Summary
हम सफलतापूर्वक दो सब्सट्रेट-विशिष्ट γ-secretase परख उत्पंन किया है । दोनों सेल आधारित परख यहां प्रस्तुत γ यों तो जुगनू luciferase पत्रकारों के उत्पादन के माध्यम से secretase एंजाइमी गतिविधियों के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं ।
Abstract
हम सेल के एक जोड़ी विकसित किया है रिपोर्टर जीन परख मात्रात्मक मापने के लिए γ-secretase दरार अलग सब्सट्रेट के । इस पांडुलिपि प्रक्रियाओं है कि γ-secretase-या तो अनुप्रयोग की मध्यस्थता दरार-C99 या पायदान, एक Gal4 प्रमोटर चालित जुगनू luciferase रिपोर्टर प्रणाली का उपयोग कर की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वर्णन करता है । इन परख Gal4 के साथ छुरा सह transfecting HEK293 कोशिकाओं द्वारा स्थापित किया गया luciferase रिपोर्टर जीन और या तो Gal4/VP16-टैग सी-अनुप्रयोग के टर्मिनल टुकड़ा (app-C99; तटरक्षक कोशिकाओं), या Gal4/VP16-tagged पायदान-ΔE (NΔE; एनजी कोशिकाओं) । समानांतर में इन रिपोर्टर परख का प्रयोग, हम प्रदर्शन किया है कि एक ErbB2 अवरोध करनेवाला, सीएल-३८७,७८५, तरजीही γ-अनुप्रयोग के secretase दरार-तटरक्षक कोशिकाओं में C99, लेकिन नहीं एनजी कोशिकाओं में NΔE को दबा सकते हैं । अंतर सीजी और एनजी कोशिकाओं द्वारा प्रदर्शित, जब सीएल-३८७,७८५ के साथ इलाज किया, γ-secretase मॉडुलन के लिए एक पसंदीदा विशेषता का प्रतिनिधित्व करते हैं, और इन प्रतिक्रियाओं पैन के विपरीत में कर रहे हैं-γ के निषेध-secretase DAPT द्वारा प्रेरित । हमारे अध्ययन प्रत्यक्ष सबूत है कि विभिंन सब्सट्रेट की ओर γ-secretase गतिविधियों एक सेलुलर संदर्भ में विभेदित किया जा सकता है प्रदान करते हैं । इन नए परख इसलिए बेहतर विज्ञापन चिकित्सा के लिए दवा की खोज में उपयोगी उपकरण हो सकता है ।
Introduction
amyloid-β (Aβ) के Oligomeric रूपों अल्जाइमर रोग (AD)1से पीड़ित रोगियों के दिमाग में neurodegeneration का प्राथमिक कारण माना जाता है । Aβ पेप्टाइड्स amyloid के प्रणेता प्रोटीन (एपीपी) के stepwise दरार द्वारा उत्पादित कर रहे हैं, पहले β-secretase द्वारा और फिर γ-secretase2। पिछले दशक में, विज्ञापन के उपचार की ओर चिकित्सीय दृष्टिकोण Aβ उत्पादन की रोकथाम पर ध्यान केंद्रित किया है3. अध्ययन के बहुमत या तो α-secretase गतिविधि है, जो अनुप्रयोग के γ-secretase क्लीवेज बाधा कर सकते हैं की वृद्धि पर ध्यान केंद्रित किया है और इस तरह Aβ के उत्पादन में कमी, या β के निषेध-और/या γ-secretase क्रियाएं4। दुर्भाग्य से, β-या γ-secretase के अन्य शारीरिक सब्सट्रेट के कामकाज के साथ हस्तक्षेप की वजह से कर रहे हैं कि अपरिहार्य दुष्प्रभावों में γ-secretases परिणाम के गैर-चयनात्मक निषेध--और,6. γ-secretase अवरोधकों के संबंध में, हाल के अध्ययनों से रासायनिक और आनुवंशिक मॉडुलन की एक संख्या है कि Aβ उत्पादन को विनियमित जबकि आवश्यक γ-secretase-7 पायदान के मध्यस्थता प्रसंस्करण पर नगण्य प्रभाव डालती कर सकते हैं की खोज की सूचना दी है ,8,9,10,11,12, तथापि, सफल चिकित्सकीय अभी तक विकसित नहीं किया गया है । इस प्रकार, आगे व्यवस्थित स्क्रीन γ-secretase मध्यस्थता एप्लिकेशन प्रसंस्करण चुन सकते हैं कि उपन्यास आनुवंशिक और रासायनिक संशोधक की खोज करने के लिए वारंट कर रहे हैं.
