Summary
Rask og nøyaktig påvisning av anlegget patogener på stedet, særlig jord-borne patogener, er avgjørende for å hindre ytterligere inoculum produksjon og spredning av plantesykdommer i feltet. Metoden utviklet her bruker et bærbart sanntid PCR deteksjon system gjør på stedet diagnose under feltforhold.
Abstract
Stedets diagnostisering av anlegget sykdommer kan være et nyttig verktøy for bøndene for rettidige beslutninger aktivere tidligere gjennomføring av strategier for behandling av sykdom som reduserer virkningen av sykdommen. Øyeblikket i mange laboratorier, polymerasekjedereaksjons (PCR), spesielt sanntid PCR, regnes den mest følsomme og nøyaktige metoden for plante patogen gjenkjenning. Men krever laboratorie-baserte PCRene vanligvis dyre laboratorieutstyr og dyktige personell. I denne studien brukes jord-borne patogener potet å demonstrere potensialet for på stedet molekylær gjenkjenning. Dette var oppnådd, med en rask og enkel protokoll består av magnetiske perle-baserte nukleinsyre utvinning, bærbare sanntid PCR (fluorogenic probe-baserte analysen). Bærbar sanntid PCR tilnærming sammenlignet gunstig med et laboratorium-basert system, oppdager løpet av 100 eksemplarer av DNA fra Spongospora subterranea. Bærbar sanntid PCR metoden utviklet her kan tjene som et alternativ til laboratorium metoder og et nyttig på stedet verktøy for patogen diagnose.
Introduction
Nøyaktig og rask identifikasjon forårsaker patogener betydelig påvirker beslutninger om plante sykdom ledelse. Jord-borne sykdommer er spesielt vanskelig å diagnostisere fordi jord miljøet er ekstremt store i forhold til plante masse og komplekse, noe som gjør det til en utfordring å forstå alle aspekter av jord-borne sykdommer. Videre jord-borne sykdommer kan være symptomless under tidlig infeksjon stadier, avhengig av miljømessige stressorer, og noen har latent lengre som forsinket diagnoser1. Mange jord-borne patogener har utviklet overlevelse strukturer, for eksempel spesialiserte sporer eller melanized hyfer, som kan overleve i jord i mange år selv i fravær av deres verter. Benyttet tilnærminger for jord-borne sykdom ledelse inkluderer: unngå kjent infested felt ved patogen-fri sertifisert frø og planter, holde utstyr sanitære og begrenser bevegelsen av jord og vann når det er mulig. Kunnskap om patogen tilstedeværelse gjennom molekylær oppdagelsen strategier kan også spille en nyttig rolle ved å informere rettidige beslutninger om tidlig stadium behandlinger eller pre plante vurderinger av feltene. Stedets testing gir flere fordeler ved å gi en rask resultat uten å sende utvalget til en diagnostisk laboratorium at kanskje et stykke unna og også kan engasjere dyrkeren hvis slik en diagnose utført "feltet-siden" i deres nærvær.
For på stedet diagnose basert på molekylære gjenkjenning, følsomhet, spesifisitet, robusthet (repeterbarhet og reproduserbarhet) og effektivitet (dvs., enkelhet og kostnader) er avgjørende faktorer for vurdering. Lateral vannføring enheter (LFDs) som Immunostrip og PocketDiagnostic, populære metoder for påvisning av stedets patogen på grunn av sin enkelhet som en ettrinns analysen. Men kan LFDs ikke være rett diagnoseverktøyet i alle situasjoner fordi de mangler sensitivitet og spesifisitet, og noen ganger gir tvetydig resultater hvis målet patogen Lavinnblanding og kan cross-react med lignende arter eller arter 2. Loop-mediert isotermiske forsterkning (lampe) gjelder også for på stedet patogen gjenkjenning og er spesielt rimelig rimelige reagenser, reaksjonen forhold som er konstante, og enkel kolorimetrisk visuell analyse. Både LFDs og lampe vanligvis brukes imidlertid kvalitativt, selv om begge tilnærminger kan brukes kvantitativt med dyrere utstyr3. Polymerasekjedereaksjons (PCR) tilbyr høy spesifisitet, høy følsomhet og en kvantitativ evne i forhold til de nevnte metodene gjenkjenning. Men krever konvensjonelle lab-basert PCR teknologien dyre laboratorieutstyr og dyktige personell, som er en stor ulempe i vedta denne teknologien som en gjenkjennings-metoden for på stedet formål.
I denne protokollen, er en egen diagnostisk metode bruke en bærbar sanntid PCR instrument vist. Sanntid PCR-teknologi tilbyr fordeler over andre metoder når det gjelder kvantitativt nøyaktighet, følsomhet og allsidighet, og har vært mye brukt for påvisning av et bredt spekter av anlegget patogener4,5, inkludert ulike potet patogener i jord6. På grunn av de nye trendene for hurtig voksende og konkurransedyktige markedet, har utstyr som kreves for PCR-teknologi fortsatt å utvikle for å være mer kompakt og billigere7. Protokollen består av følgende: magnetisk perle-baserte nukleinsyre utvinning, bærbare sanntid PCR (fluorogenic probe-baserte analysen) og kvantitative dataanalyse som kan alt gjøres eksternt ved hjelp av en bærbar datamaskin (figur 1).
