Summary
Nous avons généré avec succès deux essais de substrat spécifique γ-sécrétase. Les deux analyses cellulaires présentés ici visent à quantifier les activités enzymatiques de la γ-secretase via la sortie de reporters luciférase firefly.
Abstract
Nous avons mis au point une paire de reporter sur les cellules des épreuves de gène pour mesurer quantitativement la γ-secretase clivage des substrats distincts. Ce manuscrit décrit les procédures qui peuvent être utilisés pour surveiller le clivage γ-sécrétase-mediated de APP-C99 ou Notch, utilisant un système de Gal4 firefly pilotée par le promoteur luciferase reporter. Ces tests ont été établies par stablement co transfectants cellules HEK293 avec le gène rapporteur luciférase axée sur la famille Gal4 et soit le fragment de Gal4/VP16-tag C-terminale de l’APP (APP-C99 ; Cellules CG), ou le tag Gal4/VP16 cran-ΔE (NΔE ; Cellules NG). À l’aide de ces tests de journaliste en parallèle, nous avons démontré qu’un inhibiteur de l’ErbB2, CL-387 785, préférentiellement pour supprimer le clivage γ-sécrétase des APP-C99 dans les cellules CG, mais pas NΔE dans les cellules de NG. Les réponses différentielles exposées par les cellules de la CG et NG, avec CL-387 785, représentent une caractéristique préférée pour modulateurs de la γ-secretase, et ces réponses sont en contraste frappant avec le pan-inhibition de la γ-secretase induite par DAPT. Nos études fournissent des preuves directes que les activités de γ-sécrétase vers différents substrats peuvent être différenciées dans un contexte cellulaire. Ces nouveaux tests peuvent donc être des outils utiles à la découverte de médicaments pour l’amélioration des traitements AD.
Introduction
Les formes oligomères de β amyloïde (Aß) sont censés être la cause principale de la neurodégénérescence dans le cerveau des patients souffrant de la maladie d’Alzheimer (ma)1. Les peptides bêta-amyloïdes sont produites par le clivage progressif de la protéine précurseur de l’amyloïde (APP), tout d’abord par la β-secretase, puis par γ-sécrétase2. Au cours de la dernière décennie, des approches thérapeutiques vers un traitement d’AD ont mis l’accent sur la prévention de la production de bêta-amyloïdes3. La majorité des études ont porté sur soit l’augmentation de l’activité α-secretase, ce qui peut empêcher la γ-secretase clivage de l’APP et ainsi diminuer la production de bêta-amyloïdes ou l’inhibition de la β-et/ou γ-sécrétase activités4. Malheureusement, l’inhibition non-sélective de β - ou γ-secrétases entraîne des effets secondaires inévitables qui sont en raison de l’interférence avec le fonctionnement d’autres substrats physiologiques de β - et γ-sécrétase5,6. En ce qui concerne les inhibiteurs de la γ-secretase, des études récentes ont signalé la découverte d’un certain nombre de modulateurs chimiques et génétiques qui peuvent réglementer la production de bêta-amyloïdes tout en exerçant des effets négligeables sur la transformation de γ-sécrétase-mediated essentielle des encoche7 ,8,9,10,11,12, cependant, succès thérapeutiques n’ont pas encore été développé. Ainsi, plus systématiques écrans sont garantis pour découvrir de nouveaux modificateurs génétiques et chimiques qui pourraient moduler sélectivement le traitement d’APP véhiculée par γ-sécrétase.
