이 프로토콜에는 그들의 눈 운동의 운동학을 측정 하는 체 외에서 고립 된 거북이 머리 준비를 사용 하는 방법을 설명 합니다. 두개골에서 뇌의 제거 후, 두개골 신경 척도 회전 눈의 동 공 크기에 변화를 전류로 자극 수 있습니다.
동물 안락사는 후 그들의 조직 죽을 시작 합니다. 거북 특히 온 혈 척추 동물에 비교 될 때 그들의 조직의 더 긴 생존 시간 때문에 이점을 제공 합니다. 이 때문에, 신경 신호를 조사 하는 시간의 연장된 기간 및 그들의 대상 작업의 제어에 대 한 거북에 생체 외에서 실험을 수행할 수 있습니다. 고립 된 머리 준비를 사용 하 여, 거북, 눈 운동의 운동학 측정 그리고 전기 신호에 의해 그들의 변조 두개골 신경에 의해 수행. 두뇌는 두개골에서 제거 되었다, 후 그대로 두개골 신경, 해 부 머리에에서 배치 했다 안구의 움직임을 보정 하려면 짐 벌. 유리 전극은 두개골 신경에 연결 된 (oculomotor, trochlear, 그리고 abducens) 안구의 움직임을 연상 하는 전류와 자극. 우리는 적외선 비디오 추적 시스템 및 눈의 계량된 회전 안구의 움직임을 모니터링. 전류 펄스의 진폭, 주파수, 범위 그리고 기차 기간 응답에 미치는 영향을 관찰 하는 데 사용 했다. 준비는 뇌에서 분리 하기 때문에 근육 대상에가 하는 원심 성 통로 중앙 처리 감각 정보의 부재에서 신경 신호를 조사 하는 절연에서 시험 수 있다.
빨간 귀 슬라이더 거북 Electrophysiological 실험에 사용 하기 위한 근거:
빨간 귀 슬라이더 거북 (Trachemys scripta 선 충), 세계 최악의 침략 종1 중 하나 간주 됩니다 하 고 생태계 문제 임을 나타낼 수 있습니다. 왜 빨간 귀 슬라이더 거북은 그래서 성공 하는 이유는 제대로 이해 하지만 일부 했기 때문일 수도 있습니다 그들의 관용 생리학과 신경 조직의 hypoxic 조건2,3,4에서 살아남을 수 있는 소유 물 . 실험 그들의 숫자를 위협 하지 않습니다에 대 한 최소한의 노력으로 electrophysiological 준비 남아 있을 수 있는 실행 가능한 만큼 18 시간5,6연장된 기간 동안 그들을 사용 합니다. 혜택 또한 산소8의 낮은 레벨을 견딜 수 있는 대7, 같은 무척 추 동물 동물을 사용 하는 장점은 비슷합니다.
안구의 움직임을 측정 하기 위한 기법.
정면 eyed 동물 비 인간 영장류를 사용 하 여 안구의 움직임을 측정 하는 방법 잘 개발 된9되었습니다. 눈 회전 궤도 있는 3 개의 축: 수평, 수직, 및 비틀림. 마그네틱 검색 코일 방법 일반적으로 측정 회전에 대 한 가장 신뢰할 수 있는 것으로 간주 하지만 침략, 동물10,11의 scleras에 삽입 하려면 작은 코일을 요구. 비디오 기반 시스템도 수 측정 회전 하 고 비-침략 적 되 고의 이점이 있다. 혁신적인 이미지 처리 함께 더 나은 카메라의 개발 비디오 기반 시스템12,,1314를 고려 하는 매력적인 대안을 만드는 그들의 기능을 강화 했습니다.
Nonmammals에서 안구의 움직임을 측정 하기 위한 개발 기술을 훨씬 덜 중요 한 되었습니다. 측정 중 낮은 해상도 또는 회전15,16,,1718의 일부 설명. 개발의 부족 시각적 대상에 따라 훈련 nonmammals에 어려움에 부분적으로 비난 받을 수 있다. 비록 눈 움직임 잘 빨간 귀 슬라이더 거북19,20,21,22,23,,2425 에서 연구 26,,2728,29,30, 대상 추적 훈련 동물에서 도전 때문에 그들의 눈 움직임의 정확한 운동학은 저조한 이해.
빨간 귀 슬라이더 거북은 일반적으로 척추 옆 눈 간주 됩니다 하지만 그들은 완전히 그들의 셸31에 그들의 머리를 철회 수, 때문에 등 딱지에 의해 측면 시각 필드의 중요 한 폐색 발생32. 결과 그들의 시각 가시 더 정면 눈 포유류 처럼 행동 그들 앞쪽 강제로. 따라서, 안구의 움직임을 측정 하기 위한 접근 방법을 개발 하기 위한 모델 사용은 또한 독특한 진화 관점을 제공 합니다.