Ved hjelp av bærbare PCR-protokollen utviklet her, jordprøver ble analysert for å oppdage jord-borne patogen, Spongospora subterranea. Spongospora ble valgt som det er en viktig potet patogen som kausale agent pulveraktig skorpe8. I de siste tiårene som tilstedeværelse av denne sykdommen å ha spredt seg til mange områder der poteter er vokst9,10. Pulveraktig skorpe, gjennom tilstedeværelse av kvise som lesjoner på knoller kan forårsake betydelig kvalitativ gir tap på potet dyrkere. I tillegg kan S. subterranea vektor potet mopp topp Virus (PMTV), som kan forårsake interne lesjon symptomer i knoller (kjent som spraing)11,12. Derfor er det viktig å vite om S. subterranea finnes i felt før planting6. Vi viser også nytten av denne protokollen for påvisning av Rhizoctonia solani anastomose gruppe 3 (AG3) og PMTV. Selv om flere anastomose grupper av Rhizoctonia solani føre sykdommer i poteter, AG3 er uten tvil den viktigste verdensomspennende13, forårsaker stamme forderve og svart scurf resulterer i salgbare gir tap på opptil 30%14. PMTV fører nekrotisk lesjoner i knoller, ofte kalt spraing. Dette viruset har nylig rapportert for første gang flere stater i de nordvestlige15,16,17, og er av økende bekymring for bøndene i denne viktige potet voksende regionen. I tillegg til å fastsette hvor effektive bærbare PCR for disse viktige sykdommer, optimal DNA utvinning metodikk og jord utvalgsstørrelsen ble også undersøkt i denne studien.
Resultatene tyder på at den bærbare PCR-metoden er allsidig og gjelder for påvisning av forskjellige patogener. Stedets oppdagelsen metoden vi utviklet kan tillate frontline arbeiderne i landbruket (f.eks dyrkere) å gjøre tidligere vedtak om sykdom ledelse, som ulike valg eller rotasjoner, og kan kvantifisere en plante patogen i utvalget under en feltet undersøkelse, før planting, for å unngå potensielle sykdomsutbrudd.
Protocol
1. på stedet molekylær påvisning av patogener med en bærbar Real-Time PCR System
Merk: Se figur 1.
- Magnetisk perle-baserte DNA utvinning
Merk: En magnetisk perle-baserte DNA utvinning kit (f.eks fra Primerdesign) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner. Reagenser bør lagres ved romtemperatur (18-25 ° C). Når lyofilisert proteinasen K (flaske No.1) er suspendert (med flaske No.1a), lagre på 20 ° C.- Bland 20-50 mg jordprøve med 500 µL av prøven Prep løsning i en microtube.
Merk: Jord: Prep løsning er viktig som blande dem i andre forhold kan forårsake feil på nedstrøms eksperimenter (f.eks forurensning av hemmere av PCR). - Grind jorden på bunnen av røret med en liten sterilt støter til løsningen er overskyet. Videre suspendere jordpartikler i løsningen ved å riste microtube og la den stå, fred, la jord partikler bosette helt (vanligvis mellom 5 til 10 min).
- Overføre 200 µL av nedbryting i en fersk microtube og legge 200 µL av lyseringsbuffer (flaske nr. 2: Guanidine hydroklorid løsning) og 20 µL proteinasen k (flaske No.1).
- Bland den lysate godt ved å snu røret og ruge ved omgivelsestemperatur i 15 min.
Merk: Hvis den lysate finnes på microtube lokket, trykk røret eller bruk en sentrifuge, hvis tilgjengelig for å fjerne fra lokket. - Legg til 500 µL av bindende buffer/magnetisk perle mix (flaske No.3) lysed prøven. Bland godt pipettering opp og ned og ruge ved omgivelsestemperatur i 5 min fra magnetiske tube stativet.
Merk: Pass på å blande perle løsningen godt før bruk for å sikre at perlene er aliquoted jevnt fra lagring flasken. - Plasser microtube på magnetiske tube stativet. Vent i minst 2 minutter, eller til alle perlene i microtube legge til magnetisk-sideveggen. Deretter fjerner og forkaste alle nedbryting av pipettering.
Merk: Ikke forstyrr magnetisert perlene mens fjerne og aspirating nedbryting. DNA har nå blitt fanget av magnetiske perler. - Fjerne microtube ut magnetiske rør, legge til 500 µL av vask Buffer-1 (flaske nr 4: natrium enheter/etanol løsning) og å suspendere perler av gjentatte pipettering til perlene er jevnt spredt. Utføre dette trinnet vask fjerne protein og salt fra utvalget. La blandingen sitte for 30 s.
- Gjenta trinn 1.1.6.
- Fjerne microtube ut magnetiske rør, legge til 500 µL av vask Buffer-2 (flaske nr. 5: natrium enheter/etanol løsning) og å suspendere perler av gjentatte pipettering til perlene er jevnt spredt. La blandingen sitte for 30 s.
- Gjenta trinn 1.1.6.
- Fjerne microtube ut magnetiske rør og deretter legge 500 µL av 80% etanol (flaske No.6).
Merk: Dette trinnet er nødvendig for fjerning av rester salter fra utvalget.- Nytt suspendere perler av gjentatte pipettering til perlene er jevnt spredt. La denne stå i 10 min med sporadiske blanding av inversjon.
