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Cancer Research

Estabelecimento de uma cultura primária de Sarcoma macio do tecido derivado de paciente

doi: 10.3791/56767 Published: April 11, 2018

Summary

O seguinte protocolo incide sobre o estabelecimento de uma cultura primária de sarcoma de tecidos moles paciente-derivado (STS). Este modelo pode nos ajudar a compreender melhor o fundo molecular e perfil farmacológico destas malignidades raras e poderia representar um ponto de partida para novas pesquisas que visam melhorar a gestão do STS.

Abstract

Sarcomas de partes moles (STS) representam um espectro de malignidades heterogêneos com difícil diagnóstico, classificação e de gestão. Até à data, foram identificados mais de 50 subtipos histológicos destes raros tumores sólidos. Assim, devido à sua extraordinária diversidade e baixa incidência, nossa compreensão da biologia desses tumores é ainda limitado. Paciente-derivado de culturas representam a plataforma ideal para estudar farmacologia e fisiopatologia do STS. Assim, desenvolvemos um modelo humano pré-clínicos de STS a partir de amostras de tumor colhidas de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica. Culturas de células do paciente-derivado STS foram obtidas a partir dos espécimes cirúrgicos por digestão de colagenase e isoladas por filtração. As células foram contadas, semeadas e deixou por 14 dias em culturas padrão monocamada e processadas por análise a jusante. Antes de executar análises moleculares ou farmacêuticas, o estabelecimento de culturas primárias de STS foi confirmado através da avaliação das características de cytomorphologic e, quando disponível, marcadores imuno-histoquímicos. Este método representa uma ferramenta útil 1) para estudar a história natural destas malignidades mal exploradas e 2) para testar os efeitos de diferentes drogas em um esforço para aprender mais sobre seus mecanismos de ação.

Introduction

Sarcomas de partes moles (STS) incluem um espectro de lesões heterogêneas de contabilidade de origem mesenquimal para 1% de todos os tumores sólidos1,2, e a nova classificação da Organização Mundial de saúde reconhece a presença de mais de 50 Subtipos diferentes3. Entre estes, os histotypes mais comuns são sarcoma de adipócitos ou Lipossarcoma e Leiomiossarcoma, representando 15% e 11% de todos os adultos STS, respectivamente de4,5. Embora o STS podem desenvolver em diferentes partes do corpo, as extremidades e retroperitoneal são os locais mais comuns, ocorrendo em 60% e 20% dos casos, respectivamente6.

A pedra angular da terapia para doença localizada é a ressecção cirúrgica ampla, Considerando que os benefícios da quimioterapia adjuvante e neoadjuvante não são ainda claras e são considerados apenas em casos selecionados7. Na configuração da metastática, quimioterapia é o tratamento padrão, mas mostra resultados limitados8. Uma melhor compreensão da biologia molecular da STS contribuiria para melhorar o diagnóstico atual, otimizar os tratamentos disponíveis e identificar novos alvos para a terapia.

Dentro deste contexto, foi realizada pesquisa em câncer por muitos anos usando linhas de célula imortalizado9. Esses modelos experimentais são normalmente cultivados em monocamada padrão suporta ou implantados em imunodeficientes roedores estabelecer na vivo xenoenxertos modelos10. Linha celular imortalizado representa um gerenciável e fácil-para-loja material com o qual um amplo número de experimentos de pesquisa pode ser realizado. Eles são, na verdade, os menos dispendiosos e mais amplamente utilizado a ferramenta em estudos pré-clínicos11.

No entanto, célula-linha com base em modelos de câncer também têm algumas limitações, por exemplo, prolongada de cultura em um sistema de monocamada juntamente com um número crescente de passagens induz fenotípica e deriva genética, fazendo as células menos provável para recapitular o tumor chave características. Além disso, culturas de células linha deixam de reproduzir a interação célula a célula e sinalização diafonia molécula que imitam o comportamento biológico dos tumores e caracterizar o microambiente do tumor. Estas questões formam a base do fosso existente entre os resultados clínicos e pré-clínicos12.