이 작품에서 설명 하는 프로토콜 빨간 귀 슬라이더 거북의 눈 운동의 운동학을 식별 하는 생체 외에서 고립 된 머리 준비를 사용 합니다. 두뇌는 두개골 신경 그대로 두개골에서 해 부. 머리는 눈 근육 innervating 두개골 신경의 전기 자극에 의해 안구의 움직임을 보정 하 여 반응을 짐 벌에 배치 됩니다. 조치는 눈에 의해 회전의 어두운 눈동자와 아이리스의 표시를 추적 하는 소프트웨어 알고리즘을 사용 하는 비디오 기반 시스템에 의해 수행 됩니다. 운동학 extraocular 모두 (즉, 수평, 수직, 및 비틀림 회전)을 측정 하 기회를 제공 하는 준비32 및 안 구내 (즉, 눈동자 변화)33 움직임.
원심 성 신경 경로의 분석을 위한 모델 시스템:
접근 기회 공부 어떻게 원심 성 신경 신호를 생성 눈 움직임 근육 뇌32에 의해 처리 된 통합 감각 정보의 부재와 그들의 편안한 상태에서 시작 하는 조사를 제공 하는 더 일반적으로, 33. 따라서, 눈 운동학 있는 그들은 전적으로 원심 성 신경 통로 떠나 뇌와 근육에 synapsing에 의해 처리 되는 모델 시스템에서 시험 될 수 있다.
중요 한 단계:
이 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 다음과 같습니다: 1) 해 부와 transected 신경;의 생존 능력을 유지 하 게 하는 치료 2)과 일치 하는 크기의 두개골 신경 하 일관 된;에 흡입 전극 그리고 3) 눈의 회전의 적절 한 보정을 제공 하는 짐 벌에 머리의 배치.
문제 해결:
해 부도 전하실 수 있습니다, 하지만 그것에 게 몇 번을 완료 단?…
The authors have nothing to disclose.
저자는 기술 지원에 대 한 부인 Paulette 멕 케 나 및 비서 지원에 대 한이 연구에서 리사 Pezzino 씨 필 Auerbach을 감사합니다. 저자는 또한 우리 체 외에서 고립 된 머리 준비를 도입에 대 한 박사 마이클 아리엘과 마이클 S. 존스 (세인트 루이스 대학의 학부) 감사 합니다. 이 협력의 지원에 대 한 자금 학과 생물학 (로버트 S. 체이스 펀드), 학술 연구 위원회 그리고 라파예트 대학 신경 과학 프로그램에 의해 제공 했다. 마지막으로,이 작품은에 전념 씨 필 Auerbach, 28 9 월 2016; 돌아가 그는 스캐닝 전자 현미경을 해제 하 고이 프로토콜에 사용 하기 위해 그것의 5 축 단계의 유용성을 인식. 그의 우정과 지 략 크게 그리울 것 이다.
Red-eared slider turtles | Kons Scientific | Trachemys scripta elegans | Large size (carapace length 15-20 cm) |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5886 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | P5405 | |
Magnesium choride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M7304 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S5761 | |
Dextrose | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C5767 | |
Concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich Co. LLC. | H7020 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | C7902 | |
pH meter | Oakton | pH 6+ | |
Suction stimulation electrode | A-M Systems | 573000 | Bipolar suction electrode. Note that 573000 has been replaced with 573050. |
Capillary glass | A-M systems | 626000 | Single-barrel borosilicate capillary glass without microfilament, length 10 cm, outside diameter 1.0 mm, inner diameter 0.50 mm |
Alternative suction stimulation electrode | A-M Systems | 573050 | Bipolar suction electrode. Requires larger diameter capillary glass: 627000, outside diameter 1.2 mm, inner diameter 0.68 mm |
Stereoscope | Lieca | GZ7 | Magnification range, 10x – 70x |
Fiber optic light source | Amscope | HL250-A | 150W Fiber optical microscope illuminator light box |
Rongeurs | Carolina Biological Supply Company | 625654 | stainless steel, straight spring, 5.25" |
Blunt dissection probe | Carolina Biological Supply Company | 627405 | Huber mall probe, double-ended probe and seeker, 6" |
Microscissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Iris microdissecting scissors, stainless steel, 0.5" blades, 4.75" long |
Fine forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | F6521 | Jewelers forceps, dumont No. 5, inox alloy, 4.25" |
Curved forceps | Sigma-Aldrich Co. LLC. | Z168696 | Medium tip, curved forceps, stainless steel, 4" |
Scalpel handle | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2896 | Scalpel handles, No. 3, stainless steel |
Scalpel blade | Sigma-Aldrich Co. LLC. | S2771 | Scalpel blades, No. 11, steel |
Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1918 | Kleine guillotine type 7575 |
Spatula | Sigma | Z648299 | Micro spoon and spatula weighing set. Use small spatula: 5.9” long x 0.07” diameter handle with square end: 0.17” x 1.3” long, other end round: 0.17” x 1.27” long |
Hook | Autozone | 98069 | SureBilt hook and pick set. Use grinder to dull sharp points of hook to prevent injury to animals mouth. |
95/5% O2/CO2 | Airgas, Inc. | X02OX95C2003102 | 5% Carbon dioxide balance oxygen certified standard gas mixture, size 200 Cylinder, CGA-296 |