γ-Secretase से अधिक ९० अलग झिल्ली लंगर प्रोटीन से सट जाना जाता है । इन सब्सट्रेट के बीच पायदान है, जिनकी गतिविधि सेल भाग्य दृढ़ संकल्प और विकास के दौरान भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है13. चुनिंदा मॉडुलन γ-secretase-catalyzed APP प्रसंस्करण पायदान प्रसंस्करण को प्रभावित करने के अभाव में γ-secretase अवरोधकों के पायदान से संबंधित दुष्प्रभावों को कम करने के लिए आवश्यक हो जाएगा, और इस selectivity एक प्राथमिक कारक है कि होगा सोचा है विज्ञापन के जीर्ण उपचार के लिए संभावित γ-secretase संग्राहक की जैविक प्रभावकारिता का हुक्म । ऐसे जीएसआई के रूप में arylsulfonamide डेरिवेटिव, की एक संख्या रहे हैं-९५३ (begacestat) और बीएमएस-७०८१६३ (avagacestat), कि γ के शक्तिशाली और चयनात्मक निषेध प्रदर्शन पाया गया है-secretase14,15। एक पिछले अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि γ की विभेदक निषेध-APP और पायदान के secretase दरार एक मात्रात्मक एलिसा का उपयोग कर देखा जा सकता है-के साथ संयोजन में परख आधारित vivo में मांयता zebrafish16का उपयोग कर । इसके अलावा, सेल-परख मानदंड आधारित स्थापित किया गया है संभावित सब्सट्रेट selectivity का पता करने के लिए γ-secretase ओर APP और पायदान17,18. प्रोटोकॉल का उपयोग यहां वर्णित उन लोगों के समान है, हम हाल ही में (डी) के एक उपंयास वर्ग की खोज की है-leucinamides है कि शक्तिशाली γ-secretase दरार APP की पायदान के साथ selectivity19बख्शना । एक साथ, अध्ययन के इस संग्रह धारणा है कि सब्सट्रेट selectivity/γ-secretase की उपलब्धता रासायनिक मॉडुलन और प्रयोगात्मक सत्यापन के अधीन किया जा सकता है का समर्थन अवधारणा एक सबूत प्रदान करता है । हालांकि, इन परख प्लेटफार्मों अक्सर अपेक्षाकृत कम प्रवाह readouts और श्रम गहन दृष्टिकोण है कि दवा खोज कार्यक्रमों के लिए औद्योगिक मानकों को पूरा नहीं हो सकता है पर भरोसा करते हैं ।
हम हाल ही में उत्पंन सेल आधारित luciferase रिपोर्टर जीन परख है कि मात्रात्मक दो अलग सब्सट्रेटों की ओर γ-secretase की उत्प्रेरक गतिविधि निर्धारित कर सकते हैं, ९९-एमिनो एसिड सी-app के टर्मिनल टुकड़ा (app-C99) और extracellular डोमेन-हटाए गए पायदान पेप्टाइड (NΔE) । दोनों अनुप्रयोग-C99 और NΔE व्यापक रूप से विभिंन परख में γ-secretase के प्रत्यक्ष सब्सट्रेट के रूप में इस्तेमाल किया गया है । γ के लिए सजातीय और लगातार luciferase रिपोर्टर जीन परख उत्पंन करने के लिए या तो अनुप्रयोग के secretase दरार-C99 या NΔE, हम एक HEK उत्पंन स्थिर सेल लाइन (तटरक्षक) है कि constitutively एक Gal4 प्रमोटर-चालित जुगनू luciferase रिपोर्टर व्यक्त ( Gal4-ल्यूक) and Gal4/VP16-tagged APP-C99 फ्यूजन प्रोटीन (C99-जीवी) । इसके अलावा, हम एक और HEK-व्युत्पंन स्थिर सेल लाइन (एनजी) है कि constitutively व्यक्त Gal4-ल्यूक और Gal4/VP16-टैग