Summary
Hemos generado con éxito dos ensayos de sustrato específico γ-secretasa. Ambos ensayos celulares presentados aquí están diseñados para cuantificar las actividades enzimáticas de la γ-secretasa a través de la salida de los reporteros de luciferasa de luciérnaga.
Abstract
Hemos desarrollado un par de ensayos de gen reportero basadas en células para medir cuantitativamente la γ-secretasa escote de distintos sustratos. Este manuscrito describe los procedimientos que pueden utilizarse para monitorizar la γ-secretasa-mediada por hendidura del APP-C99 o muesca, utilizando un sistema de Gal4 impulsado por el promotor firefly luciferase reportero. Estos ensayos fueron establecidos por estable Co transfectar las células HEK293 con el gen reportero de luciferasa Gal4-conducido y el fragmento de Gal4/VP16-etiquetadas C-terminal de APP (APP-C99; Células del CG), o el Gal4/VP16-tagged muesca-ΔE (NΔE; Células de NG). Mediante estos ensayos reportero en paralelo, hemos demostrado que un inhibidor ErbB2, CL-387.785, preferentemente puede suprimir la γ-secretasa hendidura del APP-C99 en células del CG, pero no NΔE en las células de NG. Las respuestas diferenciales exhibidas por las células del centro de gravedad y NG, con CL-387.785, representan una característica preferida para moduladores de la γ-secretasa, y estas respuestas están en marcado contraste con la pan-inhibición de la γ-secretasa inducida por DAPT. Nuestros estudios proveen evidencia directa que las actividades de la γ-secretasa hacia diferentes sustratos pueden diferenciarse en un contexto celular. Estos nuevos ensayos por lo tanto pueden ser herramientas útiles en el descubrimiento de fármacos para mejorar terapias de AD.
Introduction
Los formas de amiloide-β (Aβ) se creen que la causa primaria de la neurodegeneración en los cerebros de pacientes que sufren de enfermedad de Alzheimer (EA)1. Péptidos Aβ se producen por el paso a paso clivaje de la proteína precursora de amiloide (APP), primero por la β-secretasa y luego por la γ-secretasa2. En la última década, enfoques terapéuticos hacia el tratamiento de la EA se han centrado en la prevención de la producción de Aß3. La mayoría de los estudios se ha centrado en ambos el aumento de la actividad de la α-secretasa, que puede impedir la γ-secretasa escote de aplicación y disminuir así la producción de Aß y la inhibición de la γ-secretasa β-y/o actividades4. Desafortunadamente, la inhibición no selectiva de β o γ secretases resultados inevitables efectos secundarios son debido a la interferencia con el funcionamiento de otros substratos fisiológicos de β - y γ-secretasa5,6. Con respecto a los inhibidores de γ-secretasa, recientes estudios han reportado el descubrimiento de una serie de moduladores químicos y genéticos que regulan la producción de Aß y ejerciendo efectos insignificantes en el proceso esencial γ-secretasa-mediada de la muesca7 ,8,9,10,11,12, sin embargo, exitosa terapéutica aún no se han desarrollado. Por lo tanto, más sistemáticas pantallas están garantizados para descubrir nuevos modificadores genéticos y químicos que pueden modular selectivamente la γ-secretasa-mediada por el procesamiento de APP.