Γ-sécrétase est connue en conjonction avec plus de 90 différentes protéines ancrées à la membrane. Parmi ces substrats est ordre, dont l’activité est essentielle pour déterminer le destin cellulaire et différenciation au cours du développement,13. Modulant sélectivement catalysée par γ-sécrétase APP traitement en l’absence d’affecter le cran traitement seront essentiel pour minimiser Notch-effets secondaires des inhibiteurs de la γ-secretase, et cette sélectivité est considérée comme des principaux facteurs qui seront dicter l’efficacité biologique de modulateurs de γ-sécrétase potentiels pour le traitement chronique de AD. Il y a eu un certain nombre de dérivés arylsulfonamide, tels que GSI-953 (begacestat) et le BMS-708163 (avagacestat), qui ont été affectés présentent une inhibition puissante et sélective de la γ-sécrétase14,15. Une étude antérieure a montré que l’inhibition différentielle de γ-sécrétase clivage de l’APP et l’encoche peut être observée à l’aide d’un test quantitatif par ELISA en combinaison avec validation en vivo à l’aide de poisson-zèbre,16. En outre, paradigmes de test basés sur les cellules ont été établis pour traiter la sélectivité de substrat potentiels de la γ-secretase vers APP et Notch17,18. À l’aide des protocoles similaires à celles décrites dans les présentes, nous avons récemment découvert une nouvelle classe de (D)-leucinamides qui modulent puissamment γ-sécrétase clivage de l’APP avec encoche d’épargne sélectivité19. Ensemble, ce recueil d’études fournit une preuve de concept soutenant l’idée que la sélectivité/disponibilité des substrats de la γ-secretase peut être soumis à la modulation chimique et vérification expérimentale. Toutefois, ces plates-formes de dosage dépendent souvent relativement faible débit lectures et approches à forte main-d'oeuvre qui pourraient respectent pas les normes industrielles pour les programmes de recherche.
Nous avons généré récemment dosages de gène de journaliste luciférase à base de cellules qui peuvent de déterminer quantitativement l’activité catalytique de la γ-secretase vers deux substrats distincts, le fragment de C-terminal acid amino-99 d’APP (APP-C99) et l’extracellulaire domaine-supprimé un peptide Notch (NΔE). Les APP-C99 et NΔE ont été couramment comme substrats directes de la γ-secretase lors d’essais différents. Pour générer des essais de gène journaliste luciférase homogène et cohérente pour le clivage de la γ-secretase de APP-C99 ou NΔE, nous avons généré une ligne de cellule stables dérivés HEK (CG) qui exprime constitutivement une Gal4 pilotée par le promoteur firefly luciferase reporter ( GAL4-Luc) et la protéine de fusion de Gal4/VP16-tag APP-C99 (C99-GV). En outre, nous avons généré une autre ligne de cellule stables dérivés HEK (NG) qui exprime constitutivement Gal4-Luc et Gal4/VP16-le tag NΔE (NΔE-GV). À l’aide de ces tests de nouveaux substrats spécifiques γ-secretase, nous fournissons maintenant une méthode permettant de quantifier et de distinguer l’activité catalytique de la γ-secretase vers différents substrats (APP-C99 dans les cellules CG), ou NΔE dans les cellules de NG. En outre, les dosages de substrat spécifique γ-sécrétase visaient à être propice aux plates-formes de criblage de haute teneur. Ces tests nouvellement généré γ-sécrétase pourraient ouvrir la voie à la découverte de nouveaux γ-sécrétase modulateurs susceptibles d’améliorer la fonction cognitive de supprimer la production de bêta-amyloïdes sans suscitant indésirable inhibition de cran pour le traitement de la nouvelle génération de AD.
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Protocol
1. mesure des signaux rapporteur luciférase qui Correspond au clivage de la γ-sécrétase des APP-C99 ou NΔE
Remarque : Veuillez consulter les publications précédentes pour obtenir une description détaillée de la génération de CG et NG cellules20,21.
-
Graines de cellules NG ou CG (20, 000 cellules/puits) sur Microplaque 96 puits à un volume final de 200 μL/puits dans le milieu qui est composé de Eagle modifié (DMEM) majoré de 10 % bovin sérum fœtal de Dulbecco (SVF), 5 μg/mL blasticidine, 250 antibiotique μg/mL (par exemple zeocin) et 200 μg/mL hygromycine B.
- Compter les cellules avec un hémocytomètre.
- Transférer les microplaques dans une étuve à2 CO humidifiée et incuber à 37 ° C pendant la nuit.
- Retirer 100 μl de milieu de croissance de chaque puits.
- Ajouter 100 μL/puits de croissance moyenne contenant 2 tétracycline μg/mL avec soit 0,2 % du diméthylsulfoxyde (DMSO), 2 μM CL-387 785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT) ou autres connexes ErbB1/ErbB2 inhibiteurs.
