16S rRNA Amplicon 시퀀싱에 의해 배설물 미생물 특성화에 대 한 가이드 프로토콜
Summary
이 원고는 높은 처리량 16S rRNA amplicon 시퀀싱의 상세한 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 데이터 분석을 통해 배설물 샘플 컬렉션에서 시작 하는 통합, 제복 및 가능한, 저렴 한 프로토콜을 소개 합니다. 이 프로토콜에는 많은 수의 엄격한 표준 샘플의 분석 및 여러 가지 컨트롤 수 있습니다.
Abstract
인간 장 미생물 부상에서 세포를 보호, 에너지와 영양소, 처리 및 면역 증진에 중심 역할을 한다. 건강 한 microbiota 구성 (dysbiosis)으로 간주 됩니다에서 편차 pathologic 조건에 선도 하는 중요 한 기능에 악영향을 줄 수 있습니다. 최근 지속적인 연구 노력 미생물 구성 및 인류 건강 및 질병 사이 협회의 특성으로 지시 되어 있다.
높은 처리량 시퀀싱 기술의 발전 창 자 미생물 구성의 특성을 사용합니다. 이러한 방법에는 16S rRNA amplicon 시퀀싱 및 샷건 시퀀싱 포함 됩니다. 16S rRNA amplicon 시퀀싱 샷건 시퀀싱 유전자 예측 및 주석 기능에 대 한 추가 정보를 제공 하는 동안 분류학 구성, 프로 파일링 하는 데 사용 됩니다. 16S rRNA 유전자 변수 지역의 타겟된 시퀀싱 메서드를 사용 하는 이점은 샷건 시퀀싱에 비해 현저히 낮은 비용입니다. 16S rRNA 유전자에서 순서 차이 식별 하 여 다른 taxa는 개별 샘플 내에서 계량 미생물 지문으로 사용 됩니다.
주요 국제적인 노력 16S rRNA amplicon 시퀀싱에 대 한 표준 입 대 했습니다. 그러나, 몇몇 연구 보고 배치 효과 의해 발생 하는 변이의 일반적인 소스. 이 효과, 샘플 수집, 제복을 입은 프로토콜을 최소화 하기 위해 처리 및 시퀀싱을 구현 합니다. 이 프로토콜은 배설물 샘플 컬렉션에서 데이터 분석을 시작 하는 광범위 하 게 사용된 프로토콜의 통합을 제안 합니다. 이 프로토콜 열-무료, 직접 PCR 접근 동시 처리 및 v 4 지역의 PCR 증폭 함께 배설물 샘플의 많은 수의 DNA 추출 가능 하 게 포함 되어 있습니다. 또한, 프로토콜 분석 파이프라인을 설명 하 고 QIIME (QIIME 2 버전 2017.7.0 및 DADA2)의 최신 버전을 사용 하 여 스크립트를 제공 합니다. 이 단계별 프로토콜 강력한, 생식, 사용 하기 쉬운, 상세한 방법에 16S rRNA amplicon 시퀀싱의 사용을 시작에 관심이 안내 목적 이다.
Introduction
미생물 다양 성과 풍요, 건강 하 고 병 적인 조건에 개인 간의 유사성과 차이점을 캡처의 또 다른 측면으로 이해에 집중된 노력 되었습니다. 나이2,3, 지리4, 라이프 스타일5,6및 질병5 창 자 미생물의 성분과 관련 된 것으로 표시 했다 하지만 많은 조건과 인구 아직 되지 않은 완전히 특징. 최근에 미생물 치료 응용 프로그램7,,89수정할 수 있습니다 보고 되었습니다. 따라서, 다양 한 생리 적 조건 및 미생물 구성 사이의 관계에 대 한 추가 통찰력의 잠재적인 미래 수정 최적화 향한 첫 번째 단계입니다.