NΔE (NΔE-जीवी) उत्पंन । इन उपंयास सब्सट्रेट-विशिष्ट γ-secretase परख का उपयोग करना, अब हम एक तरीका है और अलग सब्सट्रेट (अनुप्रयोग-तटरक्षक कोशिकाओं में C99, या एनजी कोशिकाओं में NΔE) की ओर γ-secretase की उत्प्रेरक गतिविधि भेद प्रदान करते हैं । इसके अलावा, सब्सट्रेट विशिष्ट γ-secretase परख के लिए उच्च सामग्री स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों के लिए अनुकूल हो डिजाइन किए गए थे । इन नव उत्पंन γ-secretase परख उपंयास γ की खोज-secretase मॉडुलन कि अगली पीढ़ी के उपचार के लिए अवांछनीय पायदान अवरोध को दूर करने के बिना Aβ उत्पादन को दबा कर संज्ञानात्मक समारोह में सुधार सकता है के लिए मार्ग प्रशस्त सकता है of AD.
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Protocol
1. Luciferase रिपोर्टर संकेतों की माप, जो γ के अनुरूप-Secretase क्लीवेज of APP-C99 or NΔE
नोट: कृपया तटरक्षक और एनजी कोशिकाओं20,21की पीढ़ी के विस्तृत विवरण के लिए पिछले प्रकाशनों को देखें ।
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बीज एनजी या तटरक्षक कोशिकाओं (20, 000 कोशिकाओं/अच्छी तरह से) पर ९६-अच्छी तरह से microplates के एक अंतिम खंड में २०० μL/अच्छी तरह से विकास के माध्यम से बना है कि Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) प्लस 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 5 μg/एमएल blasticidin, २५० μg/एमएल एंटीबायोटिक (उदा. , zeocin), और २०० μg/एमएल hygromycin बी.
- किसी hemocytometer के साथ कक्षों की गणना करना ।
- एक humidified CO2 मशीन के लिए microplates स्थानांतरण और ३७ ° c रात भर में गर्मी ।
- प्रत्येक कुआं से विकास माध्यम की १०० μL निकालें ।
- या तो ०.२% dimethyl sulfoxide (DMSO) के साथ 2 μg/एमएल टेट्रासाइक्लिन युक्त विकास माध्यम के १०० μL/2 माइक्रोन सीएल-३८७,७८५, 2 माइक्रोन एन-[एन-(3, 5-difluorophenacetyl-एल-alanyl)]-एस-phenylglycine टी-butylester (DAPT), या अन्य संबंधित ErbB1/ErbB2 अवरोधकों.
- microplates में ३७ ° c में 24 घंटे के लिए तटरक्षक या एनजी कोशिकाओं का इलाज मशीन ।
- microplates से १५० μL/अच्छी तरह से विकास मध्यम निकालें ।
- ५० μL/अच्छी तरह से luciferase परख रिएजेंट जोड़ें (कृपया सामग्री की तालिकादेखें) ।
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microplates को luminescence microplate रीडर में स्थानांतरित करें ।
- कोमल आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर microplates बनाए रखें ।
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जुगनू luciferase (FL) का निर्धारण-luminescence microplate रीडर में संग्रहित एक पूर्व निर्धारित कार्यक्रम का उपयोग कर luminescence उत्सर्जित.
- साधन नियंत्रण सॉफ्टवेयर खोलें (साधन विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें).