- Incuber les cellules traitées de CG ou NG en microplaques à 37 ° C pendant 24 h.
- Retirer 150 μL/puits milieu de microplaques.
- Ajouter 50 μL/puits luciférase test réactif (voir Table des matières).
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Transférer les microplaques à un lecteur de microplaques de luminescence.
- Maintenir les plaques de microtitration à température ambiante pendant 5 min avec agitation douce.
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Déterminer la luciférase Firefly (FL)-émis luminescence en utilisant un programme prédéfini stocké dans le lecteur de microplaques de luminescence.
- Ouvrez le logiciel de contrôle d’instrument (voir Table des matières pour plus d’informations de l’instrument).
- Dans le menu « Tool », sélectionnez « Luminometry ».
- Avec les paramètres « Paramètres », choisissez « Sans filtre » pour filtre d’émission, cochez « Normal » pour ouverture d’émission, inscrivez « 1 » pour les temps de comptage et cliquez sur « OK » pour mettre en place la lecture de la luminescence.
- Sous l’onglet « Contrôle d’instruments », faites défiler la liste des protocoles actifs, puis sélectionnez le protocole pré-enregistrée pour la lecture de luminescence.
- Sous l’onglet « Affichage en direct », définir l’échelle de la liste du menu déroulant et sélectionnez « Logarithme » ou « Linéaire » pour le Type.
- Sous l’onglet « Température », sélectionnez « Off » pour le chauffage de la plaque.
- Cliquez sur le bouton « Démarrer » pour effectuer la luminescence de lecture.
- Au besoin, exporter les résultats dans un format de feuille de calcul à l’aide de le « Explorer » intégrée dans le logiciel de contrôle.
2. quantification de l’activité de la γ-Secretase
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Définir un avertisseur de luminescence de CG ou cellules NG traitées avec 0,1 % DMSO en milieu de culture contenant 1 tétracycline μg/mL seul en tant qu’activité de γ-sécrétase relative de 100 %.
- Estimer la luminescence d’arrière-plan des cellules CG ou NG en traitant les cellules avec le milieu de croissance qui n’inclut pas de tétracycline.
- Normaliser les signaux de la luciférase de CG ou NG des cellules qui sont cultivées avec milieu de culture contenant 1 tétracycline μg/mL et soit 1 μM CL-387 785 ou 1 μM de DAPT avec le signal de la luciférase émis par CG imprégnées de DMSO ou NG cellules (activité γ-sécrétase relative de 100 %, comme définies en 2.1).
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Representative Results
Inhibition de ErbB2 par CL-387 785 peut promouvoir différentiellement le traitement des APP-C99 par Γ -sécrétase sans affecter le clivage de l’encoche
Pour établir un test cellulaire qui permet de mesurer quantitativement le clivage protéolytique d’un substrat particulier γ-secretase, nous avons généré la lignée de cellules HEK293 dérivés CG par transfection stable de co d’une tétracycline-inducible terminalement Gal4/VP16-tag APP-C99 et un gène rapporteur luciférase firefly pilotée par le promoteur de Gal4. Une lignée de cellules NG parallèle a également été établie pour doser pour le clivage de la γ-secretase de NΔE. Dans les cellules de NG, un NΔE de Gal4/VP16-tag tétracycline-inducible C-terminale et un gène rapporteur luciférase pilotée par le promoteur de Gal4 étaient stablement co transfectés dans des cellules HEK293. Le clivage de la γ-secretase de APP-C99 dans les cellules CG et le clivage de la γ-secretase de NΔE dans les cellules de NG ont été tout d’abord confirmé en traitant les cellules CG et NG avec différentes concentrations de DAPT, un inhibiteur de la γ-secretase pan qui bloque le clivage de tous (substrats) γ-sécrétase La figure 1). Les données démontrent également que la γ-secretase dans CG andNG cellules présentés des niveaux comparables de la catalyse.