전통 미생물 문화 방법 낮은 수율10,11에 의해 제한 되 고 중 박테리아가 이진 상태로 개념화에 현재의. 높은 처리량 DNA 기반 시퀀싱 미생물 생태학, 미생물 커뮤니티의 모든 구성원의 캡처 수 있도록 혁명을 했다. 그러나, 시퀀스 길이 품질 유지 정확한 분류 할당12중요 한 장벽을 읽기. 또한, 높은 처리량 기반된 실험 측정 비 생물학 또는 비 과학적인 변수13에 의해 영향을 받는 배치 효과에서 고통을 수 있습니다. 최근 몇 년 동안, 여러 프로그램 미국의 직감 프로젝트, 미국 (미국) 인간 Microbiome 프로젝트 및 영국 (영국) MetaHIT 프로젝트를 포함 하 여 인간의 미생물 연구 설립 되었습니다. 이 이니셔티브는 그들의 접근에 일관성의 부족으로 인해 쉽게 비교할 데이터의 방대한 생성. 다양 한 국제 인간 Microbiome 컨소시엄, 국제 인간 Microbiome 표준 프로젝트, 국립 표준 및 기술 (NIST) 같은 국제 프로젝트14 이러한 문제의 일부를 해결 하려고 , 신뢰할 수 있는 생식 결과의 달성을 사용 해야 미생물 측정에 대 한 표준을 개발 하 고. 여기에 설명 된 여러 광범위 하 게 사용 되는 방법15,16 16S rRNA 높은 처리량 (16S-seq)을 시퀀싱 시작 데이터 분석을 통해 배설물 샘플 컬렉션에서에 대 한 통합 된 프로토콜이입니다. 열 무료 PCR 접근, 식물 DNA16의 직접 추출에 대 한 원래 설계 된 프로토콜에 설명 합니다, 그리고 배설물의 많은 수의 동시 처리를 비교적 짧은 시간에 높은 품질의 샘플 타겟 DNA을 증폭 시퀀싱의 미생물 변수 v 4 지역의 일반적인 시퀀싱 플랫폼. 이 프로토콜 과학자 16S rRNA amplicon 시퀀싱의 사용을 시작 하는 강력한, 생식, 사용 하기 쉬운, 상세한 방법에 관심이 중요 한 컨트롤을 사용 하 여 안내 하는 것을 목표로. 가이드 및 상세한 단계-의해 단계 프로토콜 배치 효과 최소화할 수 있습니다 고 따라서 연구소 사이 더 비교 시퀀싱 결과 허용할 것 이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
16S rRNA amplicon 및 metagenomics 샷건 시퀀싱 임상 미생물학 응용 프로그램21,22,23에서 인기를 얻고 있다. 이러한 기술은 캡처 culturable와 비 culturable taxa, 병원 성 inoculum 그리고 더 정확 하 게 polymicrobial 감염을 식별 하는 능력의 상대적 풍요에 대 한 데이터를 제공 하는 증가 기능에 유리한 24지문. 미생물 연구의 분야에서 진보는 다양 한 접근?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품-코어 프로그램 (부여 번호 41/11), 이스라엘 과학 재단 (그랜트 908/15), 유럽 크 론 및 Colitis 조직 (헴)에 의해 부분적으로 지원 되었다.
Materials
| Primers | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Extraction solution | Sigma-Aldrich | E7526 | |
| Dilution solution | Sigma-Aldrich | D5688 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPABIOSYSTEMS | KK2601 | PCR Master mix |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit | Invitrogen | P7589 | dsDNA quantify reagent |
| MinElute Gel extraction kit | Qiagen | 28606 | |
| Agarose | Amresco | 0710-250G | |
| Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free | Biological Industries | 01-866-1A | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Molecular probes | Q32854 | dsDNA detecting kit |
| High Sensitivity D1000 | Agilent Technologies | Screen Tape 5067-5582 | separation and analysis |
| Screen Tape Assay | Agilent Technologies | Reagents 5067-5583 | for DNA libraries |
| PhiX Control v3 | Illumina | 15017666 | control library |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | E406-10mL-TAM | |
| 2 mL collection tubes | SARSTEDT | 72.695.400 | Safe Seal collection tubes |
| Plastic stick swab in PP test tube | STERILE INTERIOR | 23117 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR Machine | Applied Biosystems | 2720 Thermal Cycler | |
| Sequncing Machine | Illumina | Miseq | |
| PCR workstation | Biosan | UV-cleaner | |
| scissors | |||
| vortexer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
References
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