Fabrication förfaranden för starkt magnetiskt responsiv lanthanide ion kelaterande polymolecular församlingar presenteras. Den magnetiska Svaren styrs av storleken på församlingen, som är anpassad av extrudering genom nanopore membran. Församlingarna magnetiska alignability och temperatur-inducerad strukturella förändringar övervakas av Dubbelbrytning mätningar, en gratis teknik att kärnmagnetisk resonans och liten vinkel neutronspridning.
Bicelles finns avstämbara disk-liknande polymolecular församlingar bildades ur ett stort utbud av lipid blandningar. Program varierar från membran protein strukturella studier av kärnmagnetisk resonans (NMR) till nanotekniska utvecklingen inklusive bildandet av optiskt aktiv och magnetiskt omkopplingsbar geler. Sådan teknik kräver hög kontroll av församlingens storlek, magnetiska svar och termisk resistans. Blandningar av 1,2-dimyristoyl –sn– glycero-3-phosphocholine (DMPC) och dess lanthanide ion (Ln3 +) kelaterande fosfolipid konjugat, 1,2-dimyristoyl –sn– glycero-3-phospho-etanolamin-dietylenglykol triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), montera in starkt magnetiskt lyhörd sammansättningar såsom DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (molar förhållandet 4:1:1) bicelles. Införandet av kolesterol (Chol-OH) och steroid derivat i lipidens resultat i en annan uppsättning församlingar erbjuder unika fysikalisk-kemiska egenskaper. För en given lipid sammansättning är den magnetiska alignability proportionell mot storleken på bicelle. Komplexering av Ln3 + resulterar i oöverträffad magnetiska Svaren när det gäller både omfattning och anpassning riktning. Thermo-reversibla kollapsen av disk-liknande strukturer i blåsor vid uppvärmning kan skräddarsy de församlingarna dimensioner av extrudering genom membranfilter med definierade porstorlek. De magnetiskt justeringsbar bicelles regenereras genom nedkylning till 5 ° C, vilket resulterar i församlingen dimensioner definieras av vesikler prekursorer. Häri, proceduren fabrication förklaras och den magnetiska alignability för församlingar kvantifieras i Dubbelbrytning mätningar under ett 5,5 T magnetfält. Dubbelbrytning signalen, med ursprung från den fosfolipid lipidens, möjliggör ytterligare övervakning av polymolecular förändringar som sker i lipidens. Denna enkla teknik är ett komplement till NMR-experimenten som är vanligen anställda att karaktärisera bicelles.
Bicelles finns disk-liknande polymolecular församlingar erhållits från talrika lipid blandningar. 1 , 2 , 3 , 4 , 5 de används för strukturella karakterisering av membran biomolekyler av NMR spektroskopi. 6 , 7 dock senaste insatser syftar till att utöka området för möjliga tillämpningar. 5 , 8 , 9 det mest studerade bicelle-systemet består av en blandning av 1,2-dimyristoyl –sn– glycero-3-phosphocholine (DMPC), som utgör den plana delen av församlingen och 1,2-dihexanoyl –sn– glycero-3-phosphocholine (DHPC) fosfolipid som täcker kanten. 1 , 2 , 3 de fosfolipider som komponera lipidens molekylär geometri diktera arkitekturen av strukturen själv monterade polymolecular. 4 , 5 ersätter DHPC med DMPE-DTPA genererar mycket magnetiskt lyhörd och avstämbara bicelle system. 10 , 11 DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + (molar förhållandet 4:1:1) bicelles associera med många fler paramagnetiska lanthanide joner (Ln3 +) på den lipidens yta, vilket resulterar i en förbättrad magnetisk svar. 10 dessutom ersätta de vattenlösliga DHPC-molekylerna med DMPE-DTPA/Ln3 + möjliggör bildandet av utspädning-resistent bicelles. 11
Den magnetiska alignability planar polymolecular sammansättningar styrs av deras övergripande magnetisk energi,