Γ-secretasa se sabe allegarse más de 90 diferentes proteínas ancladas a membrana. Entre estos sustratos es de clase, cuya actividad es fundamental para determinar el destino celular y diferenciación durante el desarrollo de13. Modulación selectiva aplicación de γ-secretasa-catalizada de procesamiento en ausencia de afectar la muesca procesamiento será esencial para reducir al mínimo muesca efectos secundarios de los inhibidores de γ-secretasa, y esta selectividad se cree que un factor primario que determinan la eficacia biológica de posibles moduladores de la γ-secretasa para el tratamiento crónico de AD. Ha habido una serie de derivados arylsulfonamide, como GSI-953 (begacestat) y BMS-708163 (avagacestat), que se han encontrado para exhibir potente y selectiva inhibición de la γ-secretasa14,15. Un estudio anterior ha demostrado que la inhibición diferencial de γ-secretasa hendidura del APP y muesca puede observarse utilizando un ensayo ELISA basado en combinación con validación en vivo utilizando el pez cebra16. Además, se han establecido paradigmas de análisis basadas en células para tratar la posible selectividad de substrato de γ-secretasa hacia la aplicación y muesca17,18. Utilizando protocolos similares a los descritos en este documento, recientemente hemos descubierto una nueva clase de (D)-leucinamides que potentemente modulan γ-secretasa hendidura del APP con muesca-escasamente selectividad19. En conjunto, esta colección de estudios proporciona una prueba de concepto apoyando la idea de que la selectividad del sustrato/disponibilidad de γ-secretasa puede ser objeto de modulación química y verificación experimental. Sin embargo, estas plataformas de ensayo a menudo dependen relativamente bajo rendimiento lecturas y enfoques que requieren mucho trabajo que no podrían cumplir con las normas industriales programas de descubrimiento de drogas.
Recientemente hemos generado ensayos de genética de reportero luciferasa basado en la célula que pueden determinar cuantitativamente la actividad catalítica de la γ-secretasa hacia dos sustratos diferentes, lo aminoácidos 99 fragmento c-terminal ácido de APP (APP-C99) y el extracelular eliminar dominio péptido de muesca (NΔE). APP-C99 y NΔE han sido ampliamente utilizados como sustratos directos de γ-secretasa en varios ensayos. Para generar ensayos de genética de reportero luciferasa homogénea y consistente para la hendidura de la γ-secretasa de aplicación-C99 o NΔE, hemos generado una línea de células estable HEK (CG) que expresa constitutivamente un Gal4 impulsado por el promotor firefly luciferase reporter ( Gal4-Luc) y proteína de la fusión de Gal4/VP16-etiquetada APP-C99 (C99-GV). Además, generamos otra línea de células estable HEK (NG) que expresa constitutivamente Gal4-Luc y Gal4/VP16-con la etiqueta NΔE (NΔE-GV). Utilizando estos ensayos de novela sustrato específico γ-secretasa, ahora proporcionan un método para cuantificar y para distinguir la actividad catalítica de la γ-secretasa hacia distintos sustratos (APP-C99 en células CG), o NΔE en las células de NG. Por otra parte, los ensayos de sustrato específico γ-secretasa fueron diseñados para ser propicio a plataformas de proyección de alto contenido. Estos ensayos recién generado γ-secretasa podrían allanar el camino para el descubrimiento de los moduladores de la novela de γ-secretasa que podría mejorar la función cognitiva mediante la supresión de producción de Aß sin producir inhibición de muesca indeseable para el tratamiento de última generación de AD.
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Protocol
1. medición de las señales de reportero de luciferasa, que corresponden al escote de la γ-secretasa de aplicación-C99 o NΔE
Nota: Consulte las publicaciones anteriores para descripciones detalladas de la generación de CG y NG células20,21.
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Semilla de células NG o CG (20, 000 células/pocillo) en microplacas de 96 pocillos en un volumen final de 200 μL/pozo en medio del crecimiento que se compone de modificado Eagle Medium (DMEM) más 10% suero bovino fetal de Dulbecco (FBS), 5 μg/mL blasticidin, antibiótico de 250 μg/mL (p. ej. zeocin) y 200 de μg/mL higromicina B.
- Contar celdas con un hemocitómetro.
- Transferir las placas a una humidificado incubadora de CO2 e incubar a 37 ° C durante la noche.
- Saque 100 μL de medio de crecimiento de cada pozo.