- ' उपकरण ' मेनू से, ' Luminometry ' का चयन करें ।
- ' पैरामीटर ' सेटिंग्स के तहत, उत्सर्जन फिल्टर के लिए ' कोई फिल्टर ' चुनें, उत्सर्जन एपर्चर के लिए ' सामान्य ' टिक, समय की गिनती के लिए ' 1 ' दर्ज करें, और luminescence पढ़ने सेट अप करने के लिए ' ठीक ' पर क्लिक करें ।
- ' उपकरण नियंत्रण ' टैब के अंतर्गत, सक्रिय प्रोटोकॉल की सूची के माध्यम से स्क्रॉल करें, और luminescence पढ़ने के लिए पूर्व-संग्रहीत प्रोटोकॉल चुनें ।
- ' लाइव डिस्प्ले ' टैब के अंतर्गत, पुल-डाउन सूची से स्केल परिभाषित करें, और प्रकार के लिए ' लघुगणक ' या ' रेखीय ' चुनें ।
- ' तापमान ' टैब के अंतर्गत, प्लेट हीटिंग के लिए ' बंद ' का चयन करें ।
- luminescence पढ़ने का प्रदर्शन करने के लिए ' Start ' बटन पर क्लिक करें ।
- आवश्यकतानुसार, नियंत्रण सॉफ्टवेयर के भीतर एंबेडेड ' एक्सप्लोरर ' का उपयोग कर एक स्प्रेडशीट प्रारूप में परिणाम निर्यात करें ।
2. ठहराव की γ-Secretase गतिविधि
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एक luminescence तटरक्षक या एनजी ०.१% DMSO के साथ विकास मध्यम में 1 μg/एमएल टेट्रासाइक्लिन अकेले १००% सापेक्ष γ-secretase गतिविधि के रूप में इलाज कोशिकाओं द्वारा उत्सर्जित संकेत निर्धारित करें ।
- विकास माध्यम है कि टेट्रासाइक्लिन शामिल नहीं है के साथ कोशिकाओं के इलाज के द्वारा तटरक्षक या एनजी कोशिकाओं से पृष्ठभूमि luminescence अनुमान ।
- तटरक्षक या एनजी कोशिकाओं है कि विकास मध्यम के साथ 1 μg/एमएल टेट्रासाइक्लिन और या तो 1 माइक्रोन सीएल-३८७,७८५ या luciferase-DMSO द्वारा उत्सर्जित संकेत के साथ DAPT के 1 माइक्रोन के साथ संस्कृति के साथ luciferase संकेतों को सामान्य तटरक्षक या एनजी कोशिकाओं (१००% रिश्तेदार γ-secretase गतिविधि, के रूप में २.१ में परिभाषित) ।
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Representative Results
सीएल-३८७,७८५ द्वारा ErbB2 के निषेध अंतर एप्लिकेशन-C99 द्वारा अनुप्रयोग के प्रसंस्करण को बढ़ावा कर सकते हैं γ -पायदान दरार को प्रभावित किए बिना secretase
एक सेल आधारित परख कि मात्रात्मक एक विशेष γ के proteolytic दरार-secretase सब्सट्रेट उपाय कर सकते है स्थापित करने के लिए, हम स्थिर सह द्वारा HEK293-व्युत्पंन तटरक्षक सेल लाइन उत्पंन अभिकर्मक-टेट्रासाइक्लिन सी टर्मिनल inducible/Gal4-टैग की गईं APP-C99 और एक Gal4 प्रमोटर चालित जुगनू luciferase रिपोर्टर जीन । एक समानांतर एनजी सेल लाइन भी NΔE के γ-secretase दरार के लिए परख करने के लिए स्थापित किया गया था । एनजी कोशिकाओं में, एक टेट्रासाइक्लिन-inducible सी-टर्मिनल Gal4/VP16-टैग NΔE और एक Gal4 प्रमोटर चालित luciferase रिपोर्टर जीन transfected कोशिकाओं में छुरा सह HEK293 थे । अनुप्रयोग के γ-secretase दरार-तटरक्षक कोशिकाओं में C99 और γ-secretase दरार के एनजी कोशिकाओं में NΔE के विभिंन सांद्रता के साथ तटरक्षक और एनजी कोशिकाओं के इलाज से पुष्टि की गई DAPT, एक पान γ-secretase अवरोध करनेवाला है कि ब्लॉक सभी γ के क्लीवेज-secretase सब्सट्रेट ( चित्र 1) । डेटा भी प्रदर्शन किया है कि तटरक्षक andNG कोशिकाओं में γ-secretase catalysis के तुलनीय स्तर का प्रदर्शन किया ।
