Summary

מדידה כמותית של חלבונים וγ Secretase-בתיווך קודמן עמילואיד, המחשוף דרגה ב מבוססת תא לוציפראז כתב Assay פלטפורמות

Published: January 25, 2018
doi:

Summary

יש לנו בהצלחה שנוצר שני מבחני המצע ספציפיים γ-secretase. שני מבחני מבוססת תא המובאת כאן נועדו לכמת פעילויות אנזימטיות γ-secretase דרך הפלט של גחלילית לוציפראז כתבים.

Abstract

פיתחנו זוג כתב מבוססת תא מבחני ג’ין למדוד באופן כמותי את המחשוף γ-secretase של סובסטרטים ברורים. כתב יד זה מתאר הליכים בהם ניתן לעקוב אחר γ secretase-בתיווך המחשוף של APP-C99 או חריץ, באמצעות Gal4 מונחה יזם גחלילית לוציפראז כתב מערכת. מבחני אלה הוקמו על ידי stably משותפת transfecting תאים HEK293 עם הגן כתב לוציפראז מונחה-Gal4, או הרסיס Gal4/VP16-מתויגים ‘ C-מסוף של האפליקציה (APP-C99; תאים CG), או את Gal4/VP16-מתויגים ‘ החריץ-ΔE (NΔE; NG תאים). באמצעות אלה מבחני כתב במקביל, הראו כי מעכב ErbB2, CL-387,785, מעדיפים יכול לדכא γ-secretase המחשוף של APP-C99 בתאים CG, אבל לא NΔE בתאים NG. התגובות דיפרנציאלית הוצגו על ידי התאים CG ו- NG, כאשר מטופלים עם CL-387,785, מייצגים מאפיין המועדפת עבור γ-secretase מאפננים, תגובות אלה הן בניגוד הפאן-עיכוב של γ-secretase המושרה על ידי DAPT. המחקרים שלנו מספקים עדות ישירה כי ניתן להבחין γ-secretase פעילויות לקראת סובסטרטים בהקשר הסלולר. מבחני חדשים אלה ולכן ייתכן כלים שימושיים, גילוי תרופות טיפולים לספירה משופרת.

Introduction

צורות oligomeric של עמילואיד-β (Aβ) מאמינים כי הגורם העיקרי הקשורים ניוון מוחיים במוחם של חולים הסובלים מחלת אלצהיימר (AD)1. Aβ פפטידים מופקים על ידי המחשוף stepwise של חלבון עמילואיד קודמן (APP), תחילה לפי β-secretase ולאחר מכן ב- γ-secretase2. בעשור האחרון, גישות טיפוליות כלפי הטיפול של המודעה התמקדו למניעת ייצור Aβ3. הרוב המכריע של המחקרים התמקדו גם הגדלת הפעילות α-secretase, אשר ניתן למנוע γ-secretase המחשוף של APP, ובכך להקטין את הייצור של Aβ, או עיכוב של פעילויות β-ו/או γ-secretase4. למרבה הצער, לא בררניים עיכוב של β – או γ-secretases תוצאות תופעות לוואי בלתי נמנע כי הם עקב הפרעה תפקוד אחרים סובסטרטים פיזיולוגיים של β – ו γ-secretase5,6. לגבי מעכבי γ-secretase, מחקרים שנעשו לאחרונה דיווחו על הגילוי של מספר מאפננים כימי, גנטיים המווסתים Aβ הייצור תוך הפעלת אפקטים זניח על עיבוד וγ secretase-בתיווך חיוני חריץ7 ,8,9,10,11,12, עם זאת, הרפוי מוצלחת עדיין לא פותחו. לפיכך, בהמשך מסכי שיטתית הן מוצדקת לגלות מכפילי גנטי וכימיים הרומן זה באופן סלקטיבי יכול לווסת את עיבוד APP וγ secretase-בתיווך.