Pour valider l’efficacité de l’analyses cellulaires substrat spécifique pour les γ-sécrétase clivages, nous avons examiné les signaux de luminescence dans cellstreated CG et NG avec un inhibiteur double ErbB1/2 CL-387 785, qui s’est avérée pour moduler différemment Γ-sécrétase clivage de l’APP-C99 et NΔE21. Nous avons identifié précédemment CL-387 785 comme modulateur sélectif γ-sécrétase en raison de son interférence avec l’interaction protéine-protéine entre préséniline-1 (PS1) et C99 et absence d’interférence avec l’interaction entre la PS1 et NΔE21. Ici, les données montrent que les traitement avec CL-387 785 bloqué efficacement le traitement des APP-C99 dans les cellules CG, tandis que la protéolyse de NΔE dans les cellules NG n’a pas été affecté (Figure 2). Ces résultats démontrent l’efficacité des cellules CG et NG dans la distinction entre le clivage C99 et NΔE, dans un format qui est propice à des plates-formes de criblage à haut débit.
Figure 1 : l’essai de cellulaire γ-sécrétase APP C99-spécifique (cellules CG). Cellules de la CG ont été ensemencés sur Microplaque 96 puits (20 000 cellules/puits) durant la nuit et traitées avec 1 μM de CL-387 785 ou DAPT en présence de tétracycline 1 μg/mL à 37 ° C pendant 24 h. La luminescence dérivée de protéolyse véhiculée par γ-sécrétase C99-GV a été mesurée après l’addition du réactif d’analyse de 100 μL/puits luciférase. Le signal de la luciférase émis par les cellules traitées avec le véhicule seul (0,1 % DMSO) a été défini comme la luminescence relative de 100 %. Les données apparaissent comme la moyenne ± écart-type de trois expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : l’encoche spécifique cellulaire γ-sécrétase assay (cellules NG). Les cellules NG ont été ensemencés sur Microplaque 96 puits (20 000 cellules/puits) durant la nuit et traitées avec 1 μM de CL-387 785 ou DAPT en présence de tétracycline 1 μg/mL à 37 ° C pendant 24 h. La luminescence dérivée de protéolyse véhiculée par γ-sécrétase NΔE-GV a été mesurée après l’addition du réactif d’analyse de 100 μL/puits luciférase. Le signal de la luciférase émis par les cellules traitées avec le véhicule seul (0,1 % DMSO) a été défini comme la luminescence relative de 100 %. Les données apparaissent comme la moyenne ± écart-type de trois expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Des résultats prometteurs d’un essai de phase 1 b sur de l’immunothérapie aducanumab AD ont fermement établi le rôle essentiel des bêta-amyloïdes dans la pathogenèse des AD22 et suggèrent que les approches anti-bêta-amyloïdes sont toujours une stratégie viable pour le développement de médicaments anti-AD. Nous décrivons ici les analyses cellulaires pour quantifier la protéolyse catalysée par γ-sécrétase des APP-C99 et NΔE à l’aide de systèmes de rapporteur luciférase firefly. APP-C99 et NΔE sont les deux substrats γ-sécrétase plus étudiées et représentent ensemble les activités physiologiques et pathogènes de γ-sécrétase13. Nos conclusions que downregulation de ErbB2 par CL-387 785 peut diminuer préférentiellement les niveaux d’équilibre de APP-C99 et sécrétée Aβ sont étayée par les substrat spécifique des analyses cellulaires de la γ-secretase décrites dans la présente étude. Le protocole actuel fournit donc une approche efficace pour la découverte de nouveaux γ-sécrétase modulateurs.