- Gjenta trinn 1.1.6.
- Luften tørr magnetiske perle pellet i 10 min ved omgivelsestemperatur med microtube lokk åpent.
Merk: Perlene skal være fri fra alle synlige gjenværende etanol, men ikke helt tørket ut. - Fjerne microtube ut magnetiske rør, legge til 50-200 µL av elueringsbufferen (flaske nr.7) og å suspendere perler av gjentatte pipettering til perlene er jevnt spredt og la det stå i 30 s.
Merk: I trinnene ovenfor, er renset DNA løslatt fra de magnetiske perlene i elueringsbufferen. - Plasser microtube på magnetiske tube stativet. Vent i minst 2 minutter, eller til alle perlene i microtube legge til magnetisk-sideveggen.
- Overføre nedbryting som inneholder nå de renset DNA/RNA til en 0,5 mL microtube for bruk i nedstrøms trinnene.
- Bland 20-50 mg jordprøve med 500 µL av prøven Prep løsning i en microtube.
- Bærbar sanntid PCR
Merk: En bærbar thermocycler og PCR analysen kit ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner (se Tabell for materiale).- Åpne og kjøre thermocycler-assosiert programvaren, velg mål gjenkjenning og innspill alle beskrivelse informasjonen inn navn og detaljer, Notes, eksempler og tester dataregistreringsfeltene.
Merk: Wells #1 og #2 er utpekt av programvaren for negativ kontroll og positiv kontroll, henholdsvis. - Forberede PCR reagenser før bruk. Overføre 500 µL av master mix re-oppheng bufferen i rør med lyofilisert master blandingen og bland godt av inversjon. Overføre hele master blandingen til den brune microtube merket primere/sonde (tabell 2).
- Cap og riste microtube å blande. Grundig blande er nødvendig for å sikre at alle komponenter er nytt suspendert helt. La denne blandingen sitte i 5 min. før bruk.
Merk: Lagre reaksjonen blanding på 20 ° C etter bruk.
- Cap og riste microtube å blande. Grundig blande er nødvendig for å sikre at alle komponenter er nytt suspendert helt. La denne blandingen sitte i 5 min. før bruk.
- Forberede en negativ kontroll ved å overføre 10 µL av forberedt reaksjonen blanding fra forrige trinn inn i et 0,2 mL PCR rør og deretter legge 10 µL av sterilt nuclease-fri deionisert vann.
- Forberede en positiv kontroll ved å overføre 10 µL av forberedt reaksjonen blanding fra trinn 1.2.2 inn i et 0,2 mL PCR rør og deretter legge 10 µL av positiv kontroll.
- For hver prøve, overføre 10 µL av forberedt reaksjonen blanding fra forrige trinn til en 0,2 mL PCR rør, og deretter legge 10 µL av prøven DNA forberedt fra trinn 1.1.16.
- Last brønnene av thermocycler med innholdet fra sine respektive PCR-rør som beskrevet i trinn 2.1.1.
- Når all nødvendig informasjon er angitt og bekreftet, velge Start Kjør , og velg ethernet-tilkoblet maskinen eller en USB-stasjon.
Merk: Hvis alternativet USB kjøre er valgt, må kjøre filen lagres på stasjonen som skal brukes med thermocycler (f.eksF:\genesig). Kjør begynner umiddelbart etter at stasjonen er satt inn i thermocycler.
- Åpne og kjøre thermocycler-assosiert programvaren, velg mål gjenkjenning og innspill alle beskrivelse informasjonen inn navn og detaljer, Notes, eksempler og tester dataregistreringsfeltene.
- Dataanalyse av bærbare sanntid PCR.
- Når Kjør er ferdig, åpner filen kjøres (.usb) fra USB-stasjonen ved hjelp av thermocycler-assosiert programvare eller direkte vise kjøre resultatene i programvaren ved å klikke resultater.
- Før analysere resultatene, kan du lagre fullførte Kjør for å unngå å miste data.
- I kategorien resultatene vise statusen for kjøre, kategorisert etter prøver.
Merk: Data som finnes i denne kategorien er statusen for resultater og kopiere nummer oppdaget i utvalget. - Klikk på fanen for å vise forsterkning kurvene . Når målet er vellykket oppdaget, vises Cq (kvantifisering syklus) verdier av både målet og intern kontroll.
Merk: Disse verdiene beregnes i sluttrapporten og brukes til å avgjøre om en prøve er positivt for målet, og hvis det er problemer med reaksjonen eller DNA-prøvene.
2. andre protokoller
-
Alternative lab-basert DNA utvinning metoder
-
CTAB-fenol-kloroform metoder
- Utføre CTAB-fenol-kloroform basert metoder, følgende Doyle metoden18 og Dellaporta metoden19 som beskrevet tidligere.
-
DNA mini forberedelse metode
Merk: Edwards metoden20 ble utført som følger.- Legg til 500 mg av jord, etterfulgt av fem 1,4 mm keramisk perler og 750 µL Edwards bufferen (200 mM Tris, pH 8.0, 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS) i en microtube og bland godt.
- Inkuber microtube ved 65 ° C i 5 minutter.
- Homogenize prøven med en perle beater homogenizer for 60 s (eller ved å bruke en morter).
- Sentrifuge prøven 14.000 x g i 5 min.