- Añadir 100 μL/pocillo de crecimiento mediano contiene 2 μg/mL tetraciclina con cualquiera 0.2% dimetil sulfóxido (DMSO), 2 μM CL-387.785, 2 μM N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butylester (DAPT) u otros relacionados con inhibidores de ErbB1/ErbB2.
- Incubar células tratadas CG o NG en microplacas a 37 ° C durante 24 h.
- Quitar medio 150 μL/pocillo de microplacas.
- Añadir 50 μL/pocillo luciferase ensayo reactivo (véase Tabla de materiales).
-
Transferencia de las microplacas para un lector de microplacas de luminiscencia.
- Mantener las placas a temperatura ambiente durante 5 minutos con agitación suave.
-
Determinar la luciferasa de luciérnaga (FL)-emite luminiscencia con un programa predefinido almacenado en el lector de microplacas de luminiscencia.
- Abra el software de control del instrumento (véase Tabla de materiales para obtener detalles del instrumento).
- En el menú de 'Herramientas', seleccione 'Luminometry'.
- Bajo los parámetros ' no elegir 'filtro' para filtro de emisión, tick 'Normal' para la apertura de la emisión, entre '1' para contar el tiempo y haga clic en 'OK' para configurar la lectura de la luminescencia.
- En la pestaña 'Control' del instrumento, desplácese por la lista de protocolos activos y seleccionar el protocolo previamente almacenado para la lectura de la luminescencia.
- En la pestaña 'Pantalla en vivo', definir la escala de la lista desplegable y seleccione 'Logaritmo' o 'Lineal' para el tipo.
- En la pestaña de 'Temperatura', seleccione 'Off' para la calefacción de la placa.
- Haga clic en el botón 'Start' para realizar la lectura de la luminescencia.
- Según sea necesario, exportar los resultados en un formato de hoja de cálculo utilizando el 'Explorer' integrado en el software de control.
2. cuantificación de la actividad de la γ-secretasa
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Definir una señal de la luminiscencia emitida por CG o células NG tratadas con 0,1% de DMSO en un medio que contiene 1 μg/mL tetraciclina solamente como actividad de γ-secretasa relativa de 100%.
- Estimar luminiscencia fondo de células CG o NG tratando las células con medio de cultivo que incluyen tetraciclina.
- Normalizar luciferase señales de CG o NG células que son cultivadas con medio de cultivo que contiene 1 μg/mL tetraciclina y cualquiera 1 μM CL-387.785 o 1 μM de DAPT con la señal de luciferase emitido por CG tratados con DMSO o NG células (100% actividad de relativa γ-secretasa, como definido en el punto 2.1).
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Representative Results
Inhibición de ErbB2 por CL 387.785 diferencialmente puede promover el proceso de aplicación-C99 por Γ -secretasa sin afectar el escote de la muesca
Para establecer un ensayo basado en la célula que puede medir cuantitativamente el clivaje proteolítico de un substrato determinado γ-secretasa, generamos la línea celular CG HEK293 derivado por la transfección estable Co de un tetracycline inducible C-terminal Gal4/VP16-tagged APP-C99 y un gen de reportero de luciferasa Gal4 firefly impulsado por el promotor. También se estableció una línea paralela de la célula de NG a ensayo por el escote de la γ-secretasa de NΔE. En las células de NG, un NΔE de Gal4/VP16-etiquetado terminal C inducible por tetraciclina y un gen de reportero de luciferasa impulsado por el promotor de Gal4 se estable Co transfected en las células HEK293. El escote de la γ-secretasa de aplicación-C99 en células del CG y el escote de la γ-secretasa de NΔE en células NG primero fueron confirmados por tratar células CG y NG con diferentes concentraciones de DAPT, un inhibidor de la γ-secretasa de pan que bloquea la hendidura de todos (sustratos) γ-secretasa Figura 1). Los datos también demostraron eso γ-secretasa en CG andNG células exhibidos niveles comparables de la catálisis.