Les mérites de ce paradigme d’essai substrat spécifique de γ-sécrétase sont multiformes. Par exemple, ces tests de substrat spécifique γ-sécrétase pourraient être utilisés dans un écran préliminaire pour écarter les inhibiteurs non-sélectifs γ-sécrétase potentiels de développement ultérieur et fournir une évaluation quantitative qui est pertinente pour minimiser effets secondaires potentiels. L’efficacité biologique de composés actifs identifiés par cette méthode peut ensuite être encore validée dans les cellules neuronales et des modèles animaux d’AD, comme l’a démontré récemment21. En outre, l’homogénéité des lignées cellulaires stables CG et NG est essentielle à la reproductibilité de nos résultats expérimentaux. Ce qui est important, l’expression inductible par la tétracycline de C99-GV ou NΔE-GV empêche la saturation de l’expression du rapporteur luciférase que l'on observe dans d’autres systèmes où C99 ou NΔE est exprimée constitutivement. Cette expression inductible par la tétracycline aboutit à un signal hautement fiables et cohérentes luciférase directement corrélé avec l’activité de la γ-secretase, permettant la comparaison de la γ-secretase activités de clivage entre deux différents substrats (APP-C99 versus NΔE), ou d’une expérience à l’expérience d’une manière très efficace. Afin d’obtenir les meilleurs résultats, l’activité de la solution de tétracycline doit être surveillée régulièrement (préférence une fois par mois) pour assurer une efficacité optimale de l’induction. Comme un avantage supplémentaire, l’homogénéité de ces plateformes élimine le besoin de normaliser la luciférase firefly avec l’expression constitutive Renilla luciférase. Enfin, traitant des cellules CG et NG avec 1 µM avagacestat, un inhibiteur de la γ-secretase connu de cran d’épargne, peut servir de témoin positif pour le dosage.
Une possible mise en garde de l’utilisation de la plateforme de test actuel est que la surexpression de substrats γ-sécrétase et saturation subséquente du reporter transcriptionnel dans nos essais ont certain potentiel pour masquer une activité inhibitrice et contribuer à discordants puissance inhibitrice parmi les différents dosages23. Cette complication potentielle souligne la nécessité de plateformes de test secondaires pour valider l’efficacité des inhibiteurs de la γ-sécrétase épargne encoche, tel qu’illustré récemment21. Une autre limitation potentielle de cette approche est que compte tenu de plus de 90 membrane différentes protéines ont été identifiées comme substrats γ-secretase, les plateformes de test actuelles ne fournissent pas un profil complet de sélectivité de substrat de γ-sécrétase. Le long de ces lignes, épargnant l’inhibition du clivage de l’encoche peut ne pas être la meilleure lecture permettant d’évaluer des inhibiteurs de la γ-sécrétase. Précautions doivent être prises en raison du fait qu’avagacestat, un inhibiteur de la γ-secretase encoche d’épargne, ne parvient pas à améliorer la cognition24et il est probable que l’inhibition Notch pourrait ne pas être le seul motif de toxicité associé aux inhibiteurs de la γ-secretase pan 25. l’utilité véritable de succès identifiés par cette nouvelle approche pourrait charnière sur si les inhibiteurs de la γ-secretase encoche d’épargne nouvellement identifiés possèdent des entités chimiques nouvelles qui ne sont pas présentes dans avagacestat, et si l’efficacité de ces inhibiteurs peut être validée en utilisant des modèles in vivo de AD.
En conclusion, nous croyons que l’approche présentée peut accélérer considérablement le développement des APP-C99-specific γ-sécrétase inhibiteurs/modulateurs pour l’usage clinique. Il n’y a aucun démenti qu’inhibiteurs de γ-secretase, qu’ils soient encoche d’épargne ou non, pourrait potentiellement ouvrir la toxicité chez les patients atteints de ma, ce qui conduirait à la tolérabilité indésirable et les résultats précédemment suggèrent26. Cependant, avec l’introduction de nouveaux outils chimiques et validation améliorée des régimes21, γ-sécrétase devrait continuer à être une cible attrayante de drogue en raison de sa complexité biochimique, nécessitant des études précliniques et cliniques plus à explorer ses importance de la thérapeutique en AD.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le laboratoire central de l’Institut de cellulaire et la biologie organismique, l’Academia Sinica, pour le support technique. Cette étude a été financée par le ministère de la Science et technologie, Taïwan (plus 103-2320-B-001-016-MY3 à Y.-F. L.), le programme d’Innovation translationnelle du développement biopharmaceutique – technologie supportant la plateforme Axis Scheme (NP7 à Y.-F.L.) et l’Académie chinoise des sciences (à Y.-F.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
References
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