- Overføre 500 µL av nedbryting til en frisk microtube og bland med 500 µL av kjølt isopropanol. Bland ved å snu røret 10 ganger.
- Sentrifuge prøven 14.000 x g i 15 min til pelletize DNA.
- Dekanter nedbryting og la DNA pellet luften tørr ved romtemperatur til gjenværende etanol har fordampet.
- Vask DNA pellets med 750 µL av kjølt 70% etanol.
- Lufttørke pellet før re frakobles i 50-100 µL av TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0 og 1 mM EDTA).
-
Andre Alternative metoder
- Utfør Silica-base DNA utvinning bruke kit #1 (MP BIO rask DNA Spin) og kit #2 (Zymo BIOMICS DNA Miniprep Kit) i henhold til produsentens instruksjoner.
-
CTAB-fenol-kloroform metoder
-
Konvensjonelle lab-basert sanntid PCR.
Merk: En tradisjonell thermocycler ble brukt med mastermix for probe-baserte PCR, forskjellige primere og oligonucleotide sonder (tabell 2).- Bruke ikke-gjennomsiktige bunn PCR rør eller en PCR plate, forberede 20 µL reaksjoner for alle DNA-prøver som skal analyseres, samt en negativ kontroll (nuclease-fri deionisert vann) og en positiv mal kontroll forberedt internt.
- For hver PCR rør eller vel, Forbered en blanding inkludert 10 µL av mastermix, 7 µL nuclease-fri deionisert vann, 2 µL av 2 µM primere/probe og 1 µL av DNA-prøve (fra trinn 1.1.16 eller 2.1) eller kontrollmal, per prøve.
- Lukk PCR rør eller plate og begynner reaksjonen ved å velge det riktige PCR-programmet.
-
Dataanalyse av konvensjonelle lab-basert sanntid PCR
- Bruk thermocycler-assosiert programvare for å analysere resultatene fra de konvensjonelle thermocycler. Skal starte dataanalyse, overføre filen kjøres fra thermocycler til en USB-stasjon, sett en USB og velg Eksporter.
- Åpne datafilen (.pcrd) fra den eksporterte kjører i thermocycler-tilknyttet programvare.
- Merk av et eksempel ved å finne tilsvarende på apparatet. Genereres automatisk forsterkning kurver og standard kurver (hvis aktuelt). Eksempel-informasjon er ikke angitt, klikk Plate oppsett eller en lignende funksjon for å starte inndata før analysere data.
- Vise dataene i kategorien kvantifisering. Dette kan eksporteres for dataanalyse med en tredjeparts programvare som CSV, XML eller HTML lesere.
- Få Cq data basert på bestemt grensene og sammenligne den med de positive og negative kontrollene.
Merk: Hvis DNA standarder for målet ble brukt i analysen, sammenligne Cq eksempeldataene som av å avgjøre Cq cut-off
Representative Results
Sammenligning av DNA utvinning metoder
Kompatibiliteten til en magnetisk perle-basert DNA utvinning metode med sanntid PCR ble evaluert av oppdage mengder S. subterranea DNA i en jordprøve fra feltene befengt med patogen. Som vist i supplerende figur 1, ble den magnetiske perle-basert metoden sammenlignet med de andre metodene som CTAB-fenol-kloroform basert metode18, rask DNA mini forberedelse metoder19,20, og andre standard silisium-baserte DNA utvinning prosjektpakker. DNA-prøver utdraget benytter seks ulike metoder ble utsatt for konvensjonelle lab-basert sanntid PCR. Resultatene antydet at den magnetiske perle-basert metoden er sammenlignbare med de andre metodene, selv om silisium-baserte DNA utvinning kit viste de beste resultatene blant metodene vi testet. Alle pakkene inneholder guanidinium thiocyanate eller guanidinium hydroklorid: begge er kraftig chaotropic agenter, som denature de fleste av mobilnettet proteiner som RNases og DNases. Derfor er bruker metodene egnet for både DNA og RNA utdrag.
Sammenligning mellom en bærbar sanntid PCR og en konvensjonell lab-basert sanntid PCR
Sammenligne sensitivitet og spesifisitet av en bærbar PCR til en konvensjonell lab-basert PCR, absolutt kvantifisering av patogen DNA ble utført ved hjelp av ulike mengder S. subterranea ITS genet, som ble gjennomført av pGEM-T vektoren21 . En rekke 10 ganger fortynninger av ITS genet (106 til 100 kopier) ble analysert med SsTQ primer/sonde angi22. Resultatene viste at metoden for bærbare PCR oppdaget målet patogen DNA (~ 100 eksemplarer), selv om følsomheten var 10 ganger lavere enn at den konvensjonelle lab-basert PCR-metoden, som oppdaget minst 10 kopier (figur 2).
For ytterligere validering ble kunstig infested jord testet. S. subterranea sporosori Hentet fra pulveraktig skorpe rot galls fra potet røtter. Jord var befengt med sporosori suspensjoner i en siste konsentrasjon av 105 sporosori/g tørr vekt av jord. Med metoden over magnetiske perle-baserte DNA ble Hentet fra infested jord prøvene, og 10 ganger føljetong fortynninger var forberedt på å få konsentrasjoner tilsvarende 105, 104, 103, 102101og 100 sporosori/g vekt av jord. DNA-prøvene ble brukt for PCR bruker SPO primer/sonde angi23. Resultatene viste at metoden for bærbare PCR har sammenlignbare analytisk evne til en konvensjonell lab-basert PCR metode, men igjen, følsomheten ble redusert med en faktor på ~ 10 (Figur 3).
