Summary
Vi har med succes skabt to substrat-specifikke γ-secretase assays. Begge cellebaserede assays præsenteres her er designet til at kvantificere γ-secretase enzymaktiviteter via output af firefly luciferase journalister.
Abstract
Vi har udviklet et par af celle-baseret reporter gen assays til kvantitativt måle γ-secretase spaltning af forskellige substrater. Dette manuskript beskriver procedurer, der kan bruges til at overvåge γ-secretase-medieret kløvningen af enten APP-C99 eller hak, ved hjælp af en Gal4 promoter-drevet firefly luciferase reporter system. Disse assays blev etableret af stabilt Co transfecting HEK293 celler med Gal4-drevet luciferase reporter gen og enten Gal4/VP16-mærket C-terminale fragmentet af APP (APP-C99; CG celler), eller Gal4/VP16-tagged Notch-ΔE (NΔE; NG celler). Ved hjælp af disse reporter assays parallelt, vi har vist, at en ErbB2-hæmmer, CL-387,785, fortrinsvis kan undertrykke γ-secretase spaltning af APP-C99 i CG celler, men ikke NΔE i NG celler. De differentierede svar udstillet af CG og NG celler, når de behandles med CL-387,785, repræsenterer en foretrukne karakteristisk for γ-secretase modulatorer, og disse svar er i skarp kontrast til pan-hæmning af γ-secretase induceret af DAPT. Vores undersøgelser giver direkte beviser at γ-secretase aktiviteter mod forskellige substrater kan differentieres i cellulære sammenhæng. Disse nye assays kan derfor være nyttige værktøjer i drug discovery for forbedret annonce terapier.
Introduction
Oligomere former for amyloid-β (Aβ) menes at være den primære årsag til neurodegeneration i hjernen hos patienter med Alzheimers sygdom (AD)1. Aβ peptider er produceret af trinvis kløvningen af amyloid forløber protein (APP), først ved β-secretase og derefter γ-secretase2. I det seneste årti har har terapeutiske tilgange mod behandling af annonce fokuseret på forebyggelse af Aβ produktion3. Fleste undersøgelser har fokuseret på enten forøgelse af α-secretase aktivitet, som kan udelukke γ-secretase spaltning af APP og dermed mindske produktionen af Aβ eller hæmning af β-og/eller γ-secretase aktiviteter4. Desværre, ikke-selektiv hæmning af β - eller γ-secretases resultater i uundgåelige bivirkninger, der på grund af interferens med andre fysiologiske substrater af β - og γ-secretase5,6virkemåde. Med hensyn til γ-secretase hæmmere, har de seneste undersøgelser rapporteret opdagelsen af en række kemiske og genetiske modulatorer, der kan regulere Aβ produktion mens øve ubetydelig indvirkning på den væsentlige γ-secretase-medieret behandling af Notch7 ,8,9,10,11,12, men vellykket therapeutics er endnu ikke blevet udviklet. Således er yderligere systematisk skærme berettiget til at opdage nye genetiske og kemiske modifikatorer, der selektivt kan modulere γ-secretase-medieret APP behandling.
Γ-Secretase vides at kløve mere end 90 forskellige membran-forankrede proteiner. Blandt disse substrater er hak, hvis aktivitet er afgørende for celle skæbne beslutsomhed og differentiering under udvikling13. Selektivt modulerende γ-secretase-katalyseret APP forarbejdning i mangel af påvirker Notch behandling bliver afgørende for minimere Notch-relaterede bivirkninger af γ-secretase hæmmere, og denne selektivitet menes at være en primær faktor, der vil diktere den biologiske effekt af potentielle γ-secretase modulatorer til kronisk behandling af annonce. Der har været en række arylsulfonamide derivater, såsom GSI-953 (begacestat) og BMS-708163 (avagacestat), der er blevet fundet for at udstille potent og selektiv hæmning af γ-secretase14,15. En tidligere undersøgelse har vist, at den differentiale hæmning af γ-secretase spaltning af APP og hak kan observeres ved hjælp af en kvantitativ ELISA-baseret analyse i kombination med i vivo validering ved hjælp af zebrafisk16. Derudover er cellebaserede assay paradigmer etableret til at løse den potentielle substrat selektivitet af γ-secretase mod APP og hak17,18. Bruger protokoller ligner disse beskrevet heri, vi har for nylig opdaget en ny klasse af (D)-leucinamides, potent modulere γ-secretase spaltning af APP med Notch-besparende selektivitet19. Sammen, giver denne samling af undersøgelser en proof-of-concept støtte idéen om, at substrat selektivitet/tilgængelighed af γ-secretase kan være underlagt kemiske graduering og eksperimentel verifikation. Men, disse assay platforme ofte stole på relativt lav-overførselshastighed readouts og arbejdskrævende tilgange, der ikke opfylder muligvis industrielle standarder for drug discovery programmer.