Dado o acima, o interesse no paciente-derivado de culturas primárias aumentou13. Com efeito, a excisão do tecido normal e maligno reduz o risco de perder o fenótipo de células de câncer e heterogeneidade, oferecendo assim uma matéria-prima que é o mais representativo do microambiente do tumor. Além disso, o uso de amostras de tumor frescas colhidas de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica nos permite investigar tumores única e comparar diferentes lesões da mesma parte do corpo de14 um paciente. Pelas razões acima expostas, culturas de células derivadas de tecido proporcionam um valioso material para estudar o tumor fisiopatologia e farmacologia15,16,17, especialmente no STS em quais linhas de células de sarcoma comercialmente disponível são limitados,18. Nós aperfeiçoamos, portanto, um método para estabelecer uma paciente-derivado STS cultura de célula primária a partir de2019,13,do tecido tumor cirurgicamente extirpado. Nosso método consiste em desagregar o espécime de tumor em pequenos fragmentos de tecido seguidos de dissociação de tecido enzimática durante a noite para obter uma suspensão de célula única. No dia seguinte, a digestão enzimática é interrompido pela adição de meio de cultura fresco e a suspensão obtida é filtrada para remover fragmentos de tecido, célula-agregados e material de matriz em excesso ou detritos. Finalmente, uma fração de células tumorais isoladas é cytospinned em lâminas de vidro, fixo e armazenados para jusante análise visado confirmando o estabelecimento da cultura primária de STS por cytomorphological, imuno-histoquímica e avaliação citogenética molecular (por exemplo, análise de peixe de MDM2 amplificação representa o padrão diagnóstico diferencial para uma Lipossarcoma bem diferenciada e a condrossarcoma Lipossarcoma) 4. as células restantes são semeadas em uma cultura padrão monocamada para estudos farmacológicos e de criação de perfil de expressão genética. Todos os experimentos são realizados usando baixa passagem culturas primárias para evitar a seleção dos subclones de câncer específicos e analisaram por um patologista experiente sarcoma. Assim, criamos um humano totalmente STS ex-vivo modelo13,19,20. Esta altamente versátil, fácil de punho modelo poderia representar uma ferramenta útil para diferentes tipos de pesquisa pré-clínica, por exemplo, para identificar novos marcadores moleculares para diagnóstico e prognóstico ou para ganhar uma compreensão mais profunda da atividade e mecanismos de ação de padrão e novos fármacos utilizados na gestão do STS.

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Protocol

Células de STS são isoladas um tumor extirpado cirurgicamente massa de pacientes com STS. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética Local e é realizado de acordo com as diretrizes de boas práticas clínicas e a declaração de Helsinque. Todos os pacientes deram consentimento escrito para participar no estudo. Os espécimes cirúrgicos são analisados por um patologista experiente sarcoma e processados dentro de 3 horas de cirurgia.

1. tumor colheita e processamento:

  1. Colete as amostras de tumor com a ajuda de uma patologista de sarcoma em um recipiente 100 mL de urina estéril com 50 mL de meio DMEM baixa glicose selado com uma película de parafina.
  2. Armazene as amostras em 4 ° C por um período máximo de 3h após a ressecção do tumor.
  3. Execute todas as etapas a seguir sob uma capa de cultura de tecido estéril.
    1. Esterilizar o capô com etanol a 70% e luvas estéreis.
    2. Esterilize pinças de aço inox com etanol a 70% (uso uma gaze estéril).
    3. Retire a película de parafina do contêiner de urina e descarte.
    4. Lave o exterior do recipiente de urina com etanol a 70%.
    5. Abra uma quadrado de Petri.
    6. Abra o recipiente de urina e transferir as amostras do tumor para o prato de petri quadrado usando uma pinça esterilizada de aço inox.
  4. Os espécimes do tumor com PBS lave duas vezes.
  5. Abra um bisturi cirúrgico estéril.
    1. Pique finamente os espécimes do tumor em pedaços de3 1-2 mm.
    2. Colete um quarto do total da amostra em um tubo de 2 mL.
    3. Adicione 1 mL do reagente trizol (comprado) ao tubo e imediatamente congelar a-80 ° C (a amostra será usada na análise a jusante para a avaliação da expressão de gene STS).
  6. Recolha o resto do material finamente ralado tumor em um tubo de 15 mL.
    1. Adicionar 4 mL de colagenase tipo I (tipo de colagenase que é dissolvido em PBS, em uma concentração de 4 µ g/mL) de solução.
    2. Diluir a colagenase tipo I solução com 4 mL de DMEM alta cultura mídia (concentração final do tipo de colagenase é de 2 µ g/mL).
    3. Fechar o tubo de 15 mL e selar com película de parafina.
    4. Coloque o tubo de 15 mL em um shaker rolamento em uma incubadora a 37 ° C em condições de agita por 15 min ativar a digestão.
    5. Depois de 15 min armazene o tubo no shaker rolamento sob agitação condições à temperatura ambiente durante a noite.
  7. No dia seguinte Coloque o tubo de 15 mL sob o capô estéril.
  8. Delicadamente, filtre a suspensão de células através de um filtro estéril de 100 µm, anexado ao topo de um tubo de 50 mL.
  9. Lave o filtro com meio de cultura alto DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 1% e 1% penicilina/estreptomicina.
  10. Descarte o filtro de estéril 100 µm, fechar o tubo de 50 mL e centrifugar a 225 x g, durante 5 minutos à temperatura ambiente.
  11. Desprezar o sobrenadante por inversão do tubo.
  12. Ressuspender as células com 1-2 mL DMEM alto meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 1% e 1% penicilina/estreptomicina.
    Nota: O volume depende da quantidade de amostra de tumor processada.
  13. Conte as células com uma câmara de Neubauer.
    1. Diluir a amostra 1:2 em azul trypan e usar 10 µ l da diluição para contagem de células.
    2. Contar pelo menos duas vezes e calcular a média da é replicada para saber o número médio total de células coletadas.
  14. Placa as células em uma cultura padrão monocamada em uma densidade de 80.000 células/cm2.
    Nota: Sempre inclua controles em experimentos. Realize pelo menos 3 técnicas repetições para cada condição. Realize pelo menos 2 réplicas biológicas. Para farmacologia pré-clínica, expressão gênica e análises de expressão de proteínas, devem ser realizadas experiências com um baixo número de passagens de cultura dentro de 30-45 dias de semeadura de células para evitar a perda de câncer fenótipos de célula.
  15. Preparação das amostras citológicas.
    1. Recolha 100.000 pilhas em 200 µ l de DMEM alta media de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 1% e 1% penicilina/estreptomicina.
    2. Pipeta a solução (pipeta de 200 µ l) para um funil descartável equipado com um filtro e montado com uma lâmina de vidro.
    3. Abra o cytocentrifuge e inserir as amostras.
    4. Execute o cytocentrifuge a 18,6 x g por 20 min.
    5. Descarte o funil equipado com o filtro.
    6. Corrigi os slides em acetona por 10 min, seguido de clorofórmio por 5 min.
    7. Armazenar os slides a-20 ° C.
      Nota: Descongelar e hidratar as amostras antes de coloração e realizar a coloração seguindo as instruções do fabricante. Prepare pelo menos 3 repetições de técnicas.

2. culturas de pilha STS:

  1. Mudar a mídia uma vez por semana (DMEM alta media de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 1% e 1% penicilina/estreptomicina).
    1. Descarte o meio de cultura usando uma pipeta de µ l 200-1.000.
    2. Adicione novo meio fresco com uma pipeta de µ l 200-1.000.
    3. Passagem de células:
      1. Separe as células quando a confluência é de cerca de 90%:
        Nota: Amplificação de cultura de células de STS deve ser realizada uma vez por semana, com base nas condições de cultura.
      2. Descarte o meio, lave com PBS e adicionar 2-3 mL de tripsina 1 x em PBS
        Nota: O volume de tripsina utilizada depende da quantidade de pilhas cultivadas obtidos.
      3. Incubar as células para 3-5 min a 37 ° C.
      4. Recolha pilhas desanexadas da placa usando uma pipeta de µ l 200-1.000.
      5. Pipetar as células destacadas para um tubo de 15 mL e adicionar 4 mL de DMEM alta media de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 1% e 1% penicilina/estreptomicina para parar a reação enzimática.
      6. Centrifugar a 225 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
      7. Desprezar o sobrenadante.
      8. Ressuspender o centrifugado, adicionando 1 mL de DMEM alta media de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino, glutamina 1% e 1% penicilina/estreptomicina.
      9. As sementes das células em uma nova placa de cultura ou um balão com um volume final de acordo com as instruções do fabricante.
        Nota: Não dividi células, mais de 1:3.