Γ-Secretase ידוע קליב יותר מ-90 חלבונים שונים המעוגנת ממברנה. בין אלה סובסטרטים הוא חריץ, שפעילותם היא קריטית עבור תא בנחישות גורל ובידול במהלך פיתוח13. באופן סלקטיבי להתכוונן APP וγ-secretase-מזורז עיבוד בהיעדרו של להשפיע על הרמה עיבוד יהיה חיוני ומזעור הקשורות חריץ תופעות לוואי של מעכבי γ-secretase, סלקטיביות זו נחשבת גורם העיקרי יהיה להכתיב את היעילות הביולוגי של פוטנציאל מאפננים γ-secretase לטיפול כרוני של המודעה. היו מספר נגזרות arylsulfonamide, כגון GSI-953 (begacestat) ועב מ- 708163 (avagacestat), נמצאו שהפגינו עיכוב חזק, סלקטיבי של γ-secretase14,15. מחקר קודם הראה כי עיכוב דיפרנציאלית של פצילות γ-secretase של האפליקציה, חריץ יכול להיות שנצפו שימוש assay מבוסס-אליסה כמותית בשילוב עם ויוו אימות באמצעות דג זברה16. יתר על כן, פרדיגמות assay מבוססת תא הוקמו לפנות את מידת הבררנות המצע פוטנציאלי של γ-secretase לכיוון APP ודרגה17,18. באמצעות פרוטוקולים דומה מהמתואר בזאת, לאחרונה גילינו מחלקה הרומן של (D)-leucinamides זה מנע בעוצמה לווסת את המחשוף γ-secretase של האפליקציה עם סלקטיביות ממעט דרגה19. יחד, זה אוסף של מחקרים מספק הוכחה-של-קונספט תומך התפישה. המצע סלקטיביות/הזמינות של γ-secretase יכול להיות כפופים אפנון כימי ואימות ניסיוני. עם זאת, פלטפורמות assay אלה מסתמכים בדרך כלל על המפרט תפוקה נמוכה יחסית וגישות מהגידולים שלא יכול לעמוד תקני התעשייה לתוכניות גילוי סמים.

יש לנו לאחרונה שנוצר לוציפראז מבוססת תא כתב ג’ין מבחני שיכול לקבוע באופן כמותי את פעילות קטליטית γ-secretase כלפי שני מצעים שונים, הרסיס C-מסוף חומצה אמינו 99 של האפליקציה (APP-C99) חוץ-תאית תחום שנמחקו חריץ פפטיד (NΔE). APP-C99 וגם NΔE היה בשימוש נרחב בשם דיאלקטריים ישירה של γ-secretase במבחני שונות. כדי ליצור הומוגניות ועקבית לוציפראז כתב ג’ין מבחני למחשוף γ-secretase של APP-C99 או NΔE, יצרנו נגזר HEK תא יציב שורה אחת (CG) המבטאת צורונים (כתב Gal4 לוציפראז מונחה יזם גחלילית Gal4-Luc), חלבון כימרי Gal4/VP16-מתויג APP-C99 (C99-GV). בנוסף, יצרנו עוד קו נגזר HEK תא יציב (NG) המבטאת צורונים Gal4-לוק ו מתויג-Gal4/VP16 NΔE (NΔE-GV). אנחנו עכשיו באמצעות מבחני הרומן המצע ספציפיים γ-secretase אלה, מספקות שיטה לכמת, להבחין בין פעילות קטליטית γ-secretase לכיוון סובסטרטים שונים (APP-C99 בתאים CG), או NΔE בתאים NG. יתר על כן, מבחני המצע ספציפיים γ-secretase נועדו תוליחתמ פלטפורמות הקרנה גבוהה-תוכן. מבחני החדש שנוצר γ-secretase אלה יכול לסלול את הדרך עבור גילוי מאפננים γ הרומן-secretase יכול לשפר את התפקוד הקוגניטיבי על-ידי דיכוי ייצור Aβ ללא העלאת עיכוב דרגה בלתי רצויים לטיפול הדור הבא של AD.