Vi har for nylig genereret cellebaserede luciferase reporter gen assays, der kvantitativt kan afgøre den katalytiske aktivitet af γ-secretase mod to forskellige substrater, den 99-amino syre C-terminale fragment af APP (APP-C99) og den ekstracellulære domæne-slettet Notch peptid (NΔE). Både APP-C99 og NΔE har været meget anvendt som direkte substrater af γ-secretase i forskellige assays. For at generere homogen og sammenhængende luciferase reporter gen assays til γ-secretase kløvningen af enten APP-C99 eller NΔE, genereret vi en HEK-afledte stabil cellelinje (CG), som constitutively udtrykker en Gal4 promoter-drevet firefly luciferase reporter ( Gal4-Luc) og Gal4/VP16-tagget APP-C99 fusion protein (C99-GV). Derudover genereret vi en anden HEK-afledte stabil cellelinje (NG) som constitutively udtrykker Gal4-Luc og Gal4/VP16-mærket NΔE (NΔE-GV). Brug disse roman substrat-specifikke γ-secretase assays, give vi nu en metode til at kvantificere og skelne den katalytiske aktivitet af γ-secretase mod forskellige substrater (APP-C99 i CG celler), eller NΔE i NG celler. Derudover blev substrat-specifikke γ-secretase assays designet til at være befordrende for high-indhold screening platforme. Disse nyligt genererede γ-secretase assays kunne bane vejen for opdagelsen af roman γ-secretase modulatorer, som kunne forbedre kognitive funktion ved at undertrykke Aβ produktion uden at fremkalde uønskede Notch hæmning for næste generations behandling af annonce.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. måling af Luciferase Reporter signaler, som svarer til γ-Secretase spaltning af APP-C99 eller NΔE
Bemærk: Der henvises til tidligere publikationer for detaljerede beskrivelser af generation af CG og NG celler20,21.
-
Seed NG eller CG celler (20, 000 celler/brønd) på 96-brønd mikroplader på en endelige mængden af 200 μl/brønd i vækstmedium, der er sammensat af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) plus 10% føtal bovint serum (FBS), 5 μg/mL blasticidin, 250 μg/mL antibiotikum (f.eks. zeocin), og 200 μg/mL hygromycin B.
- Tælle celler med en hemocytometer.
- Overføre mikroplader til en befugtet CO2 inkubator og inkuberes ved 37 ° C natten over.
- Fjern 100 μL af vækstmediet fra hver brønd.
- Tilføj 100 μL/brønd af vækst medium, der indeholder 2 μg/mL tetracyclin med enten 0,2% dimethylsulfoxid (DMSO), 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT), eller andre relaterede ErbB1/ErbB2 hæmmere.
- Inkuber behandlede CG eller NG celler i mikroplader ved 37 ° C i 24 timer.
- Fjerne 150 μl/brønd vækstmediet fra mikroplader.
- Tilføje 50 μL/brønd luciferase assay reagens (Se Tabel af materialer).
-
Overføre mikroplader til en luminescence mikrotiterplade læser.
- Vedligeholde mikroplader ved stuetemperatur i 5 min. med blid agitation.