Til slutt, vi testet en jordprøve fra et felt som var naturlig forurenset med S. subterranea. Magnetisk perle-baserte DNA utvinning ble utført på ulike mengder jord (10, 20, 50 og 100 mg av jord per 500 µL av utvinning buffer løsning). Resultatene antydet at den optimale vekten av jord som starter materiale for DNA utvinning var 50-100 mg (Figur 4). Jord beløp utenfor området forårsaket en feil nedstrøms PCR trinnene. Denne effekten kan være fordi når overflødig mengder jord brukes som starter materiale, forurensing (f.eks, Fenoliske forbindelser) kan forstyrre PCR24. Ved lavere volumer av jord være mengden av utdraget DNA lavere enn oppdagelsen grensen på PCR (f.eks, avkastningen av totalt DNA utdraget fra 10-20 mg jord var variert). Følsomhet var ganske sammenlignbart mellom bærbare PCR og konvensjonelle PCR metoder. Lignende resultater ble oppnådd i DNA-prøver av forskjellige utvinning metoder (supplerende figur 2)
Oppdaging av andre patogener av stedets oppdagelsen systemet benytter en bærbar sanntid PCR
Vi testet den bærbare PCR-metoden for å oppdage andre viktige jord-borne potet patogener, R. solani AG3 og PMTV. I denne studien utført vi sanntid PCR med RsTq primer/RQP1 sonde sett25 for R. solani AG3 oppdagelsen med DNA fra ren kultur. Vi har også utført sanntid PCR bruker PMTV-D primer/sonde angi26 for PMTV gjenkjenning med RNA fra et spraing symptomatisk tuber utvalg ble brukt. Som vist i figur 5, oppdaget metoden for bærbare PCR hell både patogener. Resultatene var sammenlignbar mellom den bærbare og konvensjonelle instrumenter, tyder på at den bærbare PCR-metoden er allsidig og gjelder for andre patogen oppdagelser hvis primer sekvensene designet for sanntids PCR.
Figur 1. Prosedyren for en bærbar sanntid PCR system for på stedet patogen gjenkjenning. Protokollen er sammensatt av trinnene i følgende rekkefølge: lysate forberedelse av kort homogenisering (A), magnetiske perle-baserte nukleinsyre utvinning (B), portable sanntid PCR (C) og kvantitative dataanalyse ved hjelp av en bærbar datamaskin (D). Merk at alle trinnene kan fullføres på nettstedet.
Figur 2 . Sammenligning av følsomhet mellom en bærbar PCR og en konvensjonell lab-basert PCR. Kvantifisering av patogen DNA ble utført ved hjelp av ulike mengder S. subterranea ITS genet (106 til 100 kopier) med SsTQ primer/sonden. Lineær regresjon mellom Logg verdien av S. subterranea plasmider DNA og gjensidige Logg verdien av Cq på de konvensjonelle thermocycler (A) og den bærbare thermocycler (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 . Sammenligning av deteksjon ytelsen i kunstig infested jord S. subterranea. Jord var kunstig infisert (105 til 100 sporosori/g vekt av jord) med S. subterranea sporosori suspensjoner. Med metoden over magnetiske perle-baserte DNA ble trukket ut fra infested jord prøvene. PCRene ble utført med jord prøvene med SPO primer/sonde satt. Lineær regresjon mellom Logg verdien av den starter i sporosori pr. gram jord og gjensidige Logg verdien på Cq på de konvensjonelle thermocycler (A) og den bærbare thermocycler (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 . Sammenligning av starter mengden jordprøver for DNA utvinning. Den magnetiske perle-basert metoden ble brukt for DNA utvinning fra 10, 20, 50 og 100 mg av jord prøvene. Sanntids PCRene ble utført med den bærbare thermocycler. Standard kurver representerer forholdet mellom mengden totalt DNA Hentet fra jord prøvene (x-aksen) og mengder PCR produkt (y-aksen) forsterket av Sss primer/sonde settet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 . Oppdaging av andre potet patogener, R. solani og PMTV. Sanntids PCRene ble utført ved hjelp av den bærbare thermocycler og de konvensjonelle thermocycler. R. solani AG3 ble oppdaget i totale DNA utvunnet fra ren kultur RsTq primere og RQP1 sonden (A) PMTV ble oppdaget i totale RNA trukket ut fra en PMTV-infiserte tuber utvalg med PMTV-D primer/sonden satt (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 . Diagnostiske pipeline for phytopathogens. Flytskjema viser en generell arbeidsflyt for phytopathogen diagnose. Merk at det tradisjonelle trinnet, f.eksvisuell identifikasjon, kan utelates hvis stedets molekylær oppdagelsen benyttes, noe som gjør hele prosessen med diagnose enkel og rask. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Bærbar sanntid PCR | Sanntid PCR | LAMPE | ELISA | Lateral-flyt | |