Para validar la eficacia de las específica de sustrato celular ensayos para divisiones de γ-secretasa, examinamos las señales de luminiscencia en cellstreated CG y NG con un inhibidor dual de ErbB1/2 CL-387.785, que se ha demostrado que modulan diferencialmente Γ-secretasa hendidura del APP-C99 y NΔE21. Anteriormente identificamos CL-387.785 como un modulador selectivo de la γ-secretasa debido a su interferencia con la interacción de la proteína-proteína entre presenilina-1 (PS1) y C99 y la falta de interferencia con la interacción entre PS1 y NΔE21. Aquí, los datos muestran que el tratamiento con CL-387.785 había bloqueado el proceso de aplicación-C99 en células CG, mientras que la proteólisis de NΔE en células NG no era afectada (figura 2). Estos resultados demuestran la eficacia de las células CG y NG en la distinción entre escote C99 y NΔE, en un formato que es propicio para plataformas de proyección de alto rendimiento.
Figura 1: el ensayo de γ-secretasa celular APP-C99-específico (células de la CG). Se siembran las células de la CG en microplacas de 96 pocillos (20.000 células/pocillo) durante la noche y se trata con 1 μM de CL 387.785 o DAPT en presencia de tetraciclina de 1 μg/mL a 37 ° C durante 24 h. La luminiscencia derivada de proteólisis mediada por γ-secretasa de C99-GV se cuantificó después de la adición del reactivo de ensayo de 100 μL/pocillo de luciferasa. La señal de luciferase emitida por las células tratadas con vehículo solo (0.1% DMSO) fue fijada como luminiscencia relativa de 100%. Datos se presentan como la media ± SD de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: el ensayo de γ-secretasa celular muesca específicas (células de NG). Se siembran las células NG en microplacas de 96 pocillos (20.000 células/pocillo) durante la noche y se trata con 1 μM de CL 387.785 o DAPT en presencia de tetraciclina de 1 μg/mL a 37 ° C durante 24 h. La luminiscencia derivada de proteólisis mediada por γ-secretasa de NΔE-GV se cuantificó después de la adición del reactivo de ensayo de 100 μL/pocillo de luciferasa. La señal de luciferase emitida por las células tratadas con vehículo solo (0.1% DMSO) fue fijada como luminiscencia relativa de 100%. Datos se presentan como la media ± SD de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los resultados prometedores de un ensayo de 1b de fase de aducanumab la inmunoterapia para el anuncio han establecido firmemente el papel crítico de Aß en la patogenesia del anuncio22 y sugieren que los enfoques anti-Aß siguen siendo una estrategia viable para el desarrollo de fármacos anti-AD. Aquí, describimos ensayos basadas en células para la cuantificación de proteólisis catalizada por γ-secretasa de aplicación-C99 y NΔE utilizando sistemas de reportero de luciferasa de luciérnaga. APP-C99 y NΔE son los dos substratos más estudiados de la γ-secretasa, constituyen las actividades patógenas y fisiológicas de la γ-secretasa13. Nuestros resultados que downregulation de ErbB2 por CL 387.785 preferencial puede reducir los niveles de estado estacionario de aplicación-C99 y Aß secretada además están respaldadas por los ensayos celulares de sustrato específico de γ-secretasa se describe en el presente estudio. El protocolo actual proporciona así un enfoque eficaz para el descubrimiento de los moduladores de la novela de la γ-secretasa.