-
Bestemme Firefly luciferase (FL)-udsendes luminescence ved hjælp af en foruddefineret program gemt i luminescence mikrotiterplade læser.
- Åbn instrument kontrol software (Se Tabel af materialer til instrument detaljer).
- Vælg 'Luminometry' i menuen 'Værktøj'.
- Vælg 'Intet filter' for Emission Filter, kryds 'Normal' for Emission blænde, indtaste '1' for tælle tid under indstillingerne 'Parametre', og klik på 'OK' for at oprette luminescence læsningen.
- Rul gennem listen over aktive protokoller under fanen 'Instrument kontrol', og vælg allerede gemte protokollen for læsning luminescens.
- Under fanen 'Live visning' definere skala fra pull-down listen, og vælg 'Logaritme' eller 'Lineær' for typen.
- Vælg 'Off' for plade varme under fanen 'Temperatur'.
- Klik på knappen 'Start' for at udføre den luminescence læsning.
- Efter behov, eksportere resultaterne ind i et spreadsheet-formatet ved hjælp af 'Explorer' indlejret i control-software.
2. kvantificering af γ-Secretase aktivitet
-
Definere en luminescence signalet udsendes af CG eller NG celler behandles med 0,1% DMSO i vækstmediet indeholdende 1 μg/mL tetracyclin alene som 100% relativ γ-secretase aktivitet.
- Skøn baggrund luminescence fra CG eller NG celler ved behandling af celler med vækstmedium, der ikke omfatter tetracyclin.
- Normalisere luciferase signaler fra CG eller NG celler, der er kulturperler med vækstmediet indeholdende 1 μg/mL tetracyclin og enten 1 μM CL-387,785 eller 1 μM af DAPT med luciferase signalet udsendes af DMSO-behandlede CG eller NG celler (100% relativ γ-secretase aktivitet, som defineret i punkt 2.1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hæmning af ErbB2 af CL-387,785 kan varierende fremme behandlingen af APP-C99 af Γ -secretase uden at påvirke Notch kavalergang
For at etablere en celle-baserede analyse, som kvantitativt kan måle proteolytiske kløvningen af en bestemt γ-secretase substrat, genereret vi linjen HEK293-afledte CG celle af stabil Co Transfektion af en tetracyklin-inducerbar C-uhelbredeligt Gal4/VP16-mærket APP-C99 og en Gal4 promoter-drevet firefly luciferase reporter gen. En parallel NG cellelinje blev også etableret til assay for γ-secretase spaltning af NΔE. I NG celler var en tetracyklin-inducerbar C-terminal Gal4/VP16-mærket NΔE og en Gal4 promoter-drevet luciferase reporter gen stabilt Co transfected ind i HEK293 celler. Γ-secretase spaltning af APP-C99 i CG celler og γ-secretase spaltning af NΔE i NG celler blev først bekræftet ved at behandle CG og NG celler med forskellige koncentrationer af DAPT, en pan γ-secretase-hæmmer, som blokerer kløvningen af alle γ-secretase substrater ( Figur 1). Data viste også at γ-secretase i CG andNG celler udstillet sammenlignelige niveauer af katalyse.
For at validere effektiviteten af substrat-specifikke cellebaserede assays til γ-secretase splittelser, undersøgte vi luminescence signaler i CG og NG cellstreated med en ErbB1/2 dual hæmmer CL-387,785, som har vist sig at varierende modulere Γ-secretase spaltning af APP-C99 og NΔE21. Vi har tidligere identificeret CL-387,785 som en selektiv γ-secretase modulator på grund af dets indblanding med protein-protein interaktion mellem presenilin-1 (PS1) og C99 og manglende interferens med samspillet mellem PS1 og NΔE21. Her, data viser at behandling med CL-387,785 effektivt blokeret behandling af APP-C99 i CG celler, hvorimod proteolyse af NΔE i NG celler ikke var påvirket (figur 2). Disse resultater viser effektiviteten af CG og NG celler skelne mellem C99 og NΔE spaltning, i et format, der er befordrende for high throughput screening platforme.