| Kostnad per mål reaksjon | $0.60-$8.47 | $0.60 | $0,75 | $0.60 | $4.74 |
| Sensitivitet | 100 eksemplarer | 10 kopier | 10 kopier | 1-10 sporosori33 1-10 ng/mL (protein)33 |
1-10 sporosori34 5 x 105CFU/mL35 |
| Tid utgifter | 90 minutter | 80-240 minutter | 50-90 minutter32 | 3-24 timer | 10-15 minutter |
| Forberedelse kreves | ●Nucleic syre utvinning ● Primer design |
●Nucleic syre utvinning ● Primer/sonde design |
● Nucelic syre utvinning ● Primer design |
● Protein utvinning ● Antistoffer |
I/T |
| Andre materialer som kreves | ● Bærbare thermocycler | ● Konvensjonelle thermocycler | ● Colormetric flekken ● Inkubator |
● Plate leser ● vaskeutstyr |
I/T |
Tabell 1. Relativ Draft av molekylære og serologisk gjenkjenningsmetoder for phytopathogens
| Primer | Sekvens (5 '-3)en | Måletb | |
| SsTQ-F13 | CCGGCAGACCCAAAACC | ITS1-ITS2 i S. subterranea | |
| SsTQ-R13 | CGGGCGTCACCCTTCA | ITS1-ITS2 i S. subterranea | |
| SsTQ-P13 | [FAM] CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG [TAM] | ITS1-ITS2 i S. subterranea | |
| Genesig S.subterranea primer/sonde | I/T | Utgangen i S. subterranea | |
| SPO1014 | GGTCGGTCCATGGCTTGA | ITS i S. subterranea | |
| SPO1114 | GGCACGCCAATGGTTAGAGA | ITS i S. subterranea | |
| SPOPRO114 | [FAM] CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT [TAM] | ITS i S. subterranea | |
| RsTqF119 | AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTT | ITS1-ITS2 i R. solani | |
| RsTqR119 | AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTT | ITS1-ITS2 i R. solani | |
| RQP119 | [FAM] TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC [TAM] | ITS1-ITS2 i R. solani | |
| Genesig PMTV primer/sonde | I/T | CP-RT i PMTV | |
| PMTV-D-F20 | AGAATTGRCATCGAAACAGCA | CP i PMTV | |
| PMTV-D-R20 | GTCGCGCTCCAATTTCGTT | CP i PMTV | |
| PMTV-D-P20 | [FAM] CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA [TAM] | CP i PMTV | |
| en Oligo DNA primere ble endret med FAM (6-carboxyfluorescein) eller TAM (5-carboxytetramethylrhodamine) | |||
| b ITS: Intern transkribert avstandsstykker, CP: pels protein; CP-RT: pels protein readthrough | |||
Tabell 2. Primere brukt i denne studien
Supplerende figur 1. Sammenligning av DNA utvinning metoder for påvisning av pulveraktig skorpe patogen. Seks forskjellige DNA utvinning metoder (A-F) ble sammenlignet for påvisning av pulveraktig skorpe patogen, S. subterranea i jordprøver. (B, D, F). DNA ble hentet ved hjelp silica-baserte kit #1 (se tabell for materiale for alle kit navn), silika-baserte kit #2 og magnetiske perle-baserte kit, repsectively. PCR ble utført ved hjelp av konvensjonelle lab-basert PCR thermocycler. Standard kurver representerer forholdet mellom mengden totalt DNA Hentet fra jord prøvene og mengder PCR produktet forsterkes av SsTQ primere/sonde settet. Klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende figur 2. Sammenligning av grensen for påvisning mellom en bærbar PCR og en konvensjonell lab-basert PCR. Total DNA ble isolert fra en jordprøve bruker tre ulike utvinning metoder: (A, B) Doyle metoden (C, D) silisium-baserte kit #2, og (E, F) den magnetiske perle-baserte kit. Grafer vist til venstre data bruker den bærbare thermocycler med Sss primere/sonde settet, mens grafene til høyre representerer data generert ved hjelp av konvensjonelle lab-basert thermocycler med SsTQ primer/sonden satt. Klikk her for å laste ned dette tallet.
Discussion
Som vist i tabell 1, har siste teknologiske fremskritt i molekylær identifikasjon av patogene agenter økt effekt, nøyaktighet og hastighet av diagnose, som har bidratt til oppdagelsen av pre symptomatisk infeksjoner27. Om stedets diagnose, lampe og lateral-flow metoder brukes ofte fordi de er bærbare og gir umiddelbare resultater til en lavere kostnad. Men i serologisk metoder, kan artsspesifikke gjenkjenning være vanskelig å oppnå. Dette fører noen ganger misdetection av off-målet mikrober som vanlig jord innbyggere. For eksempel kan det være kryssreaksjon mellom serologisk tester av Phytophthora spp. og Pythium spp. ved potet patogener28, som indikerer at det er noen ganger problemer oppdage målrettet anlegget patogener.