3. a jusante análises:

Nota: Uma variedade de experiências diferentes pode ser realizada usando esse modelo (veja abaixo). É, portanto, crucial decidir durante a fase de concepção do estudo que analisa será executada para que possa ser preparado um número adequado de amostras e repetições.

  1. Ensaios de proliferação como brometo de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium MTT
  2. Ensaios de apoptotic tais como terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) nick final rotulagem do ensaio (TUNEL)
  3. Análise imuno-histoquímica
  4. Análise de expressão do gene
  5. Análise ocidental do borrão
  6. Ensaio de ELISA
  7. Fluorescência-ativado da pilha classificação análise (FACS)
  8. Modelo de enxerto heterólogo in vivo

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Representative Results

Nós projetamos um método simples para obter o estabelecimento de uma cultura primária de sarcoma macio do tecido derivado de paciente e apresente-se aqui um exemplo dos resultados obtidos em um específico STS histotype13. O protocolo foi utilizado para o estabelecimento de culturas primárias de diferentes histotypes STS, incluindo Lipossarcoma bem diferenciada, condrossarcoma Lipossarcoma Lipossarcoma mixoide, Lipossarcoma pleomórfica, myxofibrosarcoma, indiferenciado Fibromatose desmoides, GIST e sarcoma pleomórfico.

A taxa de sucesso para o estabelecimento de culturas primárias foi 54% (13 culturas primárias de 24 amostras cirúrgicas de STS) para espécimes cirúrgicos derivados de pacientes tratados com quimioterapia, radioterapia ou não tratados. Por outro lado, foi 72% (13 culturas primárias de 18 amostras cirúrgicas de STS) para amostras cirúrgicas derivadas apenas pacientes não tratados.

Células tumorais foram isoladas a partir de uma Lipossarcoma well-differentiated/condrossarcoma (ALT/DDLPS) cirurgicamente removida de um paciente de 54 anos de idade. Análise de amplificação Mdm2, atualmente realizada para o diagnóstico diferencial padrão de ALT/DDLPS e analisado por um patologista experiente sarcoma, foi positivo, confirmando a presença de uma lesão ALT/DDLPS (Figura 1A). Análise citológica de MDM2 amplificação em células tumorais isoladas confirmou a criação de uma paciente-derivado ALT/DDLPS cultura primária (94,6% de pilhas cultivadas foram positivas para MDM2 amplificação) (Figura 1B). A cultura primária continuou a proliferar após passagens em culturas padrão monocamada e viabilidade celular foi monitorizada por MTT e Tunel ensaio.

Este modelo permitiu-na testar a sensibilidade da cultura primária ALT/DDLPS para diferentes drogas atualmente usadas ou sob avaliação clínica para o tratamento de ALT/DDLPS como ifosfamida (IFO), www.Roche.com.br (EPI), a combinação de IFO + EPI, Trabectedina (TRABE), e eribulin (ERI), executada usando o ensaio de MTT. Os resultados confirmaram a sensibilidade das culturas a quimioterapia(Figura 2). O tratamento mais ativo foi IFO + Epinefrina, uma terapia de primeira linha usada no avançado ou metastático ALT/DDLPS. Além disso, a morfologia celular foi examinada após a exposição da droga, resulta em alterações morfológicas ighlighting na cultura primária em relação ao controle e os resultados do ensaio citotóxico (Figura 2B). Como mencionado no protocolo, várias análises a jusante podem ser executadas com este modelo. A Figura 3 fornece uma representação esquemática do método e inclui uma linha de tempo dentro do qual as experiências devem ser realizadas para obter resultados de translação.