Protocol

1. מדידה של אותות כתב לוציפראז, אשר תואמות את המחשוף γ-Secretase של APP-C99 או NΔE הערה: נא עיין על פרסומים קודמים על תיאורים מפורטים של הדור של CG ו NG תאים20,21. זרע תאים NG או CG (20, 000 תאים/טוב) על גבי microplates 96-ובכן-נפח סופי של 200 μL היטב במדיום הגידול ה?…

Representative Results

עיכוב של ErbB2 מאת CL-387,785 באופן שונה יכול לקדם את העיבוד של APP-C99 על ידי Γ -secretase מבלי להשפיע על הרמה המחשוףלהקים assay מבוססת תא שיכול למדוד באופן כמותי את המחשוף הפרוטאוליטי של מצע מסוים γ-secretase, יצרנו את שורת התאים CG נגזר HEK293 על ידי תרביות תאים שותף …

Discussion

מבטיח תוצאות ממשפט בשלב 1b של חיסוני aducanumab עבור לספירה הקימו בחוזקה את תפקיד קריטי Aβ בפתוגנזה של המודעה22 ולהציע כי גישות אנטי-Aβ הם עדיין אסטרטגיה קיימא עבור הפיתוח של תרופות אנטי-לספירה. כאן, אנו מתארים מבוססת תא מבחני לכימות תנועת proteolysis γ-secretase-מזורז של APP-C99 ו- NΔE שימוש גחלילי?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים המתקן הליבה של המכון של הסלולר, ביולוגיה אורגניזם, אקדמיה Sinica, על תמיכה טכנית. מחקר זה נתמך על ידי משרד המדע, הטכנולוגיה, טייוואן (ביותר 103-2320-B-001-016-MY3 עד י’-F. ל’), התוכנית לחדשנות Translational ההתפתחות ביולוגיות – טכנולוגיית התומכת פלטפורמה ציר ערכת (NP7 ל י’-F.L.), ו Sinica אקדמיה (לי’-F.L.).

Materials

VictorLight luminescence plate reader PerkinElmer 2030-0010
Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet Thermo Scientific 1300 Series A2
CL-387,785 EMD Calbiochem 233100-1MG
DAPT Merck 565770
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher 12100046 main compnent of growth medium
Fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher 16000044
Blasticidin Thermo Fisher A1113903
Zeocin Thermo Fisher R25005
Hygromycin B Gibco 10687010
Hemocytomer Sigma-Aldrich BR717805 Aldrich
96-well microplate Nunc 156545
Tetracycline Sigma T7660
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Steady-Glo luciferase assay reagent Promega E2510
Humidified CO2 incubator Revco Ultima II
T-REx293 cell line Invitrogen R71007
Wallac 1420 software version 3.0 PerkinElmer instrument control software of the luminescence microplate reader