γ-secretase दरारें के लिए सब्सट्रेट-विशिष्ट कोशिका आधारित परख की दक्षता को मान्य करने के लिए, हम एक ErbB1/2 दोहरी अवरोध करनेवाला सीएल-३८७,७८५ के साथ तटरक्षक और एनजी cellstreated में luminescence संकेतों की जांच की है, जो अंतर करने के लिए दिखाया गया है मॉडुलन γ-एप के secretase क्लीवेज-C99 और NΔE21. हम पहले एक चयनात्मक γ-secretase presenilin-1 (ps1) और C99 और के बीच बातचीत के साथ हस्तक्षेप की कमी के बीच प्रोटीन के साथ अपने हस्तक्षेप के कारण मॉडुलन के रूप में सीएल-३८७,७८५ की पहचान की और ps1 और NΔE21। यहाँ, डेटा पता चलता है कि CL-३८७,७८५ के साथ उपचार प्रभावी रूप से ब्लॉक किए गए अनुप्रयोग-C99 के प्रसंस्करण तटरक्षक कोशिकाओं में, जबकि प्रोटियोलिसिस NΔE कोशिकाओं में प्रभावित नहीं किया गया था (चित्रा 2) । ये परिणाम C99 और NΔE दरार के बीच अंतर में तटरक्षक और एनजी कोशिकाओं के प्रभाव को प्रदर्शित करता है, एक प्रारूप है कि उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों के लिए अनुकूल है ।
चित्रा 1: अनुप्रयोग-C99-विशिष्ट सेलुलर γ-secretase परख (तटरक्षक कोशिकाओं). तटरक्षक कोशिकाओं ९६-अच्छी तरह से microplates पर वरीयता प्राप्त थे (२०,००० कोशिकाओं को अच्छी तरह से) रातोंरात और सीएल के 1 माइक्रोन-३८७,७८५ या DAPT 1 μg/एमएल टेट्रासाइक्लिन की उपस्थिति में ३७ ° c के लिए 24 एच के साथ इलाज किया । C99-जीवी के γ-secretase-मध्यस्थता प्रोटियोलिसिस से प्राप्त luminescence को मात्रा के अतिरिक्त १०० μL/खैर luciferase परख रिएजेंट के बाद किया गया था । अकेले वाहन (०.१% DMSO) के साथ इलाज किया कोशिकाओं द्वारा उत्सर्जित luciferase संकेत १००% रिश्तेदार luminescence के रूप में स्थापित किया गया था । डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मतलब ± एसडी के रूप में दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: पायदान-विशिष्ट सेलुलर γ-secretase परख (एनजी कोशिकाओं) । एनजी कोशिकाओं ९६-अच्छी तरह से microplates पर वरीयता प्राप्त थे (२०,००० कोशिकाओं को अच्छी तरह से) रातोंरात और सीएल के 1 माइक्रोन-३८७,७८५ या DAPT 1 μg/एमएल टेट्रासाइक्लिन की उपस्थिति में ३७ ° c के लिए 24 एच के साथ इलाज किया । NΔE-जीवी के γ-secretase-मध्यस्थता प्रोटियोलिसिस से प्राप्त luminescence को मात्रा के अतिरिक्त १०० μL/खैर luciferase परख रिएजेंट के बाद किया गया था । अकेले वाहन (०.१% DMSO) के साथ इलाज किया कोशिकाओं द्वारा उत्सर्जित luciferase संकेत १००% रिश्तेदार luminescence के रूप में स्थापित किया गया था । डेटा तीन स्वतंत्र प्रयोगों से मतलब ± एसडी के रूप में दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