(1)
där B är den magnetiska fältstyrkan, den magnetiska konstant, n antalet aggregering och den molekylära diamagnetic känslighet anisotropin de lipider som komponera lipidens. Därför är DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles svar på magnetiska fält anpassad efter deras storlek (sammanlagda antal n) och den molekylära diamagnetic känslighet anisotropi Δχ. Den senare är lätt uppnås genom att ändra arten av den kelaterade Ln3 +. 12 , 13 , 14 , 15 Introducing kolesterol (Chol-OH) eller andra steroid derivat i lipidens erbjuder möjligheten att trimma både den sammanlagda antal n och den magnetiska känslighet Δχ för församlingar. 11 , 16 , 17 , 18 , 19 för en given lipid sammansättning, större sammansättningar innehåller mer lipider kan bidra till Emag (större sammanlagda antal n), vilket resulterar i mer justeringsbar arter. Storleken på DMPC/DHPC bicelles, till exempel styrs konventionellt genom optimering av komponera lipid baserat eller total koncentration. 20 , 21 , 22 även om detta är möjligt i DMPC/DMPE-DTPA/Ln3 + bicelles, deras thermo-reversibla omvandlingen från bicelle till blåsor vid värme erbjuder La skräddarsy alternativ. Mekaniskt förfarande såsom extrudering genom membranfilter tillåter formning av blåsor. De magnetiskt justeringsbar bicelles regenereras vid nedkylning till 5 ° C och deras dimensioner dikteras från vesikler prekursorer. 11 häri, fokuserar vi på potentialen för mekanisk tillverkning förfaranden med DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1) eller DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 16:4:5:5) som referenssystem. Processen fungerar analogt när du arbetar med andra Ln3 + än Tm3 +. Det breda utbudet av möjligheter som erbjuds av dessa tekniker är markerat i figur 1 och utförligt diskuterat någon annanstans. 23
Figur 1: Schematisk översikt över förfaranden som möjliga fabrication. De studera magnetiskt justeringsbar Ln3 + kelaterande polymolecular församlingarna består av antingen DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 4:1:1) eller DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 16:4:5:5). Torra lipid filmen är återfuktad med en 50 mM fosfatbuffert vid ett pH-värde på 7,4 och den totala lipid-koncentrationen är 15 mM. En effektiv återfuktning av lipid filmen kräver antingen frysa upptining cykler (FT) eller uppvärmning och nedkylning cykler (H & C). H & C cykler är nödvändigt att regenerera prover efter den sista frysning upptining steg eller att regenerera proverna förvaras frysta över en längre tid om de ska användas utan ytterligare extrudering. Här diskuteras utförligt av Isabettini et al. 23 maximally justeringsbar polymolecular församlingar uppnås, att leverera olika församlingen arkitekturer utifrån lipid sammansättning. Bicelle storlek och magnetiska alignability är avstämbara genom strängsprutning (Ext) genom nanopore membranfilter. Den presenterade justering faktorer Af beräknades från 2D liten vinkel neutron scattering (SANS) mönster av ett DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molar förhållandet 16:4:5:5) prov extruderade genom antingen 800, 400, 200 eller 100 nm porer. Är ett kompletterande sätt att kvantifiera bicelle justering som inte täcks mer i detalj häri SANS mätningar. 11 , 16 Af varierar från -1 (parallella neutronspridning eller vinkelrät anpassning av bicelles med avseende på magnetfält riktning) till 0 för isotropiskt spridning.Klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Strukturera av bicelles har studerats av ett brett utbud av tekniker för karakterisering. 