Figur 1: APP C99 specifikke cellulære γ-secretase analyse (CG celler). CG celler var seedet på 96-brønd mikroplader (20.000 celler/brønd) natten over og behandles med 1 μM af CL-387,785 eller DAPT i nærværelse af 1 μg/mL tetracyclin ved 37 ° C i 24 timer. Luminescence afledt af γ-secretase-medieret proteolyse af C99-GV var kvantificeret efter tilsætning af 100 μL/brønd luciferase assay reagens. Luciferase signalet udsendes af celler behandles med køretøjet alene (0,1% DMSO) blev sat som 100% relativ luminescens. Data er vist som gennemsnit ± SD fra tre uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: hak-specifikke cellulære γ-secretase analyse (NG celler). NG celler var seedet på 96-brønd mikroplader (20.000 celler/brønd) natten over og behandles med 1 μM af CL-387,785 eller DAPT i nærværelse af 1 μg/mL tetracyclin ved 37 ° C i 24 timer. Luminescence afledt af γ-secretase-medieret proteolyse af NΔE-GV var kvantificeret efter tilsætning af 100 μL/brønd luciferase assay reagens. Luciferase signalet udsendes af celler behandles med køretøjet alene (0,1% DMSO) blev sat som 100% relativ luminescens. Data er vist som gennemsnit ± SD fra tre uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De lovende resultater fra en fase 1b studie af aducanumab immunterapi for annonce har fast etableret Aβ kritiske rolle i patogenesen af annonce22 og foreslår, at anti-Aβ tilgange er stadig en levedygtig strategi for udvikling af anti-annonce narkotika. Her beskriver vi cellebaserede assays til kvantificering af γ-secretase-katalyseret proteolyse af APP-C99 og NΔE ved hjælp af firefly luciferase reporter systemer. APP-C99 og NΔE er de to mest velundersøgte γ-secretase substrater og repræsenterer sammen både patogene og fysiologiske aktiviteter af γ-secretase13. Vores resultater, downregulation af ErbB2 af CL-387,785 kan fortrinsvis reducere steady state niveauer af APP-C99 og udskilles Aβ er yderligere underbygget af substrat-specifikke cellulære assays af γ-secretase beskrevet i den nuværende undersøgelse. Den nuværende protokol giver således en effektiv tilgang til opdagelsen af nye γ-secretase modulatorer.
Berettigelsen af denne γ-secretase substrat-specifikke assay paradigme er mangesidet. For eksempel, kunne disse substrat-specifikke γ-secretase assays udnyttes i en indledende skærm at udelukke potentielle ikke-selektiv γ-secretase hæmmere fra videreudvikling, og give en kvantitativ vurdering, der er relevante at minimere potentielle bivirkninger. Den biologiske effekt af aktive stoffer identificeret fra denne metode kan derefter yderligere valideres i neuronale celler og dyremodeller annonce, som påvist i seneste21. Derudover er homogeniteten af CG og NG stabil cellelinjer kritisk at reproducerbarhed af vores eksperimentelle resultater. Vigtigere, forhindrer at tetracyklin-inducerbar udtryk for C99-GV eller NΔE-GV effektivt mætning luciferase reporter udtryk, der er set i andre systemer, hvor C99 eller NΔE udtrykkes constitutively. Tetracyclin-inducerbar udtrykket resulterer i en meget pålidelig og konsekvent luciferase signal, der direkte korrelerer med γ-secretase aktivitet, tillader sammenligning af γ-secretase kavalergang aktiviteter mellem to forskellige substrater (APP-C99 versus NΔE), eller fra forsøg til eksperiment i en yderst effektiv måde. For at opnå de bedste resultater, aktiviteten af tetracyklin løsning bør overvåges periodisk (helst en gang om måneden) til at sikre optimal induktion effektivitet. Som en ekstra fordel eliminerer homogeniteten af disse platforme behovet for normalisering firefly luciferase med konstitutiv Renilla luciferase udtryk. Endelig kan behandling af CG og NG celler med 1 µM avagacestat, en kendt Notch-besparende γ-secretase hæmmer, tjene som positiv kontrol for analysen.
