массовой информации культуры.
- После всего BMC (из шага 4.3) или non сторонник клетки (из шага 5.2) прикреплены к колодцу, культуры средств массовой информации можно менять остеокластов дифференциация СМИ. Пополняете дифференциации средств массовой информации каждый день.
- Наблюдать за остеокластов культур каждый день под микроскопом, при 10-кратном. Отмечают, что остеокласты сливаются и образуют многоядерные клетки, обычно около 5-7 день дифференциации.
8. Окрашивание
-
Остеобласты
Примечание: Для окрашивания щелочной фосфатазы (AP), мы часто используют AP пятнать комплекта (см. Таблицу материалы) в соответствии с руководящими принципами.- Выполните, AP, окрашивание, следуя изготовителем комплекта руководящих принципов.
- Аспирационная СМИ и промойте клетки с PBS. Исправить клетки с 4% параформальдегида (PFA) в PBS для 12 мин при комнатной температуре.
- В то же время, сделать решения AP с помощью реагентов от AP, окрашивание комплект, добавив 500 мкл нитрит натрия 500 мкл ФРВ-щелочным раствором и перемешивания аккуратно; пусть стоять за 2 мин Добавить 22,5 мл dH2O и 500 мкл Нафтол AS-Би щелочной. Осторожно перемешать.
Предупреждение: PFA токсичных и должны быть обработаны с осторожностью. - Когда ячейки зафиксированы, промыть с PBS и добавить решение AP для каждой скважины (1-2 мл на хорошо). Накрыть алюминиевой фольгой и пусть пятно на 30 минут при комнатной температуре в защищенном от света. Аспирационная решение, промыть дистиллированной водой и позволить пластину для просушки.
- Получение изображений окрашенных колоний, с помощью камеры для того чтобы наблюдать позитивные клеток щелочной фосфатазы.
- Можно также выполните фон Kossa вместо пятнать щелочной фосфатазы. Для этого мыть скважины тщательно промыть дистиллированной водой, как любые оставшиеся PBS будет выпадать в осадок с нитратом серебра.
- Исправить клетки с 4% ПФА в PBS для 12 мин при комнатной температуре. Затем добавьте достаточно 5% раствора нитрата серебра, охватывают также и подвергать сильным светом за 1 ч при комнатной температуре.
- Раствор нитрата серебра снимите и промойте каждой скважины с дистиллированной водой. Добавить 5% раствора тиосульфата натрия в клетках и дать постоять 3 мин.
- Аспирационная тиосульфата натрия и промыть дистиллированной водой. Пусть пластину сухой и наблюдать месторождения полезных ископаемых, окрашенные в темно-коричневый/черный с невооруженным глазом.
- Выполните, AP, окрашивание, следуя изготовителем комплекта руководящих принципов.
-
Адипоцитов
- Для окрашивания O красный нефти (Оро), исправить ячейки с помощью 10% нейтральных буферизуются формалина за 1 ч при комнатной температуре.
- В то же время сделать решение фондовой Оро, растворяя 0,035 г в 10 мл изопропанола. Это достаточно для 6-ну пластины. Смешать и передать решение, с использованием одного фильтра бумаги (поры размер 11 мкм).
- Сделать Оро работать решение путем разбавления 9 мл Оро Стоковый раствор с 6 мл дистиллированной воды. Оставьте раствор на рокер пока готовы для использования.
- Подготовка 60% изопропиловый спирт в дистиллированной воде (сделать достаточно, чтобы охватить каждый хорошо).
- Когда ячейки зафиксированы, удалите фиксирующие и мыть раз дистиллированной водой. Замените воду с 60% раствор изопропанола за 1 мин.
Примечание: Добавьте жидкость медленно во время опрокидывания пластину; адипоцитов выбить очень легко. - Удалите изопропанол и добавить достаточно Оро работать решение для покрытия всех клеток. Инкубируйте 15 мин на низкой скорости рокер при комнатной температуре. Удаление Оро и мыть дважды с дистиллированной водой.
Примечание: на данный момент, Оро окрашенных липидного капель могут быть визуализированы под микроскопом. - Для количественного определения Оро, Отмойте Оро путем добавления 1 мл 100% изопропиловый спирт для каждой скважины и тряся медленно, в течение 10 мин.
- В то же время подготовить серию разрежения для создания на основе следующих 8 стандартов с помощью Оро работать решение калибровочной кривой (2100 мкг/мл) и изопропиловый спирт в качестве разбавителя: 500, 350, 300, 250, 150, 100, 75 и 0 мкг/мл.