Figure 1
Figura 1 . Estabelecimento de cultura primária paciente-derivado de ALT/DDLPS. A) hibridação In situ (FISH) realizados para detectar MDM2 amplificação em uma amostra de tecido do paciente (imagem de X 100). B) hibridação In situ (FISH) realizados para detectar MDM2 amplificação em uma cultura primária (ampliação de 100 X). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Quimioterapia em uma cultura primária de ALT/DDLPS. A) as células foram tratadas com: ifosfamida (IFO), www.Roche.com.br (EPI), IFO + EPI, Trabectedina (TRABE,) e eribulin (ERI). Realizaram-se três repetições independentes para cada experimento. Dados são apresentados como média ± erro-padrão (SE), como afirmado, com n indica o número de repetições. Diferenças entre os grupos foram avaliadas por de um Student bicaudal t-teste, * p < 0,05. B) cultura primária de imagens de ALT/DDLPS após a exposição da droga (ampliação de X 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Modelo de cultura primária de STS. Representação esquemática do modelo pré-clínico do STS cultura primária, incluindo a linha do tempo e as análises possíveis a jusante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Modelos pré-clínicos bem definidos são necessários para elucidar o fundo molecular de tumores, prever o prognóstico pobre e desenvolver novas estratégias terapêuticas para pacientes com câncer. Isto é especialmente importante para tumores raros como STS cuja alta heterogeneidade em termos de morfologia, comportamento agressivo em potencial e clínico desafia nossa compreensão da biologia do STS e gestão paciente21. Além disso, poucas linhas celulares sarcoma comerciais disponíveis limita pré-clínicos investigações sobre este grupo de tumores mesenquimais18. Ex vivo modelos representam assim um recurso valioso de pesquisa para o STS. Desenvolvemos um modelo totalmente humano em vitro de STS a partir de tecido do tumor cirurgicamente ressecado (Figura 3). Durante a otimização do método, várias questões críticas foram abordados e resolvidos. O primeiro problema diz respeito o intervalo de tempo entre o tratamento cirúrgico e processamento de amostra. Inicialmente, quando amostras de tumor chegaram em nosso laboratório de Biociências após um certo tempo, eles foram armazenados durante a noite a 4 ° C e processados no dia seguinte. As STS células isoladas destas amostras exibiram atividade baixa proliferação e viabilidade pobre em cultura padrão monocamada. Este pode, em parte, ser atribuído ao fato desse espécime de todo tumor é mantido por um período prolongado de tempo no recipiente de urina antes de serem processadas. Assim, nós modificamos a data inicial da amostra de processamento para um máximo de 3 h após a cirurgia para garantir que a cultura primária continuou a proliferar na cultura padrão monocamada e apresentam boa viabilidade. Nós também aperfeiçoamos o processo de desagregação celular: pequenos homogênea fragmentos de tecido são necessários para facilitar a digestão enzimática, e isto foi conseguido usando um bisturi. Além disso, embora o protocolo trabalhou com amostras de tamanhos diferentes, o estabelecimento de uma cultura primária a partir de amostras de tamanho limitado (< 2 cm) é mais difícil de alcançar. A concentração de colagenase foi outra questão importante, porque anenzyme muito alta concentração pode causar estresse celular, levando a alterações fenotípicas na cultura primária STS ou uma diminuição da sobrevivência de células do tumor. Boa digestão enzimática é necessária para separar as células de detritos e materiais de matriz. Finalmente, nós aperfeiçoamos a concentração de enzima para usar na fase de digestão. Além disso, para limitar o estresse celular e fornecer nutrientes para as células de STS durante a fase de isolamento re-suspendemos a enzima em meios de cultura em vez de outros reagentes como a PBS. Finalmente, vários experimentos realizados em diferentes culturas primárias de STS como Lipossarcoma e myxofibrosarcoma revelaram alterações na expressão gênica ao longo do tempo e aumento da sensibilidade à quimioterapia13,20. Esses achados são atribuíveis à cultura prolongada do paciente-derivado de células de STS em um sistema de monocamada juntamente com um número crescente de passagens, tanto do que induzir fenotípica e deriva genética. A confiabilidade decrescente deste sistema de cultura ao longo do tempo para recapitular o tecido do tumor, como anteriormente demonstrado, representa uma das mais importantes limitações de ex vivo modelos22,23. Assim, nós aperfeiçoamos o protocolo, reduzindo o tempo em que para realizar experiências (no prazo de 30-45 dias de célula de tumor semeadura) e usando culturas de passagem baixa para obter resultados reprodutíveis e de translação. Além disso, as culturas primárias podem ser congeladas, mas sua viabilidade subsequente é dependente de vários fatores, incluindo a localização de tumor, histotype STS, quantidade do espécime cirúrgico e o número de passagens de cultura realizada.