En mulig advarsel for at bruge den nuværende assay platform er at overekspression af γ-secretase substrater og efterfølgende mætning af transcriptional reporter i vores assays har nogle potentiale for at maskere hæmmende aktivitet og bidrage til afvigende hæmmende potens blandt forskellige assays23. Denne potentielle komplikation understreger behovet for sekundære assay platforme til at validere effekten af hak-besparende γ-secretase hæmmere, som for nylig vist21. En anden potentiel begrænsning af denne tilgang er, at da mere end 90 forskellige membran proteiner er blevet identificeret som γ-secretase substrater, de nuværende assay platforme ikke giver en komplet profil af γ-secretase substrat selektivitet. Langs disse linjer, kan besparende hæmning af Notch spaltning ikke være den bedste udlæsning til at evaluere γ-secretase hæmmere. Forsigtighed bør tages som følge af, at avagacestat, en hak-besparende γ-secretase hæmmer, undlader at forbedre kognition24, og det er sandsynligt, at Notch hæmning ikke kan være det eneste grundlag for toksicitet forbundet med pan γ-secretase hæmmere 25. den sande nytte af hits identificeres af denne nye tilgang kunne hængsel på, hvis de nyligt identificerede Notch-besparende γ-secretase hæmmere besidder roman kemiske enheder, der ikke findes i avagacestat, og hvis effekten af disse hæmmere kan være valideret ved brug i vivo modeller af annonce.
Afslutningsvis mener vi, at den præsenterede tilgang meget kan fremskynde udviklingen af APP-C99-specifikke γ-secretase hæmmere/modulatorer til klinisk brug. Der er ingen benægtelse at γ-secretase hæmmere, uanset om de er Notch-besparende eller ej, kunne potentielt indlede toksicitet i AD patienter, hvilket ville føre til uønskede tolerabilitet og resultater som tidligere foreslået26. Men med indførelsen af nye kemiske værktøjer og forbedret validering ordninger21, γ-secretase fortsat skal være et tiltrækkende drug mål på grund af dens biokemiske kompleksitet, der kræver flere prækliniske og kliniske undersøgelser for at udforske dens terapeutiske relevans i Annoncen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Core facilitet af Institut for Cellulær og organismens biologi, Academia Sinica, for teknisk support. Denne undersøgelse blev støttet af Ministeriet for videnskab og teknologi, Taiwan (mest 103-2320-B-001-016-MY3 til Y.-F. L.), programmet for Translationel Innovation af biofarmaceutiske udvikling – teknologi støtte Platform akse ordning (NP7 til Y.-F.L.), og Academia Sinica (til Y.-F.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
References
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
- Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. APP at a glance. J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).
- Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
- Citron, M. Alzheimer's disease: strategies for disease modification. Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).
- Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer's disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential. J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).
- Parks, A. L., Curtis, D. Presenilin diversifies its portfolio. Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).
- Kukar, T. L., et al. Substrate-targeting gamma-secretase modulators. Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).
- Kounnas, M. Z., et al. Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).
- Thathiah, A., et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons. Science. 323 (5916), 946-951 (2009).
- Flajolet, M., et al. Regulation of Alzheimer's disease amyloid-beta formation by casein kinase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).
- Eisele, Y. S., et al. Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin. Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).
- He, G., et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer's disease. Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).
- Haapasalo, A., Kovacs, D. M. The many substrates of presenilin/gamma-secretase. J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).
- Gillman, K. W., et al. Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).
- Hopkins, C. R. ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953). ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).
- Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein. Mol Brain. 1, 15 (2008).
- McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates. J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).
- Basi, G. S., et al. Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer's disease. Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36 (2010).
- Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators. Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).
- Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).
- Wang, B. J., et al. ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).
- Sevigny, J., et al. The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer's disease. Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).
- Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. gamma-Secretase inhibitors and modulators. Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).
- Coric, V., et al. Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial. JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).
- Mitani, Y., et al. Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice. J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).
- Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer's Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).