13 anpassningen av bicelles som exponeras för ett magnetfält har kvantifierats med hjälp av NMR spektroskopi eller liten vinkel neutron scattering (SANS) experiment. 5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25 men skiftet och breddning av NMR topparna förekommer i närvaro av Ln3 + är allvarliga begränsningar till metoden. 15 , 26 , 27 , 28 även om SANS experiment lider inte av denna begränsning, alternativa och mer tillgängliga tekniker är önskvärt för rutinmässig kvantifiering av Magnetiskt inducerad justering av församlingarna i lösning. Dubbelbrytning mätningar är en livskraftig och jämförelsevis enkla alternativ. Analogt till NMR-experimenten avslöja Dubbelbrytning mätningar värdefull information om lipid rearrangements och lipid faser som förekommer i lipidens. Dessutom övervakas geometriska omformningar som förekommer i den polymolecular församlingen med förändrade miljöförhållanden som temperatur. 11 , 12 , 13 , 16 Magnetiskt inducerad Dubbelbrytning Δn′ har använts för att studera olika typer av fosfolipid system. 13 , 29 , 30 Dubbelbrytning mätningar baserat på en fas modulationsteknik i ett magnetfält är en livskraftig metod att upptäcka läggning av bicelles. 12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32 möjligheten att undersöka bicelles med Dubbelbrytning i höga magnetfält upp till 35 T också framgick av M. Liebi o.a. 13
När polariserat ljus träder en anisotropa material, kommer det att vara bryts i en löpande våg. 11 de två vågorna har olika hastigheter och skiftas i fas av en utvecklingsstörning δ. Graden av utvecklingsstörning δ mäts och omvandlas till en Dubbelbrytning signal att kvantifiera graden av anisotropi i material med
(2)
där λ är våglängden av laser och d är tjockleken på provet. Fosfolipider är optiskt anisotropic och deras optiska axeln sammanfaller med deras långa molekylär yxor, parallella kolväte svansar. 11 , 12 ingen retardation mäts om fosfolipider är slumpmässigt orienterade i lösning. Retardation mäts när fosfolipider är justerade parallellt till varandra. Magnetiskt inducerad dubbelbrytningen kan ha ett positivt eller negativt tecken beroende på orienteringen av molekylerna i det magnetiska fältet; Se figur 2. Fosfolipider justerade parallellt till x-axeln kommer att resultera i en negativ , medan de arrangera i rak linje längs z-axeln resulterar i en positiv . Ingen Dubbelbrytning observeras när den optiska axeln sammanfaller med riktningen av ljusa förökningen som fosfolipid justerar parallellt med y-axeln.
Figur 2: Anpassningen av fosfolipider och motsvarande tecken på Magnetiskt inducerad dubbelbrytningen . Tecknet för den uppmätta beror på orienteringen för fosfolipid i magnetfältet. Streckade visar linjer den optiska axeln av molekylen. Ljuset är polariserat på 45° och propagerar i y riktning. Magnetfältet B är i z riktning. Denna siffra har ändrats från M. Liebi. 11 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
När det gäller en isotrop kolloidal suspension av bicelles förloras orientering inducerad av ordningen av fosfolipider i lipidens, nollställning av utvecklingsstörning δ. Bicelles måste också anpassa för att orientera de optiskt aktiva fosfolipider i deras lipidmonolager, orsakar en utvecklingsstörning δ av polariserat ljus. Dubbelbrytning är följaktligen ett känsliga verktyg att kvantifiera den magnetiska alignability polymolecular församlingar. Bicelles arrangera i rak linje vinkelrätt mot magnetfältet kommer att ge en positiv , medan de justerade parallellt kommer att ge en negativ . Tecken beror på anpassning av installationen och kan kontrolleras med ett referensprov.