Los méritos de este paradigma de análisis específicos de sustrato de la γ-secretasa son multifacéticos. Por ejemplo, estos ensayos de sustrato específico γ-secretasa podrían utilizarse en una pantalla preliminar para descartar potenciales inhibidores de γ-secretasa no selectivo de desarrollo posterior y proporcionar una evaluación cuantitativa que es relevante para reducir al mínimo efectos secundarios potenciales. La eficacia biológica de los compuestos activos identificados por este método puede entonces más validada en células neuronales y modelos animales de anuncio, como demostró recientemente21. Además, la homogeneidad de las líneas celulares estables CG y NG es crítica para la reproducibilidad de los resultados experimentales. Lo importante es la expresión inducible por tetraciclina de C99-GV o GV NΔE previene con eficacia la saturación de la expresión de reportero de luciferasa que se ve en otros sistemas donde se expresa constitutivamente C99 o NΔE. Esta expresión inducible por tetraciclina resulta en una señal de luciferase altamente confiable y constante que correlaciona directamente con la actividad de la γ-secretasa, que permite la comparación de la γ-secretasa actividades hendidura entre dos sustratos diferentes (APP-C99 versus NΔE), o de un experimento a experimento de una manera altamente eficiente. Para obtener los mejores resultados, la actividad de solución de tetraciclina debe controlarse periódicamente (preferiblemente una vez al mes) para asegurar la inducción óptima eficiencia. Como ventaja añadida, la homogeneidad de estas plataformas elimina la necesidad de normalizar luciferase de la luciérnaga con expresión constitutiva de luciferasa Renilla . Finalmente, tratar células CG y NG con 1 avagacestat μm, un inhibidor conocido de γ-secretasa para muesca-escasamente, puede servir como un control positivo para el ensayo.
Una posible salvedad del uso de la plataforma de ensayo actual es que la sobreexpresión de sustratos de la γ-secretasa y posterior saturación del reportero transcripcional en nuestros ensayos tienen cierto potencial actividad inhibidora de la máscara y contribuir al discrepante potencia inhibitoria entre los diferentes ensayos23. Esta complicación potencial subraya la necesidad de plataformas de análisis secundario para validar la eficacia de los inhibidores de γ-secretasa muesca-escasamente, como se muestra recientemente21. Otra limitación potencial de este enfoque es que teniendo en cuenta más de 90 diferentes membrana las proteínas han sido identificadas como sustratos de la γ-secretasa, las actuales plataformas de ensayo no proporcionan un perfil completo de selectividad de substrato de γ-secretasa. A lo largo de estas líneas, ahorradores de la inhibición de la hendidura de la muesca pueden no ser la mejor lectura con la cual evaluar inhibidores de γ-secretasa. Debe tener precaución debido al hecho de avagacestat, un inhibidor de la γ-secretasa ahorradores de muesca, falla para mejorar la cognición24y es probable que la inhibición de Notch podría no ser la única base de toxicidad asociada a inhibidores de γ-secretasa la pan 25. la utilidad verdadera de éxitos por este nuevo enfoque podría bisagra sobre si los recién identificados inhibidores de γ-secretasa muesca-escasamente poseen nuevas entidades químicas que no están presentes en avagacestat, y si la eficacia de estos inhibidores puede ser validado en vivo modelos de anuncio.
En conclusión, creemos que el enfoque presentado mucho puede acelerar el desarrollo de la aplicación-C99-específico γ-secretasa inhibidores/moduladores para uso clínico. No hay ninguna negación que inhibidores de γ-secretasa, sean ahorradores de muesca o no, potencialmente podría iniciar la toxicidad en pacientes con EA, que llevaría a no deseado tolerabilidad y resultados previamente sugieren26. Sin embargo, con la introducción de nuevas herramientas químicas y validación mejorados esquemas21, γ-secretasa debería seguir siendo un atractivo destino de drogas debido a su complejidad bioquímica, que requieren más estudios preclínicos y clínicos para explorar su importancia terapéutica en AD.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen las instalaciones centrales del Instituto de celular y biología organísmica, Academia Sinica, soporte técnico. Este estudio fue apoyado por el Ministerio de ciencia y tecnología, Taiwán (más 103-2320-B-001-016-MY3 a Y.-F. L.), el programa de innovación aplicada de desarrollo biofarmacéutico – tecnología de eje de plataforma de apoyo régimen (NP7 a F.L. Y.) y Academia Sinica (a Y.-F.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
References
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