- Загрузка 200 мкл стандартов и destained образцы в triplicates на тарелку и читать поглощения на 490 Нм.
- Определите концентрацию Оро для каждого образца, на основе стандартной кривой.
Примечание: Мы рекомендуем, нормализации концентрации Оро номер ячейки. Номер ячейки может быть квантифицировано Фиолетовый Кристалл пятнать или количество ДНК.
- Определите концентрацию Оро для каждого образца, на основе стандартной кривой.
-
Остеокласты
Примечание: Когда вы будете готовы, мы предлагаем окрашивание остеокласты для тартрата-устойчивостью кислоты фосфатазы (ловушка) с помощью окрашивания ЛОВУШКУ комплекта (см. Таблицу материалы).- Для окрашивания ЛОВУШКУ исправьте клетки для 30 мин при комнатной температуре с 2,5% глютаральдегид в PBS. В то же время сделать ЛОВУШКУ решение путем смешивания вместе 50 мкл раствора быстро гранаты базы, 50 мкл нитрит натрия, 4.55 мл дистиллированной воды, 50 мкл Napthol AS-бисфосфата, 200 мкл раствора ацетата и 100 мкл тартрата раствор.
- Аспирационная с фиксатором и промойте клетки с PBS дважды перед добавлением ЛОВУШКУ решение за 1 ч при 37 ° C.
- Промыть дистиллированной водой до подсчета остеокласты под микроскопом (увеличение 10 X). Ловушка+ клетки появляются фиолетовые с 3 или более ядрами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обзор культур клеток
Две культуры методы позволяют оценки дифференциации по смешанным населением BMC, состоящая из BMSCs и СКК (всего BMC, рис. 1A) или совокупность BMSCs отделилась от СКК (сторонник BMSCs, рис. 1B). 48 ч после того, как клетки костного мозга, изолированы и покрытием (рис. 1 c), они быстро прикрепить к нижней части пластины пластика культуры и стремятся образовать монослоя. После того, как клетки достичь слияния (рис. 1 d), они могут использоваться для дифференциации анализов.
BMSCs делятся на остеобласты
Вырожденная культур BMSCs могут быть продифференцированы в остеобластов, используя Остеогенные СМИ, состоящий из аскорбиновой кислоты и β-глицерин фосфат (рисунок 2A, B). После нескольких дней дифференциации остеобласты начать, выражая щелочной фосфатазы (рис. 2 c). Дальнейшей дифференциации вызовет остеоид матрица производства и в конечном счете минерализации этой матрицы (Рисунок 2D). Интересно, что лишь часть клетки будут дифференцироваться в остеобластов в пробирке. Действительно окрашивание с Фиолетовый Кристалл (Рисунок 2E) выясняется, что не все клетки Экспресс щелочной фосфатазы или минерализации пластину.
BMSCs делятся на адипоциты
Adipogenesis могут быть проверены на культур смешанные BMC, а также на более однородной популяции клеток. Как отмечалось с дифференциацией остеобластов, смешанным населением (рис. 3A) или Сплит населения (рис. 3B) используются ли, только доля клеток, адипогенном. Адипоцитов появляются круглые с несколько вакуолей липидов, которые могут быть окрашены в красный с Оро (рис. 3 c). Наш опыт показывает в пробирке адипоцитов всегда появляются мульти vacuolated в отличие от в vivo белый адипоцитов. Различия в условиях генотип или культуры, может увеличиться adipogenesis в точку, где адипоцитов отсоединения и плавают в пластину культуры. Для решения этой проблемы, эксперимент adipogenesis могут быть остановлены на более ранний момент времени.
СКК, дифференцированные в остеокласты
Osteoclastogenesis может быть наведено в культурах, дополняя СМИ с mCSF и RANKL. СКК начинают предохранитель быстро сформировать многоядерные клетки, которые окрашивают позитивные для ловушки (рис. 4A). Эти остеокласты способны resorbing минеральная матрица в пробирке и таким образом могут быть использованы для оценки osteoclastic активности (рис. 4B).