विज्ञापन के लिए aducanumab immunotherapy के एक चरण 1b परीक्षण से होनहार परिणामों को मजबूती से विज्ञापन की रोगजनन में Aβ की महत्वपूर्ण भूमिका की स्थापना की है22 और सुझाव है कि विरोधी Aβ दृष्टिकोण अभी भी विरोधी के विकास के लिए एक व्यवहार्य रणनीति विज्ञापन दवाओं रहे हैं । यहां, हम कक्ष का वर्णन-γ-secretase-APP के catalyzed प्रोटियोलिसिस-C99 और जुगनू NΔE रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग luciferase के लिए परख आधारित है । अनुप्रयोग-C99 और NΔE दो सबसे अच्छी तरह से अध्ययन γ-secretase सब्सट्रेट कर रहे हैं और एक साथ γ के रोगजनक और शारीरिक गतिविधियों का प्रतिनिधित्व करते हैं-secretase13. सीएल-३८७,७८५ द्वारा ErbB2 की downregulation कि हमारे निष्कर्षों को तरजीही एप्लिकेशन-C99 के स्थिर राज्य स्तर को कम कर सकते हैं और स्रावित Aβ आगे γ-secretase वर्तमान अध्ययन में वर्णित सब्सट्रेट विशिष्ट सेलुलर परख द्वारा पुष्टि कर रहे हैं । वर्तमान प्रोटोकॉल इस प्रकार उपंयास γ-secretase मॉडुलन की खोज के लिए एक कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है ।
इस γ के गुण-secretase सब्सट्रेट-विशिष्ट परख प्रतिमान बहुमुखी हैं । उदाहरण के लिए, इन सब्सट्रेट विशिष्ट γ-secretase परख एक प्रारंभिक स्क्रीन में उपयोग किया जा सकता है बाहर संभावित गैर-चयनात्मक γ-secretase अवरोधकों आगे विकास से शासन, और एक मात्रात्मक आकलन है कि ंयूनतम करने के लिए प्रासंगिक है प्रदान संभावित दुष्प्रभाव । इस पद्धति से पहचाने जाने वाले सक्रिय यौगिकों की जैविक प्रभावकारिता को फिर से न्यूरॉन सेल और विज्ञापन के पशु मॉडलों में मान्य किया जा सकता है, जैसा कि हाल ही में21में दिखाया गया है. इसके अतिरिक्त, तटरक्षक और एनजी स्थिर सेल लाइनों की एकरूपता हमारे प्रायोगिक परिणामों के reproducibility के लिए महत्वपूर्ण है । महत्वपूर्ण बात यह है कि C99-जीवी या NΔE-जीवी की टेट्रासाइक्लिन-inducible अभिव्यक्ति प्रभावी ढंग से luciferase रिपोर्टर अभिव्यक्ति की संतृप्ति को रोकती है जो अन्य प्रणालियों में देखी जाती है जहां C99 या NΔE व्यक्त constitutively है । इस टेट्रासाइक्लिन-inducible अभिव्यक्ति एक उच्च विश्वसनीय और सुसंगत luciferase संकेत है कि सीधे γ-secretase गतिविधि के साथ संबद्ध है, दो अलग सब्सट्रेट (APP-γ के बीच secretase-C99 क्लीवेज गतिविधियों की तुलना की अनुमति में परिणाम बनाम NΔE), या प्रयोग करने के लिए एक उच्च कुशल तरीके से प्रयोग से । आदेश में सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए, टेट्रासाइक्लिन समाधान की गतिविधि समय पर निगरानी की जानी चाहिए (अधिमानतः एक बार प्रति माह) इष्टतम प्रेरण दक्षता सुनिश्चित करने के लिए । एक अतिरिक्त लाभ के रूप में, इन प्लेटफार्मों की एकरूपता गठित Renilla luciferase अभिव्यक्ति के साथ जुगनू luciferase को सामान्य करने के लिए की आवश्यकता को समाप्त । अंत में, 1 µ एम avagacestat, एक ज्ञात पायदान-γ-secretase अवरोध करनेवाला के साथ तटरक्षक और एनजी कोशिकाओं के इलाज, परख के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं ।