En detaljerad redogörelse för hur Dubbelbrytning mätningar användes i kombination med SANS experiment för att utvärdera metoder för att generera mycket magnetiskt lyhörd Ln3 + kelat fosfolipider sammansättningar är i Isabettini et al. 23 de föreslagna fabrication protokoll gäller också för aggregat som består av de längre DPPC och DPPE-DTPA fosfolipider eller för dem som innehåller kemiskt modifierade steroid derivat i deras lipidens. 11</sup…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner schweiziska National Science Foundation för att finansiera SMhardBi (projekt nummer 200021_150088/1). SANS experimenten utfördes vid den schweiziska spallation neutronkällan SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Schweiz. Författarna tacka vill varmt Dr Joachim Kohlbrecher för hans vägledning med SANS experimenten. Dubbelbrytning mätning inställningar under höga magnetfält inspirerades från den befintliga konfigurationen på hög-fält magnetiska laboratorium HFML, Nijmegen, Nederländerna. Vi tackar Bruno Pfister för hans hjälp att utveckla elektronik Dubbelbrytning setup, Jan Corsano och Daniel Kiechl för att konstruera de ramar som möjliggör fina och lättköpt justering av laser och Dr. Bernhard Koller för löpande teknisk support.
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) | Avanti Polar Lipids | 850345P | >99% |
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA) | Avanti Polar Lipids | 790535P | >99% |
Thulium(III) chloride | Sigma-Aldrich | 439649 | anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis |
Dysprosium(III) chloride | Sigma-Aldrich | 325546 | anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis |
Ytterbium(III) chloride | Sigma-Aldrich | 439614 | anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 319988 | contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8% |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | ≥99.9% |
Cholesterol | Amresco | 433 | Ultra pure grade |
D2O | ARMAR chemicals | 1410 | 99.8 atom % D |
Ultrapure water | Millipore | Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001) | |
electronic pH meter | Metrohm | 17440010 | |
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter | VWR | 515-2028 | |
Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter | VWR | 515-2029 | |
Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter | VWR | 515-2030 | |
Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter | VWR | 515-2032 | |
Whatmann Filter paper | VWR | 230600 | |
25 ml round bottom flask | VWR | 201-1352 | 14/23 NS |
3 ml glass snap-cup | VWR | 548-0554 | ND18, 18x30mm |
2.5 ml glass syringe | Hamilton | ||
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Merk | 1.06342 | Salt used to make phosphate buffer |
di-Sodium hydrogen phosphate | Merk | 1.06586 | Salt used to make phosphate buffer |
Liquid Nitrogen | Carbagas | – | |
Pressurized Nitrogen gas | Carbagas | – | 200 bar bottle |
Lipid Extruder 10 ml | Lipex | – | Fully equipped with thermobarrel |
High-pressure PVC tube | GR NETUM | – | must resist more than 4 MPa |
Serto adaptors | Sertot | – | |
Nitrile gloves | VWR | – | |
2 ml glass pipettes | VWR | 612-1702 | 230 mm long |
Diode Laser | Newport | LPM635-25C | |
DSP Dual Phase Lock-in Amplifier | SRS | SR830 | |
Photodiode Detector | Silonex Inc. | SLSD-71N5 | 5mm2, Silicon, photo-conductive |
5.5 T Cryogenic Magnetic | Cryogenic/Oerlikon AG | – | 12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head |
Second order low pass filter | home-built | – | Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA |
Photoelastic modulator | Hinds instruments | PEM-90 | |
Glan-Thompson Calcite Polarizer | Newport | 10GT04 | 25.4mm diameter |
Quartz sample cuvette | Hellma | 165-10-40 | temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length |
Temperature probe | Thermocontrol | – | Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax |
Non-polarizing mirrors | Newport | 50326-1002 | 25.4mm |
RS 232 cables | National Instruments | 189284-02 | For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers |
BNC 50 Ω cable and connectors | National Instruments | 763389-01 | |
cFP-AI-110 | National Instruments | 777318-110 | 8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint |
cFP-CB-1 | National Instruments | 778618-01 | Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O |
cFP-CB-3 | National Instruments | 778618-03 | Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module |
cFP-TC-120 | National Instruments | 777318-120 | 8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint |
cFP-1804 | National Instruments | 779490-01 | Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint |
LabView 2010 | National Instruments | – | |
Industrial power supply | Traco Power | TCL 060-124 | 100-240V AC |
Waterbath | Julabo | FP40-HE | refrigerated/Heating Circulator |