Studien, har vi utviklet en optimalisert protokoll på stedet molekylær deteksjon av jord-borne potet patogener ved hjelp av bærbare sanntid PCR-systemet ved å sammenligne sine evner med at av en konvensjonell lab-sanntid PCR systemet. Vi fant at metoden på stedet spesielt oppdager potet patogener i jordprøve, selv om følsomhet er ~ 10 ganger lavere enn for en tilsvarende lab-basert analyse. Det er også verdt å vurdere at i dette tilfellet både laboratorium og feltet test ikke brukte en biologisk relevante utvalgsstørrelsen. Store utvalgene er nødvendig i rutinemessig screening feltet jord som beskrevet tidligere29,30, hvor utvalgene av mellom 250 g til 1 kg er behandlet, selv om disse metodene krever dyktige operatører og sofistikert utstyr for å trekke ut DNA. Vanligvis hentes en storstilt jord DNA pakke fra en enkelt samlet jord eksempel representant for mange underutvalg over 1 til 4 hektar6,29,30. Men protokollen utviklet her er rask, lett-å-bruk for brukere uten tidligere erfaring i molekylær diagnostikk og kan brukes utenfor en lab. Metoden er rask og relativt billig sammenlignet med storskala jord utvinning, kan den brukes til skjermen mange småskala prøver tatt fra et tilsvarende område som prøvetaking til storskala samlet prøver. Dette kan overvinne noen av en liten utvalgsstørrelsen og finne mer informasjon om den romlige fordelingen av patogen i feltet. I tillegg portabiliteten og hastigheten på metoden betyr at den kan også brukes i demonstrasjonen aktiviteter til bøndene for pedagogiske og engasjement.
En annen vurdering er at mange sanntid PCR analyser er allerede publisert for et bredt spekter av anlegget patogener5. Dette systemet kan gjøre bruk av disse eksisterende analyser uten behovet for å designe nye lampe primere aktivere i feltet testing. En hyppig kritikk av lampe analyser er at de kan være vanskelig å utforme31. Bærbar PCR, derfor kan relativt lett gjennomføringen av en rekke lett tilgjengelige patogen tester på stedet testing.
Tradisjonelle metoder kan ofte kostbare, arbeidskrevende, unøyaktig og tidkrevende. Enkelheten i stedet metoden utviklet vi kan bønder og arbeidere patogen etter seg selv og kanskje generere et resultat mye raskere enn å sende til en diagnostisk laboratorium som kan være et stykke borte. Promptness og følsomhet for den bærbare PCR-metoden kan hjelpe growers unngå potensielle sekundære infeksjoner, som kan øke patogen befolkningen og utilsiktet spredning (via utstyr eller mennesker). Avslutningsvis gjør på stedet metoden utviklet studien nøyaktig og relativt følsom oppdagelsen av viktige jord-borne patogener i feltet. Vårt håp er at stedet metoden som ble utviklet i denne studien vil bidra i en gjeldende diagnostiske rørledning (figur 6), ikke bare ved å gi raske og nøyaktige svar på epidemiologisk spørsmål om anlegget sykdommer i feltet, men også ved å tilby økt forståelse av biologi og epidemiologi av plante-patogener.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for Dr. Neil C. Gudmestad ved North Dakota State University for å gi S. subterranea plasmider DNA, Dr. Hanu Pappu på Washington State University (WSU) for å gi PMTV RNA og Dr. Debra Inglis på WSU for å gi R. solani AG3. Spesiell takk til Dr. Jeremy Jewell på WSU for å gi kommentarer på manuskriptet og WSU CAHNRS kommunikasjon for videography. Denne forskningen ble støttet av Northwest potet forskning konsortiet og det Washington State Department of Agriculture - spesialitet beskjære Block Grant Program (gi nei. K1764). PPNS nr. 0741, avdeling av Plant patologi, College of Agriculture, menneskelige og naturlige ressurs Sciences, Agricultural Research Center, Luke prosjektet nr. WNP00833, Washington State University, Pullman, WA, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| White shell PCR plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
| CFX Manager | Bio-Rad | 1845000 | |
| SsoAdvanced Universal Probes Supermix | Bio-Rad | 1725280 | |
| CFX96 Touch qPCR instrument | Bio-Rad | 1855195 | |
| Ethylalcohol, pure 200 proof | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Fisher BioReagents | BP118-500 | |
| Phenol, Saturated | Fisher BioReagents | BP1750I-400 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Fisher BioReagents | BP152-5 | |
| q16 real-time PCR machine | genesig | MBS486001 | |
| Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525-017 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | JT Baker | 67-63-0 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) | JT Baker | 9535-03 | |
| iso-Amyl Alcohol | JT Baker | 9038-01 | |
| FastDNA Spin kit | MP Biomedicals | 6560-200 | Silica-based DNA extraction kit #1 |
| Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit | New England Biolabs | E3005S | |
| 0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes | Phenix Research | MPC-100LP | |
| Easy DNA/RNA Extraction Kit | Primerdesign | genesigEASY-EK | |
| genesig Easy 1.5 mL tubes | Primerdesign | genesigEASY-1.5 | |
| Magnetic tube rack | Primerdesign | genesigEASY-MR | |
| Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit | Primerdesign | Path-S.subterranea-EASY | |
| Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269-100G | |
| Pellet pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| DNA Miniprep kit | ZymoBIOMICS | D4300 | Silica-based DNA extraction kit #2 |
References
- Malcolm, G. M., Kuldau, G. A., Gugino, B. K., Jiménez-Gasco, M. delM. Hidden Host Plant Associations of Soil-borne Fungal Pathogens: An Ecological Perspective. Phytopathology. 103 (6), 538-544 (2013).
- Posthuma-Trumpie, G. A., Korf, J., van Amerongen, A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem. 393 (2), 569-582 (2009).
- Hill, J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol. 46 (8), 2800-2804 (2008).
- Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I., Boonham, N. Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus Using a Multiplex Real-Time Fluorescent Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 90 (5), 448-453 (2000).
- Schena, L., Nigro, F., Ippolito, A., Gallitelli, D. Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology. 110 (9), 893-908 (2004).
- Brierley, J. L., Stewart, J. A., Lees, A. K. Quantifying potato pathogen DNA in soil. Applied Soil Ecology. 41 (2), 234-238 (2009).
- Tomlinson, J. A., Boonham, N., Hughes, K. J. D., Griffin, R. L., Barker, I. On-Site DNA Extraction and Real-Time PCR for Detection of Phytophthora ramorum in the Field. Appl Environ Microbiol. 71 (11), 6702-6710 (2005).
- Harrison, J. G., Searle, R. J., Williams, N. A. Powdery scab disease of potato - a review. Plant Pathology. 46 (1), 1-25 (1997).
- Johnson, D. A., Miliczky, E. R. Distribution and development of black dot, Verticillium wilt, and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State. Plant Disease. 77 (1), 74-79 (1993).
- Merz, U. Powdery Scab of Potato-Occurrence, Life Cycle and Epidemiology. Am J Pot Res. 85 (4), 241 (2008).
- Jones, R. aC., Harrison, B. D. The behaviour of potato mop-top virus in soil, and evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wallr). Lagerh. Annals of Applied Biology. 63 (1), 1-17 (1969).
- Carnegie, S. F., Davey, T., Saddler, G. S. Effect of temperature on the transmission of Potato mop-top virus from seed tuber and by its vector, Spongospora subterranea. Plant Pathology. 59 (1), 22-30 (2010).
- Woodhall, J. W., Adams, I. P., Peters, J. C., Harper, G., Boonham, N. A new quantitative real-time PCR assay for Rhizoctonia solani AG3-PT and the detection of AGs of Rhizoctonia solani associated with potato in soil and tuber samples in Great Britain. Eur J Plant Pathol. 136 (2), 273-280 (2013).
- Banville, G. J. Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kuhn. American Potato Journal. 66 (12), 821-834 (1989).
- Crosslin, J. M. First Report of Potato mop-top virus on Potatoes in Washington State. Plant Disease. 95 (11), 1483-1483 (2011).
- Whitworth, J. L., Crosslin, J. M. Detection of Potato mop top virus (Furovirus) on potato in southeast Idaho. Plant Disease. 97 (1), 149-149 (2012).
- Kaur, N., Cating, R. A., Dung, J. K. S., Frost, K. E., Robinson, B. A., Hamm, P. B. First Report of Potato mop-top virus Infecting Potato in Oregon. Plant Disease. 100 (11), 2337 (2016).
- Doyle, J. J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12, 13-15 (1990).
- Dellaporta, S. L., Wood, J., Hicks, J. B. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep. 1 (4), 19-21 (1983).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research. 19 (6), 1349 (1991).
- Bittara, F. G., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. Chloropicrin Soil Fumigation Reduces Spongospora subterranea Soil Inoculum Levels but Does Not Control Powdery Scab Disease on Roots and Tubers of Potato. Am J Potato Res. 94 (2), 129-147 (2017).
- van de Graaf, P., Lees, A. K., Cullen, D. W., Duncan, J. M. Detection and Quantification of Spongospora subterranea in Soil, Water and Plant Tissue Samples Using Real-Time PCR. European Journal of Plant Pathology. 109 (6), 589-597 (2003).
- Maldonado, H., Falloon, R. E., Butler, R. C., Conner, A. J. Spongospora subterranea root infection assessed in two potato cultivars differing in susceptibility to tuber powdery scab. Plant Pathology. 62 (5), 1089-1096 (2013).
- Braid, M. D., Daniels, L. M., Kitts, C. L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. Journal of Microbiological Methods. 52 (3), 389-393 (2003).
- Lees, A. K., Cullen, D. W., Sullivan, L., Nicolson, M. J. Development of conventional and quantitative real-time PCR assays for the detection and identification of Rhizoctonia solani AG-3 in potato and soil. Plant Pathology. 51 (3), 293-302 (2002).
- Davey, T., Carnegie, S. F., Saddler, G. S., Mitchell, W. J. The importance of the infected seed tuber and soil inoculum in transmitting Potato mop-top virus to potato plants. Plant Pathol. 63 (1), 88-97 (2014).
- Boonham, N., et al. Methods in virus diagnostics: From ELISA to next generation sequencing. Virus Research. 186, 20-31 (2014).
- Mohan, S. B. Cross-reactivity of antiserum raised against Phytophthora fragariae with other Phytophthora species and its evaluation as a genus-detecting antiserum. Plant Pathology. 38 (3), 352-363 (1989).
- Ophel-Keller, K., McKay, A., Hartley, D., Curran Herdina, J. Development of a routine DNA-based testing service for soil-borne diseases in Australia. Austral Plant Pathol. 37 (3), 243-253 (2008).
- Woodhall, J. W., et al. A new large-scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil. Eur J Plant Pathol. 134 (3), 467-473 (2012).
- Miles, T. D., Martin, F. N., Coffey, M. D. Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp in Plant Tissue. Phytopathology. 105 (2), 265-278 (2014).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), e63-e63 (2000).
- Narayanasamy, P. Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules. , John Wiley & Sons. (2016).
- Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberhänsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis. Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).