एक वर्तमान परख मंच का उपयोग कर के संभव चेतावनी है कि γ के एक्सप्रेस-secretase सब्सट्रेट और हमारे परख में transcriptional रिपोर्टर के बाद संतृप्ति कुछ मुखौटा निरोधात्मक गतिविधि और योगदान करने की क्षमता है प्रतिकूल विभिंन परख23के बीच निरोधात्मक शक्ति । इस संभावित जटिलता के रूप में हाल ही में दिखाया गया है पायदान बख्शते γ-secretase अवरोधकों की प्रभावकारिता को मान्य करने के लिए माध्यमिक परख प्लेटफार्मों की जरूरत को रेखांकित करता है21। इस दृष्टिकोण की एक और संभावित सीमा है कि अधिक से अधिक ९० अलग झिल्ली प्रोटीन दिया γ-secretase सब्सट्रेट के रूप में पहचान की गई है, वर्तमान परख प्लेटफार्मों γ-secretase सब्सट्रेट selectivity की एक पूरी प्रोफ़ाइल प्रदान नहीं करते । इन पंक्तियों के साथ, पायदान दरार के निषेध बख्शना सबसे अच्छा readout के साथ जो γ-secretase अवरोधकों का मूल्यांकन करने के लिए नहीं हो सकता है । सावधानी तथ्य यह है कि avagacestat, एक पायदान बख्शते γ-secretase अवरोध करनेवाला के कारण लिया जाना चाहिए, अनुभूति24में सुधार करने के लिए विफल रहता है, और यह संभावना है कि पायदान अवरोध पान γ-secretase अवरोधकों के साथ जुड़े विषाक्तता के लिए एकमात्र आधार नहीं हो सकता है 25. इस नए दृष्टिकोण से पहचान की हिट की सही उपयोगिता पर टिका सकता है अगर नव पहचान पायदान-बख्शते γ-secretase अवरोधकों के पास उपंयास रासायनिक संस्थाओं कि avagacestat में मौजूद नहीं हैं, और यदि इन अवरोधकों की प्रभावकारिता हो सकता है विज्ञापन के vivo में मॉडल का उपयोग करके मान्य ।
अंत में, हमें विश्वास है कि प्रस्तुत दृष्टिकोण बहुत APP के विकास में तेजी लाने-C99-विशिष्ट γ-secretase अवरोधकों/ वहां कोई इनकार नहीं है कि γ-secretase अवरोधकों, चाहे वे पायदान या छोड़ रहे हैं, संभावित विज्ञापन रोगियों में विषाक्तता शुरू कर सकता है, जो अवांछनीय सहनशीलता और परिणामों के लिए नेतृत्व के रूप में पहले26का सुझाव दिया जाएगा । हालांकि, नए रासायनिक उपकरणों और सुधार सत्यापन योजनाओं की शुरूआत के साथ21, γ-secretase अपनी जैव रासायनिक जटिलता के कारण एक आकर्षक दवा लक्ष्य होना जारी रखना चाहिए, और अधिक नैदानिक और नैदानिक अध्ययन की आवश्यकता का पता लगाने के लिए अपने विज्ञापन में चिकित्सीय प्रासंगिकता ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों ने तकनीकी सहायता के लिए सेलुलर और जीव जीव विज्ञान, जगत् Sinica संस्थान की कोर सुविधा का शुक्रिया अदा किया । इस अध्ययन को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, ताइवान (सबसे 103-2320-B-001-016-MY3 को वाइ.-एफ. के द्वारा समर्थित किया गया था. एल), के लिए कार्यक्रम के अनुवाद नवाचार के लिए--प्रौद्योगिकी समर्थन मंच धुरी योजना (NP7 to y.-F.L.), और शिक्षा Sinica (को y.-F.L.) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
References
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