References

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease at 25 years. EMBO Mol Med. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Wolfe, M. S., Guenette, S. Y. APP at a glance. J Cell Sci. 120 (Pt 18), 3157-3161 (2007).
  3. Karran, E., Mercken, M., De Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer’s disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
  4. Citron, M. Alzheimer’s disease: strategies for disease modification. Nat Rev Drug Discov. 9 (5), 387-398 (2010).
  5. Vassar, R., Kovacs, D. M., Yan, R., Wong, P. C. The beta-secretase enzyme BACE in health and Alzheimer’s disease: regulation, cell biology, function, and therapeutic potential. J Neurosci. 29 (41), 12787-12794 (2009).
  6. Parks, A. L., Curtis, D. Presenilin diversifies its portfolio. Trends Genet. 23 (3), 140-150 (2007).
  7. Kukar, T. L., et al. Substrate-targeting gamma-secretase modulators. Nature. 453 (7197), 925-929 (2008).
  8. Kounnas, M. Z., et al. Modulation of gamma-secretase reduces beta-amyloid deposition in a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. Neuron. 67 (5), 769-780 (2010).
  9. Thathiah, A., et al. The orphan G protein-coupled receptor 3 modulates amyloid-beta peptide generation in neurons. Science. 323 (5916), 946-951 (2009).
  10. Flajolet, M., et al. Regulation of Alzheimer’s disease amyloid-beta formation by casein kinase I. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 4159-4164 (2007).
  11. Eisele, Y. S., et al. Gleevec increases levels of the amyloid precursor protein intracellular domain and of the amyloid-beta degrading enzyme neprilysin. Mol Biol Cell. 18 (9), 3591-3600 (2007).
  12. He, G., et al. Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer’s disease. Nature. 467 (7311), 95-98 (2010).
  13. Haapasalo, A., Kovacs, D. M. The many substrates of presenilin/gamma-secretase. J Alzheimers Dis. 25 (1), 3-28 (2011).
  14. Gillman, K. W., et al. Discovery and Evaluation of BMS-708163, a Potent, Selective and Orally Bioavailable gamma-Secretase Inhibitor. ACS Med Chem Lett. 1 (3), 120-124 (2010).
  15. Hopkins, C. R. ACS chemical neuroscience molecule spotlight on Begacestat (GSI-953). ACS Chem Neurosci. 3 (1), 3-4 (2012).
  16. Yang, T., Arslanova, D., Gu, Y., Augelli-Szafran, C., Xia, W. Quantification of gamma-secretase modulation differentiates inhibitor compound selectivity between two substrates Notch and amyloid precursor protein. Mol Brain. 1, 15 (2008).
  17. McKee, T. D., Loureiro, R. M., Dumin, J. A., Zarayskiy, V., Tate, B. An improved cell-based method for determining the gamma-secretase enzyme activity against both Notch and APP substrates. J Neurosci Methods. 213 (1), 14-21 (2013).
  18. Basi, G. S., et al. Amyloid precursor protein selective gamma-secretase inhibitors for treatment of Alzheimer’s disease. Alzheimers Res Ther. 2 (6), 36 (2010).
  19. Liao, Y. F., Tang, Y. C., Chang, M. Y., Wang, B. J., Hu, M. K. Discovery of small molecular (D)-leucinamides as potent, Notch-sparing gamma-secretase modulators. Eur J Med Chem. 79, 143-151 (2014).
  20. Liao, Y. F., Wang, B. J., Cheng, H. T., Kuo, L. H., Wolfe, M. S. Tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1beta, and interferon-gamma stimulate gamma-secretase-mediated cleavage of amyloid precursor protein through a JNK-dependent MAPK pathway. J Biol Chem. 279 (47), 49523-49532 (2004).
  21. Wang, B. J., et al. ErbB2 regulates autophagic flux to modulate the proteostasis of APP-CTFs in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3129-E3138 (2017).
  22. Sevigny, J., et al. The antibody aducanumab reduces Abeta plaques in Alzheimer’s disease. Nature. 537 (7618), 50-56 (2016).
  23. Golde, T. E., Koo, E. H., Felsenstein, K. M., Osborne, B. A., Miele, L. gamma-Secretase inhibitors and modulators. Biochim Biophys Acta. 1828 (12), 2898-2907 (2013).
  24. Coric, V., et al. Targeting Prodromal Alzheimer Disease With Avagacestat: A Randomized Clinical Trial. JAMA Neurol. 72 (11), 1324-1333 (2015).
  25. Mitani, Y., et al. Differential effects between gamma-secretase inhibitors and modulators on cognitive function in amyloid precursor protein-transgenic and nontransgenic mice. J Neurosci. 32 (6), 2037-2050 (2012).
  26. Penninkilampi, R., Brothers, H. M., Eslick, G. D. Pharmacological Agents Targeting gamma-Secretase Increase Risk of Cancer and Cognitive Decline in Alzheimer’s Disease Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. J Alzheimers Dis. 53 (4), 1395-1404 (2016).

Play Video

Cite This Article
Wang, B., Wu, P., Chen, Y., Chang, Y., Bhore, N., Wu, P., Liao, Y. Quantitative Measurement of γ-Secretase-mediated Amyloid Precursor Protein and Notch Cleavage in Cell-based Luciferase Reporter Assay Platforms. J. Vis. Exp. (131), e56795, doi:10.3791/56795 (2018).

View Video