Regulator | Airgas, Inc. | Y11244D296-AG | Single stage brass 0-100 psi analytical cylinder regulator CGA-296 with needle outlet. Use brass adjustable airline pipe valve to go from 3/8", inner diameter, vinyl airline tubing connected to regulator to a 3/16", inner diameter, airline connection going to airstone or glass pasteur pipette. |
Adjustable airline pipe valve | Doctors Foster and Smith | CD-12061 | Brass valve |
Rigid table | Unknown | Unknown | Auto-clave door laid on top of a sturdy table. Nine 5" diameter tennis balls isolate vibrations from the top surface of the table. |
5" tennis ball | Petco Animal Supplies, Inc. | 712868 | Petco Jumbo Pet Tennis Ball: balls are unsliced and held within an integrated frame on the underside part of the autoclave door. |
Alternative vibration isolation table | Newport Corporation | INT1-36-6-N | Rigid vibration control system, integrity 1: Surface dimensions, 3' x 6' |
Gimbal | ISI, International Scientific Instruments, Inc. | Stage from SUPER III-A Scanning EM | 5-axis eucentric stage: X, Y, and Z linear movements, ±20 mm, 0.1 mm precision; Rotations, vertical, ±10°, and horizontal, ±12.5°, with 1.25° precision. Note: from decommission instrument. |
Chuck for gimbal | Unknown | Unknown | Chuck from an old microtome of unknown manufacture was machined to fit the shaft of the specimen holder of the Scanning EM stage |
Alternative gimbal | ThorLabs, Inc. | GN2/M with MBT602/M | Dual-axis goniometer (GN2/M) mounted on 3-axis microblock stage with thumbscrew adjusters (MBT602/M): design a chuck to hold turtle head with eye at 12.7 mm above top surface of goniometer (distance to point of rotation) |
Video-based eye tracking system | Arrington Research, Inc. | ViewPoint EyeTracker, PC-60 | Tracking method: Infrared video by dark pupil; Black and white camera (Item BC02): 30 Hz, 640 x 480; System requirements: Windows 2000, XP, 7, 8, 8.1, 10; Visual range: Horizontal +/- 44°; vertical +/- 20°; Accuracy ~0.5°; Spatial resolution ~0.15°; Pupil size resolution ~0.03 mm; Eye data: X, Y position of gaze, pupil height and width, torsion, delta time, total time, and regions of interest (ROI); Real-time communication (Item 0022): 4-Channel AnalogOut with eight TTL input channels to mark codes into the data file |
Multi-position magnetic base | Harbor Freight Tools | Pittsburg, item #5645 | Magnetic holder reaches up to 12" and produces 45 lbs. of magnetic pull. Use to position camera. Machine thread holes onto the end of the rod to mount cameras. |
Micromanipulator | Kopf | 900 | 5 axis manipulation for mount of suction electrode: X, Y, Z linear travel, 2 axis of rotation |
Dissection scope on boom | Lieca | GZ6 | Magnification range, 6.7x – 40x |
Nerve/muscle stimulator | Astro-Med Grass Telefactor | Grass S88 | Dual pulse voltage stimulator: two output channels that can be operated independently or synchronized to generate non-isolated constant voltage pulses (10 mv to 150 V). Pulses can be single (10 μsec to 10 sec), repetitive (0.01 Hz to 1 KHz), and trains (1 ms to 10 s) and synchronized with TTL inputs and output. Send TTL outputs via the output channels of a DB25 connector to the TTL input channels of the ViewPoint EyeTracker. Note: Astro-Med Grass Telefactor is no longer in business. |
Current isolation device | Astro-Med Grass Telefactor | PSIU6 | Current stimulus isolation unit: enables safe delivery of constant currents by the S88 to the preparation. The PSIU6 connects by a BNC cable to one of the output channels of the S88. Multiplier switches on the PSIU6 allow the S88 to generate a wide array of current amplitudes ranging from 0.1 µA to 15 mA. |
Alternative nerve/muscle stimulator with isolation | A-M Systems | 2100 | Isolated Pulse Stimulator: Unit has built-in isolator to produce constant currents. |