Nosso sistema tem uma série de vantagens, ou seja, é um modelo totalmente humano pré-clínicos, em contraste com outros sarcoma murino-baseado célula linha modelos24,25,26,27. Além disso, enquanto a confirmação do estabelecimento de culturas primárias de STS, alcançado pela cytomorphological, imuno-histoquímica e avaliação citogenética molecular, com o apoio de um sarcoma experiente patologista, é obrigatório em nosso protocolo , este não é sempre o caso para outros modelos de cultura primária de STS. Em alguns jornais, realizou-se análise a jusante das células recuperado de espécimes cirúrgicos sem confirmar o percentual de célula de diagnóstico o STS em culturas primárias28. Nosso sistema também é versátil, pode ser reproduzido e pode ser usado para executar uma grande variedade de experiências. Além disso, célula semeadura e estímulos externos podem ser modificados para estudar as respostas e características específicas. O desenvolvimento deste modelo permitiu-nos investigar a sensibilidade das células de STS paciente-derivado de diferentes drogas atualmente usadas ou sob avaliação clínica para o tratamento de STS. Este modelo, portanto, representa uma importante ferramenta pré-clínicos para predizer a resposta à terapia e, se ainda mais otimizado, potencialmente poderia ser usado para melhorar a terapia personalizada. Ele também pode ser usado para identificar o diagnósticos ou prognósticos marcadores moleculares, especialmente importantes no STS, onde alguns biomarcadores específicos estão disponíveis. Uma das limitações do protocolo é o relativamente pouco tempo disponível para realizar a análise a jusante após o estabelecimento da cultura primária. O protocolo pode ser melhorado através da realização de perfis de expressão de gene e análise do tumor e do derivado do mesmo paciente ao longo do tempo para avaliar a capacidade da cultura primária para imitar a heterogeneidade do tecido do tumor, de culturas primárias de clustering especialmente para aqueles histotypes de STS para o qual um marcador diagnóstico não está disponível. Essas análises também ajudaria mais caracterizar como as células na cultura obtida diferem daquelas derivadas diretamente de amostras de tumor.

Em conclusão, o estabelecimento de modelos pré-clínicos sólidos é essencial para fazer avançar a nossa compreensão da patologia do tumor. Acreditamos que nosso modelo vai ajudar a desvendar os mecanismos moleculares que são responsáveis para o prognóstico pobre do STS e contribuirão para a identificação de novas estratégias terapêuticas.

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Disclosures

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostaria de agradecer Gráinne Tierney assistência editorial.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM High Glucose EuroClone ECB7501L
Fetal bovine serum EuroClone ECS0180D
Glutamine Gibco 25030-024
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 157-4-100
Penicillin streptomycin Gibco 15140122
Triazol reagent Ambion Life-Technologies 15596018
Trypsin EuroClone ECB3052D

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References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66, (1), 7-30 (2016).
  2. Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11, (4), 187-202 (2014).
  3. Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours - an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64, (1), 2-11 (2014).
  4. De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9, (12), 6233-6246 (2016).
  5. Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
  6. Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6, (8), 20294 (2011).
  7. Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17, (7), 966-975 (2016).
  8. The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, Suppl 3 102-112 (2014).
  9. Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Cancer Research. 22, 431-440 (1962).
  10. Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2, (2), 247-250 (2007).
  11. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10, (8), 483-487 (2013).
  12. Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8, (3), 159-166 (2015).
  13. De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3, (12), 1662 (2016).
  14. Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95, (3), 343-347 (2009).
  15. Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
  16. Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
  17. Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313 (2008).
  18. Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13, (2), 227-240 (2016).
  19. Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15, (2), 309 (2017).
  20. De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9, (12), 755-767 (2017).
  21. Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14, (2), 78-80 (2017).
  22. Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55, (12), 2516-2519 (1995).
  23. Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12, (2), 1050-1055 (2016).
  24. Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21, (6), 848-855 (2012).
  25. Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16, (6), 625-638 (2011).
  26. Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37, (4), 1711-1722 (2017).
  27. Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2, (3), 407-412 (2011).
  28. Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, (8), 313 (2008).
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De Vita, A., Mercatali, L., Miserocchi, G., Liverani, C., Spadazzi, C., Recine, F., Bongiovanni, A., Pieri, F., Cavaliere, D., Fausti, V., Amadori, D., Ibrahim, T. Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma. J. Vis. Exp. (134), e56767, doi:10.3791/56767 (2018).More

De Vita, A., Mercatali, L., Miserocchi, G., Liverani, C., Spadazzi, C., Recine, F., Bongiovanni, A., Pieri, F., Cavaliere, D., Fausti, V., Amadori, D., Ibrahim, T. Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma. J. Vis. Exp. (134), e56767, doi:10.3791/56767 (2018).

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