Рисунок 1: Схематическая хронология протоколов для культуры BMSCs и СКК. Различные культуры методы дают всего BMC состоит из смешанного населения клеток (A) или сторонник BMSCs (B). Представитель изображение BMSCs культуры, изолированные от C57B6/J мышей 48 ч после их покрытия (C) и после того, как они разделены от СКК (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Изображения скважин BMSCs культур, дифференцированные в остеобластов. BMSCs до (A) и после (Б) размещается в остеогенном СМИ. Остеобласты могут быть окрашены для выражения щелочной фосфатазы в розовом (C) и месторождения полезных ископаемых в Браун (D). Фиолетовый Кристалл может использоваться для того, чтобы представлять число клеток после дифференциации (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Представитель изображения культур BMSCs продифференцировано в адипоцитов. Оро окрашенных адипоциты, полученные из смешанного населения BMSCs (A) и (B) культуры Сплит после 7 дней в адипогенном СМИ. Образ Адипоцит витражи с Оро (C). Количественная оценка Оро после 7 дней в адипогенном СМИ перед (D) и (E) нормализации Фиолетовый Кристалл поглощения. Данные представлены как средства с погрешностей, представляющие Среднеквадратичная ошибка среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Культур СКК дифференцированной в остеокласты. Ловушка пятнать остеокластов, появляясь как крупные пурпурно розового многоядерные клетки (A). Минерализованные поверхность окрашенных в черном, Kossa фон рассасывания ямы оставленные остеокласты, отличаются от СКК после 7 дней (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье представлены два метода культуры BMSCs с их преимущества и ограничения. Изоляции клеток из костного мозга является относительно легким процессом. Однако получение популяции клеток, представитель мезенхимальных стволовых клеток или osteoclastic прародителями может быть сложным из-за различных клеточной среды полости костного мозга.
Культивирование в целом содержание костного обеспечивает тесные представление микроокружения в естественных условиях . Тем не менее, изоляция клетки из различных групп мышей (генотипов, лечение, возраста и т.д.) может привести к весьма различное количество BMSCs или СКК начала эксперимента в пробирке . Таким образом разделение BMSCs и СКК и повторное покрытие их позволяют лучше контролировать мобильный номер в начале эксперимента дифференциации. Однако уменьшение неоднородности культуры клеток может повлиять на результаты BMSCs или СКК, как оба выделяют факторы влияют дифференцирования мезенхимальных и osteoclastic. Важно учитывать эти ограничения при разработке изоляции и культуры BMSCs и СКК.
Множество популяции клеток в костном мозге можно ввести проблемы в интерпретации данных. В дополнение к СКК и BMSCs костного микроокружения также содержит дифференцированной клетки иммунной системы, красных кровяных клеток, эндотелиальных клетоки т.д. Населения могут оставаться в Адгезивная или non сторонник фракции и таким образом может повлиять на экспериментальных результатов. BMSCs сортировка может быть вариантом для достижения «чище» популяции клеток. Действительно BMSCs считается выразить CD34, а не10СКК. Однако, было также предложено что отсутствие CD34 на поверхности BMSCs может быть результатом культуры и исследование показало, что подмножество не сторонник CD34+ BMSCs могут дифференцироваться в остеобластов, адипоциты и хондроцитов11, 12. Таким образом, при рассмотрении сортировки для изоляции BMSCs, массив четко определенных маркеров должны быть разработаны заблаговременно. Другие препятствия для сортировки клеток являются сроки и стоимость. Действительно, Добавление сортировки шаг может увеличить время изоляции протокол значительно, а также значительное увеличение стоимости. В резюме сортировки клеток представляют технические проблемы, которые могут уменьшить урожайность и качество BMSCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы раскрывают, что они имеют не финансовый конфликт интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (R01 AR061164-01A1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200μL pipet tips | Rainin | 17014401 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
| 15 mL conical tube | VWR | 89039-668 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-660 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 21-040-CM | |
| Ethanol | Fisher Science | 04-355-451 | |
| Dissection tools | |||
| 70 μm filters | BD Falcon | 352350 | |
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| Kimwipe | VWR | 82003-820 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| Alkaline Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 86R | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | S6506 | |
| Sodium Thiosulfate | Sigma-Aldrich | S7026 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | F5554-4L | |
| Whatman filter Grade 1 | Sigma-Aldrich | Z274852 | |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Glutaraldehyde | Electron | 16220 | |
| MEMα | Gibco | 12571 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9891 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| DMEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Rosiglitazone | Cayman Chemical | 717410 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| RANKL | Peprotech | 310-01 | |
| mCSF | Peprotech | 315-02 | |
| Axio Observer inverter microscope | Zeiss |
References
- Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
- Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
- Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
- Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
- Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
- DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
- Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
- Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
- Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
- Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
- Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells? Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).
